Efecto de diferentes plaguicidas sobre el crecimiento de Azotobacter chroococcum

Different pesticides’ effect on Azotobacter chroococcum growth

Diego Rivera¹ , Mauricio Camelo² , Germán Estrada³ , Melissa Obando⁴ , Ruth Bonilla⁵

¹Ingeniero de Producción Biotecnológico. Investigador Laboratorio Microbiología de Suelos, Centro de Biotecnología y Bioindustria CBB-Corpoica. drivera@corpoica.org.co
²Microbiólogo Industrial. Investigador Laboratorio Microbiología de Suelos, Centro de Biotecnología y Bioindustria CBB-Corpoica. mcamelo@corpoica.org.co
³Microbiólogo Industrial. Investigador Embrapa Agrobiología-Brasil. adiablillo@hotmail.com
⁴ Ingeniera de Producción Biotecnológica. Investigadora Laboratorio Microbiología de Suelos, Centro de Biotecnología y Bioindustria CBB-Corpoica. dobando@corpoica.org.co
⁵Ph.D. Ciencias Agrícolas. Líder Laboratorio Microbiología de Suelos, Centro de Biotecnología y Bioindustria CBB-Corpoica. rbonilla@corpoica.org.co

Recibido: septiembre 20 de 2009 Aprobado: junio 11 de 2010

Resumen

Se evaluó el efecto de diferentes agroquímicos cuyos principios activos se basan en Carboxin: 5,6-dihydro- 2-methyl-N-phenyL^-1,4-oxathiin-3 carboxamide; Tiram: tetramethylthioperoxydicarbonic diamide; Imidacloprid: (1-(6-cloro6-4-piridinil-metil)-N-nitroimidazolidin-2-ilideneamina); Cipermetrina: (1RS)-cis,trans-3-(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropano carboxilato de (RS)-ciano-3-Fenoxibencilo; Smetolachloro: (S)-2-cloro-N-(2-etil-6-metil-fenil)-N-(2-metoxi-1-metil-etil)-acetamida; Fluometuron: 1,1- dimetil-3(alfa, alfa, alfa-trifluoro-m-tolil) urea y Glifosato: (N-(fosfonometil) glicina) sobre la viabilidad del inoculante biológico Monibac® - Corpoica cuyo ingrediente activo es la bacteria diazotrófica no simbiótica Azotobacter chroococcum AC1, aplicando las técnicas de concentración mínima inhibitoria y de compatibilidad. Los resultados demostraron la susceptibilidad del microorganismo frente al insecticida cipermetrina al 50% y al ser mezclado con los demás plaguicidas en la dosis utilizada regularmente en campo. Se encontró que no hubo efectos significativos (P<0,05) en la aplicación de los plaguicidas (Carboxin, Thiram, Imidacloprid, S-metolachloro, Fluometuron y Glifosato) sobre A. chroococcum AC1, bajo las diferentes dosis evaluadas infiriendo que esta bacteria en condiciones de laboratorio es capaz de tolerar estas sustancias químicas mediante diferentes mecanismos fisiológicos sin afectar su crecimiento.

Palabras clave: Azotobacter chroococcum, agroquímicos, biofertilizante, inhibición.

Abstract

Minimum inhibitory concentration and compatibility techniques were used for evaluating the effect of agrochemicals whose active ingredients are based on carboxin (5,6-dihydro-2-methyl-N-phenyl- 1,4-oxathiin-3carboxamide), tiram (tetramethylthioperoxydicarbonic diamide), imidacloprid (1-(6-cloro6-4-pyridinyl-methyl)-N-nitroimidazolidin-2-ilideneamina), cypermethrin ((1RS)-cis, trans-3-(2.2- dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylate (RS)-cyano-3-phenoxybenzyl), S-metolachlor ((S)-2- chloro-N-(2-ethyl-6-methyl-phenyl)-N-(2-methoxy-1-methyl-ethyl)-acetamide), fluometuron (1,1-dimethyl-3 (alpha, alpha, alpha-trifluoro-m-tolyl)) urea and glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycine)) on the viability of Monibac (a biological inoculant/biofertiliser produced by CORPOICA, Colombia) whose active ingredient is based on Azotobacter chroococcum AC1 (a non-symbiotic diazotrophic bacteria). The results demonstrated the susceptibility of the organism to 50% cypermethryn when it was mixed with other pesticides in the ratio regularly used in the field. It was found that the pesticides (carboxin, thiram, imidacloprid, S-metolachlor, fluometuron and glyphosate) had no significant effects (P<0.05) at the different concentrations tested, suggesting that this bacterium is able to tolerate these chemicals by using different physiological mechanisms without affecting plant growth in the laboratory.

