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Revista Colombiana de Biotecnología

versão impressa ISSN 0123-3475

Rev. colomb. biotecnol vol.16 no.2 Bogotá jul./dez. 2014

https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n2.41663 

http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n2.41663

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Caracterización morfológica, biológica y genética de un aislamiento Colombiano de granulovirus de Erinnyis ello (L.) (Lepidoptera: Sphingidae)

Characterization of a Colombian isolate of Erinnyis ello granulovirus (L.) (Lepidoptera: Sphingidae)

Gloria Barrera1, Juliana Gómez2, Paola Cuartas2, Guillermo León3, Laura Villamizar4
1 Ph.D. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. gbarrera@corpoica.org.co. (Autor para correspondencia).
2 Microbiólogo. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. jagomez@corpoica.org.co. pcuartas@corpoica.org.co.
3 Ph.D. (c). Corpoica. Km 17 Vía Puerto López, Meta. Colombia. gleon@corpoica.org.co
4 Ph.D. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. lvillamizar@corpoica.org.co.


Recibido: enero 24 de 2014 Aprobado: octubre 26 de 2014


Resumen

El gusano cachón Erinnyis ello (L.) es una plaga polífaga que puede causar graves pérdidas en cultivos de caucho. El uso de granulovirus representa una alternativa interesante para el control biológico de este insecto. Tres aislamientos colombianos del granulovirus de E. ello (EeGV) recuperados en larvas de campo, fueron caracterizados morfológica y molecularmente. Los cuerpos de inclusión de los tres aislamientos presentaron forma ovoide con una única nucleocápside, con tamaño promedio de 302,9 ± 22 x 181,5 ± 16 nm. El análisis de los perfiles de restricción con diferentes endonucleasas no mostró diferencias entre los tres aislamientos, lo cual sugiere que son muestras de la misma cepa viral, denominada VG010, cuyo tamaño del genoma se estimó en 88,7 Kb. El análisis de las relaciones filogenéticas basado en las secuencias de lef-8, lef-9 y gran mostró con alta consistencia la estrecha relación entre VG010 y un aislamiento de EeGV (M34-4) previamente descrito, lo cual sugiere que son variantes genotípicas de la misma especie viral. La eficacia del aislamiento VG010 en condiciones de laboratorio sobre larvas de segundo y cuarto estadio fue de 100 % y 64 % respectivamente, mientras que la concentración letal media (CL50) fue 4,3 x 103 CI/mL. La productividad viral, osciló entre 2,1 x 109 y 3,8 x 109 CI/gramo de larva. Estos resultados representan la base para el desarrollo de un nuevo bioinsecticida para el control de la plaga en campo.

Palabras clave: gusano cachón, baculovirus, control biológico, filogenia.

Abstract

Erinnyis ello (L.) is a polyphagous lepidopteran pest that may cause serious annual losses in the rubber industry. The use of granulovirus represents an interesting alternative as a biological control agent for this insect. Three Colombian isolates of granulovirus for E. ello (EeGV) were obtained from field larvae and characterized at morphological, biological and molecular level. Occlusion bodies (OB) of the three isolates showed an oval morphology with a unique nucleocapsid, with a size of 302.9 ± 22 x 181.5 ± 16 nm. Analysis of DNA endonuclease restriction profiles did not showed differences among the three viral isolates, which means that they correspond to samples of the same viral strain, denominated VG010. The VG010 viral genome size was estimated to be approximately 88.7 kb. The analysis of the phylogenetic relationships based on selected gene sequences lef-8, lef-9 and gran showed a close relationship between VG010 and the previously described isolate EeGV (M34-4). These sequence similarities suggest that the three isolates are genotypic variants of the same viral species. The in vitro efficacy of the VG010 isolate against second and fourth instar larvae was 100 and 64%, respectively, while the mean lethal concentration (LC50) was 4,3 x 103 OB/mL. The viral productivity ranged between 2.1 x 109 and 3.8 x 109 OB/g of larvae. These results represent the basis to develop a new biopesticide control agent for the pest in the field.

Key words: hornworm, baculovirus, biological control, biopesticide.


Introducción

Erinnys ello (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Sphingidae) es una plaga polífaga con amplia distribución en zonas tropicales y subtropicales de América desde el sureste de Brasil, Argentina y Paraguay hasta el sureste de Estados Unidos (Bellotti et al., 1999). Esta especie posee un amplio rango de hospederos con descripciones en más de 35 plantas diferentes, los cuales incluyen cultivos con importancia económica como tomate, tabaco y algodón, siendo muy frecuentes los ataques a plantaciones de yuca y caucho (Winder, 1976).