Key words: Azotobacter chroococcum, agrochemical, bacteria, biofertiliser, inhibition.

Introducción

La utilización de agroquímicos en los sistemas de producción intensivos tiene una clara acción sobre la microbiota del suelo, afectando directamente las numerosas poblaciones de microorganismos nativos de interés biológico expuestas a este tipo de sustancias. Como consecuencia de la retención de ciertos plaguicidas en las partículas del suelo, microorganismos benéficos, como muchas bacterias presentes en la mayoría de los sistemas agrícolas, pueden sufrir alteraciones bioquímicas, disminuyendo su actividad como biofertilizantes y su efecto promotor del crecimiento de las plantas (Paoletti, 1999).

Dentro de los diferentes plaguicidas empleados en el cultivo de algodón se encuentran los fungicidas, cuyos principios activos se basan en: (5,6-dihydro-2-methyl-N-phenyL^-1- ,4-oxathiin-3 carboxamide y tetramethylthioperoxydicarbonic diamide), los insecticidas: [(1-(6-cloro6-4-piridinil-metil)-N-nitroimidazolidin- 2-ilideneamina) y (1RS)-cis,trans-3-(2,2- diclorovinil)-2,2 dimetilciclopropano carboxilato de (RS)-ciano-3-Fenoxibencilo)], y los herbicidas: (S)-2-cloro-N-(2-etil-6-metil-fenil)-N-(2-metoxi- 1-metil-etil)-acetamida; 1,1-dimetil-3(alfa, alfa, alfa-trifluoro-m-tolil)urea y (N-(fosfonometil) glicina); siendo estos agroquímicos los que permiten eliminar, controlar y manejar diferentes plagas y malezas en este cultivo de importancia económica en Colombia. La actividad del plaguicida sobre la especie objetivo no es considerada un problema, debido a que en ésta se basa su eficacia y la razón de su utilización; sin embargo, los problemas derivan de la falta de selectividad debido a que en la liberación de estas sustancias la toxicidad se puede extender a otras especies no objetivo. Este posible efecto no intencional sobre otros organismos obliga a realizar valoraciones a modo de minimizar su impacto sobre estos organismos y los diferentes cambios ambientales ocasionados por su constante e indiscriminada utilización en el suelo.

Entre los grupos microbianos reportados como organismos degradadores de plaguicidas, muchas de las bacterias heterótrofas señaladas los utilizan como sustratos, ya sea metabolizando las moléculas o usándolas como nutriente y fuente de energía. Se incluyen en este grupo bacterias como: Azotobacter sp., Pseudomonas sp., Agrobacterium sp., Bacillus sp., Clostridium sp., Flavobacterium sp., entre otros (Madigan et al., 2004).

El papel de las bacterias en la biodegradación y transformación de los plaguicidas en el suelo es variable y depende de la disponibilidad, movilidad y toxicidad del plaguicida, las propiedades fisicoquímicas del suelo y del plaguicida, entre otros factores medioambientales (Racke, 1990).

Dentro de las bacterias diazotróficas, el género Azotobacter es uno de los más estudiados en la agricultura gracias a su alta capacidad de biodegradación, especialmente para la oxidación de compuestos fenólicos sustituidos (González y Lluch, 1992); este hecho resulta de especial interés debido a que estas bacterias aumentan su actividad biológica en suelos agrícolas adicionados de residuos que poseen un alto contenido en sustancias fenólicas, pudiéndose sugerir que estos microorganismos pueden contribuir a la biotransformación de este tipo de residuos cuando se usen como fertilizantes. En este contexto, estos diazótrofos son considerados por algunos investigadores como bacterias ciertamente ideales para los procesos de descontaminación de suelos agrícolas con sustancias xenobióticas (González y Lluch, 1992).

La presente investigación tuvo como objetivo evaluar, en condiciones de laboratorio, el grado de tolerancia de la bacteria Azotobacter chroococcum AC1, a la aplicación de diferentes agroquímicos empleados en el cultivo de algodón.

Materiales y métodos

Cepa de estudio. Se empleó la cepa A. chroococcum AC1, proveniente del Banco de microorganismos del Laboratorio de Microbiología de Suelos (CBB-Corpoica C.I. Tibaitatá), la cual fue aislada de cultivos de algodón, en la Estación Experimental Motilonia, Codazzi- Cesar (Bonilla y Morales, 2005).

Reactivación del inóculo. La cepa de A. chroococcum AC1, se reactivó en placas de medio de cultivo agrícola (g L^-1): K₂HPO₄*3H₂O, 2,4; MgSO₄*7H₂O, 0,1; Glucosa, 5; CaCl₂, 0,1; Extracto de Levadura, 5; MnSO₄, 0,1; FeSO₄*7H₂O, 0,1; (NH₄)2SO₄, 4; pH: 7,2), mediante siembra por agotamiento. Se incubaron a 30±2° C durante 48 horas, realizando tinción de Gram para confirmar la pureza de la cepa.

Estandarización del inóculo. Se realizó una suspensión celular al 10% en solución salina (NaCl 0,85%) de la cepa AC1 ajustada al tubo N° 5 de la escala de Mc. Farland; esta suspensión fue agregada al caldo agrícola y se incubó durante 48 h a 30±2 °C y 120 rpm. Posteriormente, se determinaron las unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL) de inóculo empleando diluciones seriadas desde 10^-2 hasta 10^-8 y recuento en placa por la técnica de microgota (Doyle et al., 2000) después de 48 h de incubación a 30±2 °C.

Determinación de la viabilidad celular. La concentración celular (UFC/mL) fue determinada por medio de la técnica de recuento en placa sobre medio agrícola, realizando diluciones seriadas en base diez desde 10-2 hasta 10-8. El tiempo de incubación fue de 48 h.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria de Carboxin, Thiram, Imidacloprid, Cipermetrina, S-metolachloro, Fluometuron y Glifosato. Se utilizó la técnica de difusión en agar, colocando la concentración comercial aplicada en campo de cada uno de los plaguicidas y la mezcla de todos; además, se evaluó una concentración inferior y superior de la normalmente utilizada mediante el uso de pozos sobre el medio de cultivo agrícola, y se empleó agua destilada estéril como control (Durán, 1996). Así mismo, se evaluó la formación de zonas de aclaramiento alrededor de los pitillos para analizar cualitativa y cuantitativamente los halos de inhibición sobre el crecimiento de la cepa de A. chroococcum AC1. Los experimentos fueron realizados por triplicado.

Compatibilidad de los plaguicidas con el medio Agrícola. Para esta prueba se combinaron diferentes concentraciones (bajamedia- alta) de los plaguicidas individualmente y la mezcla de todos (Tabla 1); posteriormente, se realizó la inoculación con la cepa de A. chroococcum AC1, multiplicada en medio agrícola; se tuvo en cuenta la solubilidad de los plaguicidas para realizar una óptima difusión acatando en el proceso las recomendaciones impartidas por cada casa comercial de los agroquímicos. Con el fin de determinar las células viables después de 0 h y 12 h de incubación a 30±2° C, se realizó el recuento en placa de UFC/mL del inóculo empleando diluciones seriadas desde 10^-2 hasta 10^-8 y recuento en placa por la técnica de microgota (Doyle et al., 2000). Los experimentos fueron realizados por triplicado.