En caucho, las larvas de E. ello también conocido como gusano cachón, se alimentan inicialmente de las hojas más jóvenes de las plantas y en casos severos de infestación pasan a hojas de mayor edad, causando defoliaciones totales con reducción en la producción de látex. El impacto económico negativo que puede causar la plaga en el cultivo de caucho en Colombia es de gran relevancia, teniendo en cuenta que se encuentra dentro de la apuesta exportadora del país y que sus áreas cultivadas se han incrementado vertiginosamente durante los últimos 10 años. Aproximadamente 40 enemigos naturales de E. ello han sido identificados incluyendo parasitoides de huevos y larvas, depredadores en huevos, larvas y pupas, además de hongos, bacterias y virus. Sin embargo, debido al comportamiento migratorio de los adultos, la abundancia de enemigos naturales no previene las explosiones periódicas de la plaga (Bellotti et al., 1992).

Entre los organismos entomopatógenos que afectan este insecto, se encuentra el Granulovirus de E. ello (EeGV), el cual presenta alta especificidad y virulencia. El virus EeGV pertenece a la familia Baculoviridae, que incluye el género Betabaculovirus, (ICTV, 2012) correspondientes a granulovirus que infectan insectos del orden Lepidoptera. Su ADN es circular de doble cadena, cuyo tamaño se encuentra entre 99 y 178 Kb. Los granulovirus se caracterizan por formar cuerpos de inclusión (CI) proteicos con forma de gránulo y generalmente, un único virión ocluido, lo cual lo protege de las condiciones medioambientales, favoreciendo la transmisión horizontal del virus (Rohrmann, 2010).

La diversidad de los granulovirus ha sido ampliamente estudiada, principalmente en virus que infectan insectos plaga de cultivos agrícolas de importancia económica. Existen varios reportes acerca del análisis con endonucleasas de restricción (REN) de diversos granulovirus y en la actualidad 15 especies tienen secuenciado su genoma completo. El perfil REN es una metodología sencilla, ampliamente utilizada para diferenciar cepas o aislamientos geográficos de Baculovirus (Barrera et al., 2011; Berretta et al., 1998; Escribano et al., 1999), los cuales a pesar de ser de la misma especie pueden variar su perfil REN por mutaciones puntuales o pequeñas inserciones o deleciones (Erlandson, 2009). Estas diferencias a nivel genómico frecuentemente influyen en la patogenicidad y la virulencia de los diferentes aislamientos (Cory and Myers, 2003; Erlandson et al., 2007).

Varios aislamientos de EeGV provenientes de cultivos de yuca se han utilizado para el control de E. ello en Brasil, Colombia y Venezuela, con eficacias superiores al 90% (Schmitt, 1988). El análisis molecular de un aislamiento colombiano de EeGV demostró diferencias con respecto a otros granulovirus aislados de diferentes especies de insectos (Finnerty et al., 2000) y el análisis REN de diferentes aislamientos de EeGV en una región geográfica de Brasil demostró la presencia de genotipos distintos en diferentes períodos de tiempo (Costa et al., 2005). El objetivo del presente estudio fue caracterizar tres aislamientos colombianos de EeGV, como base para el posible desarrollo de un bioinsecticida para el control del gusano cachón en Colombia.

Materiales y métodos

Cría de insectos de E. ello
La cría de larvas de E. ello se estableció en condiciones controladas en el Centro de Investigación La Libertad, de Corpoica (Villavicencio, Colombia), utilizando follaje de yuca como fuente de alimentación. En el interior de una casa de malla, se establecieron tres módulos de anjeo de 2m x 3m x 2m, dentro de los cuales se sembraron plantas de yuca en diferentes épocas del año. Se colectaron huevos de E. ello en campo y se mantuvieron en cajas plásticas hasta su eclosión. Las larvas neonatas se ubicaron en recipientes plásticos dotados de la fuente alimenticia y se mantuvieron hasta que alcanzaron el segundo estadio bajo condiciones de laboratorio (28 °C y Humedad relativa 75 %). Para completar las fases siguientes de desarrollo del insecto, las larvas se ubicaron sobre las plantas de yuca mantenidas en casa de malla. Las pupas formadas se colectaron en cajas plásticas con aserrín, hasta la emergencia de los adultos, los cuales se confinaron en los módulos de anjeo con plantas de yuca para cumplir en ellas sus etapas de cópula y oviposición.