Análisis estadístico. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza y comparación de medias por el Test de Duncan al 5% de probabilidad usando el paquete estadístico SPSS, Versión 17.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria de Carboxin, Thiram, Imidacloprid, Cipermetrina, S-metolachloro, Fluometuron y Glifosato (recomendaciones impartidas por cada empresa que comercializa los agroquímicos). Al emplear los dos fungicidas con principios activos basados principalmente en dos compuestos como Carboxim y Thiram bajo una concentración de 10%, 20% y 30% y de 5%, 10% y 15% respectivamente, se observó la formación de pequeños halos de inhibición (zonas de aclaramiento) alrededor de la bacteria A. chroococcum AC1, inoculada en los pozos del medio de cultivo, lo cual manifiesta de forma cualitativa el efecto causado por estos tipos de fungicidas sobre la viabilidad del microorganismo; sin embargo, este resultado no representa un valor estadísticamente significativo debido a que el halo de inhibición no presentó un campo de influencia representativo en las distintas dosis utilizadas que pudieran haber afectado la multiplicación del microorganismo (figura 1).

Los resultados obtenidos por separado de halos de inhibición en las concentraciones utilizadas (Tabla 1) de los fungicidas 1 y 2 no sobrepasan los 5 y 6 mm de espesor, respectivamente; además, el crecimiento de A. chroococcum AC1 es óptimo dentro del área de la placa. La concentración del fungicida 2 al 10% presentó el mayor halo de inhibición seguido por el fungicida 1 al 30% pero sin ejercer un efecto significativo (P<0,05) sobre la viabilidad de la bacteria.

El medio de cultivo presentó un cambio de color, el cual se puede atribuir a la difusión de los agroquímicos en el medio de cultivo sintético, y posiblemente no es un efecto ocasionado por cada uno de ellos.

Por otra parte, la evaluación individual de los insecticidas Imidacloprid (10%, 20% y 30%) y Cipermetrina (40%, 50% y 60%) no presentaron ningún efecto significativo (P<0,05) sobre la viabilidad de A. chroococcum AC1 en las diferentes concentraciones utilizadas, lo cual permitió un óptimo desarrollo del microorganismo; sin embargo, se procedió a ratificar estos resultados utilizando la metodología de compatibilidad.

Las evaluaciones individuales o en conjunto de los herbicidas S-metolachloro, Fluometuron y Glifosato no mostraron un efecto negativo sobre la viabilidad de A. chroococcum AC1. Este resultado es importante debido a que normalmente en campo se utilizan estos tres herbicidas simultáneamente como sellantes en estados de preemergencia de la semilla de algodón, presentando un crecimiento adecuado de la bacteria sin ningún índice de inhibición en las diferentes concentraciones aplicadas, lo cual permite el uso del biofertilizante sin restricciones.

La mezcla de los herbicidas, fungicidas e insecticidas en la concentración aplicada normalmente en campo dió como resultado un efecto inhibitorio significativo (P<0,05) sobre la viabilidad de A. chroococcum AC1, siendo ésta combinación muy posiblemente la que ocasionó un mayor efecto sobre el crecimiento de la bacteria en comparación con los plaguicidas utilizados individualmente (figura 2).

De acuerdo con ello, se podría pensar que los plaguicidas utilizados pudieron tener dificultad para difundirse en el agar en la prueba de Gauze por varios factores de interacción, así como por porosidad, procesos de adsorción, naturaleza del compuesto químico, solubilidad, viscosidad, reactividad química, componentes del medio agrícola, entre otros García y Ordoñez (2003); por esta razón, al entrar en contacto con A. chroococcum AC1, no se reflejó claramente un descenso en la biomasa del microorganismo. Además, es posible que durante el periodo de incubación los plaguicidas presentaran evaporación por la exposición continua a una temperatura de 30 ± 2° C al cabo de 48 horas, y su efecto sobre el crecimiento no fuera determinado.

Compatibilidad de los plaguicidas en el medio agrícola. Los resultados obtenidos demostraron el efecto causado en los dos tiempos de contacto de los plaguicidas sobre la bacteria A. chroococcum AC1. Cuando se utilizó el fungicida 1 al 20% de concentración sobre A. chroococcum AC1, el resultado demostró una disminución de la concentración celular durante las doce horas de contacto, obteniendo a la hora cero una concentración celular de 6 x 10⁹ UFC/mL y a las doce horas una concentración de 6 x 10⁸ UFC/mL; el efecto de este plaguicida produjo un descenso celular en una unidad logarítmica (figura 3); sin embargo, se podría inferir que el efecto inhibitorio del plaguicida sobre A. chroococcum AC1 no es tan relevante debido a que el microorganismo durante este tiempo pudo tolerarlo sin afectar completamente su biomasa; este resultado es similar al obtenido utilizando la metodología de Gauze, lo que confirma la resistencia del microorganismo al aplicar este agroquímico.

Al utilizar el fungicida 2 al 10%, se observó que durante las primeras horas de contacto el microorganismo no sufre un descenso en su viabilidad de forma significativa; mientras que, a las doce horas de contacto, la bacteria disminuye su concentración celular en una unidad logarítmica lo cual es muy similar al resultado obtenido con el fungicida 1 permitiendo inferir que probablemente los ingredientes activos presentes en estos dos fungicidas son los responsables de generar un efecto negativo mínimo en la concentración celular de A. chroococcum AC1, en el caldo agrícola (figura 3).

Al adicionar S-metolachlor (0,75%) en contacto con A. chroococcum AC1, a la hora cero se reporta una concentración celular de 9 x 107 UFC/mL, lo cual demuestra que en este tiempo el microorganismo sufre un descenso de dos unidades logarítmicas en la concentración en comparación con el recuento inicial; sin embargo, la biomasa de A. chroococcum AC1, es constante a lo largo de las doce horas, permitiendo inferir la adaptación o posible resistencia de este microorganismo al herbicida en contacto sin ocasionar un efecto drástico sobre la viabilidad de la bacteria (figura 3). Este resultado es similar al reportado por González-López et al. (1999), quienes afirman que al agregar S-metolachlor en una dosis entre 5-50 µg/mL A. chroococcum no sufre un efecto negativo significativo en su concentración, sin causar alteraciones en la producción de aminoácidos por este microorganismo.

Estudios realizados por González-López et al. (1999) registraron la influencia de herbicidas tales como: alachlor, 2,4-D, 2,4,5-T y 2,3,6- TBA alrededor del 95% sobre la inhibición de A. chroococcum, afectando la producción de aminoácidos y su actividad biológica.

Por otra parte, los agroquímicos Imidacloprid, Fluometurom y Glifosato no influyeron en la viabilidad de A. chroococcum AC1, en los dos tiempos de contacto evaluados, manteniendo una óptima concentración del microorganismo bajo la dosis aplicada en campo (figura 3).

El Glifosato, tanto en el ensayo de Gauze como en la evaluación de la compatibilidad con el medio agrícola al emplear diferentes dosis (0,5%, 1% y 1,5%), presentó un crecimiento masivo sin afectar la biomasa de la bacteria. Estos resultados son similares a los reportados por Giesy et al. (2000), que registran un bajo efecto del Glifosato sobre la población de los microorganismos del suelo. Por otra parte, la molécula del plaguicida no permanece intacta por tiempo indefinido en el medioambiente, debido a que con el tiempo sufre una degradación influenciada por microorganismos, actividad química, pH, temperatura y contenido de materia orgánica del suelo, entre otros (Giesy et al., 2000). De acuerdo con lo anterior, se podría pensar que existe la posibilidad de que el herbicida fue degradado por A. chroococcum AC1, sin causar ningún efecto inhibitorio sobre su crecimiento, lo cual confirmaría los resultados obtenidos por Santos y Flores (1995), sobre el posible efecto del Glifosato en el crecimiento, la respiración y la fijación de nitrógeno de A. chroococcum y A. vinelandii siendo demostrado el efecto tóxico en A. vinelandii; mientras que no hubo efecto en la tasa de crecimiento de A. chroococcum al utilizar altas dosis de este herbicida (20 kg ha^-1 y 28 kg ha^-1 de Glifosato) se produjo un efecto significativo sobre A. vinelandii y A. chroococcum, afectando la respiración en 60% y la fijación biológica de nitrógeno en el orden del 80% y 98%, respectivamente; por esta razón, la dosis manejada en el presente estudio (1 kg ha^-1), permitió garantizar que el Glifosato no produjera ningún efecto sobre la viabilidad de la bacteria, la cual corresponde a la dosis aplicada en los cultivos de algodón.