Propagación y purificación viral

Tres aislamientos virales se multiplicaron en larvas de tercer estadio (L3) de E. ello. Para tal fin, se inocularon 10 hojas de yuca mediante la aspersión de 10 mL de una suspensión viral ajustada a 1 x 107 CI/mL. Cada hoja se introdujo en un frasco de vidrio y se infestó con 10 larvas sanas de E. ello provenientes de la colonia en laboratorio, los cuales se incubaron a 28 °C y Humedad relativa 75 %. Diariamente se recolectaron las larvas muertas en cada tratamiento, se codificaron y se procedió a la extracción de los CIs. Para la purificación de los CIs, las larvas muertas por granulovirus se homogenizaron con agua destilada en proporción 1:1 (1 mL de agua por cada gramo de larva) y la mezcla obtenida se filtró a través de una muselina para retirar restos de tejido del insecto. Los CIs se purificaron siguiendo la metodología descrita por Caballero et al. (1992) y se resuspendieron en agua ultrapura, para su posterior cuantificación por espectrofotometría con extrapolación del resultado en una curva de calibración previamente estandarizada.

Caracterización morfológica

Para la caracterización morfológica, los tres aislamientos de EeGV fueron procesados para su observación bajo el microscopio electrónico de transmisión. Se fijaron 100 μL de suspensión viral con igual volumen de fijador (formaldehido 4 %, glutaraldehído 1 % en tampón fosfato pH 7,4). Las muestras se colocaron en rejillas de cobre recubiertas con resina Fomvar y se realizó una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 2 % para su observación en un microscopio electrónico Philips CM10. El tamaño de los cuerpos de inclusión se determinó mediante el programa NIS-elements (Nikon).

Caracterización molecular

Para la extracción de ADN viral se tomó una suspensión purificada de CIs (1 x 108 CIs/mL) a la cual se añadió 2,5 vol. de agua, 1 vol. de Na2CO3 (0,5 M, pH 7,2) y 0,5 vol. de SDS (10 %) y se incubó durante 10 min. a 60°C. La muestra se centrifugó a 2500 g durante 5 min. y se recogió el sobrenadante que contenía los viriones. Se añadieron 50 μL de proteinasa K (10 mg/ mL) y se incubó durante 30 min. a 50°C. La extracción del ADN se realizó mediante dos pases con fenolcloroformo y la posterior precipitación con etanol. El ADN precipitado se resuspendió en 200 μL de tampón TE 0,1x (Tris-EDTA) y el ADN se cuantificó mediante espectrofotometría.

Para realizar los perfiles de restricción, se utilizaron 2μg de ADN viral para la digestión con las enzimas PstI, BamHI, HindIII, EcoRI, BglII y KpnI (Takara, Shiga, Japan) durante 4-12 horas a 37 °C Las reacciones se mezclaron con tampón de carga (azul de bromofenol 0,25% p/v, sacarosa 40% p/v) y se cargaron en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE (Tris–acetato 0,04 M y EDTA 0,001 M). La electroforesis se realizó a 20 Voltios durante 12 horas. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en luz UV (Chemi- Doc, BioRad, California, USA). Para el análisis de los tamaños de los fragmentos generados se utilizó el programa QuantityOne versión 4.2.1 de Biorad.

Amplificación y secuenciación genes gran, lef-8 y lef-9

Se amplificaron fragmentos parciales de los genes gran, lef-8 y lef-9 utilizando parejas de cebadores degenerados. Para el gen gran se utilizaron los cebadores directo Gran-F (5'-ATGGGATAYAAYAAAWCDYT-3') y reverso Gran-R (5'-TYARTANGCBGGDCCVGTRAA-3') (Barrera et al., 2009). Para lef-8 se utilizaron los cebadores prL8-1 (5'-CAGGAAACAGCTATGACCCAYGGHGARATGAC -3') y prL8-2 (5'-CAGGAAACAGCTATGACCAYRTASGGRTCYTCSGC- 3'), para lef-9 se utilizaron los cebadores prL9-1 (5'- CAGGAAACAGCTATGACCAARAAYGGITAYGCBG- 3') y prL9-2 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTTGTCDCCRTCRCARTC- 3) (Jehle et al., 2006).

El programa de amplificación por PCR consistió de un ciclo inicial de denaturación a 95°C por 4 min y 35 ciclos así: 95 °C por 30 seg, anillamiento a 52 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 90 seg. Se realizó un paso final de extensión a 72 °C por 10 min. Cada 25 μl de reacción de PCR contenían 50-100 ng de ADN genómico, dNTPs 200 μM, 0,5 μM de cada cebador, MgCl2 2,0 mM y tampón 10X (50 mMKCl, 10 mM Tris HCl, pH 9.0, 0.1% Nonidet). La reacción se llevó a cabo con 2U de Taq polimerasa (Promega M1665). Se verificó cada producto de amplificación mediante gel de agarosa al 1% teñido con SYBR-safe (Invitrogen). Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados directamente para las dos hebras.