Los resultados revelan que cuando se utilizó el insecticida con base en Imidacloprid, estaría indirectamente favorecido por el aporte de nutrientes resultante de la degradación de este compuesto, los cuales podrían ser utilizados como fuente de energía por el microorganismo (Tu, 1995). El resultado demostró que al realizar la metodología de compatibilidad en medio agrícola no se obtuvo descenso en la concentración celular, por lo cual se podría pensar muy posiblemente que este compuesto químico no afecta la biomasa del microorganismo revalidando los resultados obtenidos anteriormente.

La Cipermetrina demostró un efecto inhibitorio sobre la concentración celular de A. chroococcum AC1, a la hora cero 70 x 10⁵ UFC/mL utilizando dosis al 40%, 50% y 60%. No obstante, a las doce horas de haber agregado este insecticida, la concentración celular del microorganismo presentó un ascenso en una unidad logarítmica, debido posiblemente a la degradación de este compuesto por A. chroococcum AC1. La Cipermetrina presentó influencia negativa sobre la biomasa de este microorganismo en el momento de ser agregada (figura 3).

La mezcla 1 de los agroquímicos (fungi cidas+insecticidas+herbicidas) en las dosis aplicadas en campo presenta, a la hora cero de contacto, un efecto inhibitorio significativo de los agroquímicos en su conjunto sobre A. chroococcum AC1, lo que permite inferir que posiblemente existe sinergia de todos o algunos de los componentes agregados en la mezcla con Cipermetrina generando un efecto que al cabo del tiempo impide el desarrollo normal del microorganismo (figura 3).

Debido a que la Cipermetrina presentó un efecto negativo individualmente sobre A. chroococcum AC1, a la hora de contacto, disminuyendo en cuatro unidades logarítmicas la viabilidad del microorganismo, se procedió a evaluar una nueva mezcla sin la adición de Cipermetrina (mezcla 2), la cual presentó a las doce horas de contacto un efecto mínimo sobre la viabilidad del microorganismo; este resultado permitió establecer que no hubo un efecto significativo (P<0,05) sobre A. chroococcum AC1, cuando no se agregó la Cipermetrina (figura 3).

Los resultados revelan que A. chroococcum AC1 es susceptible al contacto con el insecticida Cipermetrina en la dosis normalmente aplicada en campo, tanto de forma individual o en mezcla de los agroquímicos, induciendo de esta manera a los demás plaguicidas a una expresión más fuerte a través del tiempo (figura 3). Contrario a este resultado, al utilizar la metodología de Gauze (concentración mínima inhibitoria) no se presentó inhibición de A. chroococcum AC1 por parte de la Cipermetrina, lo cual posiblemente se puede atribuir al proceso de precipitación en el medio sólido evitando que se pudiese observar la respuesta de dicho plaguicida frente al microorganismo, en comparación con el medio líquido donde fue visible el efecto.

Conclusiones

El efecto de compatibilidad de la bacteria con los herbicidas (S-metolachloro y Fluometuron) demostró que A. chroococcum AC1, puede ser usado con los plaguicidas conjuntamente, sin alterar su concentración.

La utilización de la Cipermetrina sola, o en mezcla con los otros agroquímicos, causa un descenso drástico sobre la población de A. chroococcum AC1.

Carboxim, Thiram, Imidacloprid individuales o en mezcla, sin Cipermetrina, no afectan significativamente el crecimiento de A. chroococcum AC1.

Este estudio preliminar contribuye a la comprensión de los efectos de agroquímicos sobre Azotobacter chroococcum AC1 in vitro, por lo que se sugiere adelantar investigaciones más profundas en la búsqueda de microorganismos con potencial de degradación de sustancias químicas en el suelo y su uso compatible en cultivos de interés agrícola.

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos a la Estación Experimental Motilonia y al Centro de Biotecnología y Bioindustria CBBCorpoica.

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