Análisis filogenético

Las secuencias parciales de nucleótidos de los tres genes secuenciados (gran, lef-8 y lef-9) se alinearon independientemente con secuencias homólogas de 26 granulovirus depositadas en el Genbank, mediante el programa CLUSTAL W (Larkin et al., 2007). Los alineamientos de las secuencias se concatenaron y analizaron mediante el programa MEGA versión 4 (Tamura et al., 2011). Para el cálculo de la distancia genética se utilizó el modelo de substitución nucleotídica Kimura- 2 parámetros(Tamura et al., 2011). Se construyó un fenograma de relaciones filogenéticas basado en las secuencias peptídicas concatenadas de los tres genes secuenciados.

Perfil de proteínas SDS-PAGE

Se tomaron 7 μL de viriones de una suspensión de 109 CIs/mL y se mezclaron con 5 μL de tampón de carga (Tris-HCl 125 mM; SDS 2 %; pH 6,2; glicerol 10 %; azul de bromofenol 0,004 % y 2-mercaptoetanol 5 %). La mezcla se calentó hasta ebullición durante tres minutos. Posteriormente, las muestras se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (gradiente 10- 12 %), corrido a 80 v durante 4 h. La tinción de las bandas de proteínas se realizó con azul brillante de Commassie 0,1 % (Laemmli, 1970).

Caracterización biológica

Se determinó la patogenicidad en términos de concentración letal media del aislamiento VG010 mediante un bioensayo en laboratorio. A partir de virus purificado se prepararon suspensiones ajustadas a cinco concentraciones desde 2 x 104 hasta 2 x 108 CI/mL, empleando una curva de calibración estandarizada previamente (Datos no mostrados). Se tomaron 200 μL de cada suspensión y se mezclaron con 200 μL de una solución de sacarosa al 4% con un colorante azul de alimentos Tuska ® (Azul No. 1 y Azul No. 2) al 1%. Con cada concentración se inocularon 24 larvas neonatas de E. ello colocadas previamente en una copa plástica de 2 onzas siguiendo el método de la gota descrito previamente por Hughes y Wood (1981).

Para la inoculación de los insectos, se dispensaron gotas de 2 μL dentro de cada copa y se esperó hasta que la larva bebió la suspensión de virus, lo que se evidenció por la coloración azul en el cuerpo de la larva como consecuencia de la ingestión del tratamiento (virus + solución colorante). Una vez se observó la coloración azul en el cuerpo de las larvas, se alimentaron con un fragmento de hoja de yuca previamente desinfectada (NaClO al 0,5%). Se contó con un testigo absoluto correspondiente a larvas neonatas alimentadas con dieta natural sin aplicar ningún tratamiento. Las larvas se mantuvieron bajo condiciones controladas de laboratorio (28 °C y 75 % HR). La mortalidad de las larvas se registró a los siete días después del montaje del bioensayo. Las larvas muertas se recolectaron y almacenaron a -20 °C. El diseño experimental fue completamente al azar y con cuatro repeticiones por tratamiento, cada una compuesta por 6 larvas. Los resultados de mortalidad fueron sometidos a un análisis Probit (Finney, 1952) mediante el programa BioStat (2007) para la determinación de la concentración letal media (CL50) y noventa (CL90).

Se determinó la productividad del aislamiento VG010, como el promedio de CIs producidos por gramo de peso larval. Para tal fin, se tomaron hojas de yuca y se asperjaron con una suspensión viral ajustada a 7,2 x 107 CIs/mL, utilizando un volumen de 1 mL por hoja. Las hojas inoculadas fueron dispuestas en recipientes plásticos de 4 L y se infestaron con 30 larvas de E. ello de tercer estadio provenientes de la cría. Los recipientes se incubaron bajo condiciones controladas de humedad (75 %) y temperatura (28 °C). Cada larva muerta por infección viral fue pesada individualmente, macerada y diluida en un volumen de agua estéril conocido. Las suspensiones virales se pasaron por una capa de muselina para retirar los restos de tejido larval. A partir del filtrado obtenido se realizaron diluciones para su cuantificación a 280 nm, con un espectrofotómetro Nanodrop®. La concentración viral se estimó por extrapolación de las mediciones en una curva de calibración previamente estandarizada.

Se determinó la eficacia de VG010 bajo condiciones de laboratorio, en larvas de segundo (L2) y cuarto estadio (L4). Cinco hojas de yuca, previamente asperjadas con una suspensión de VG010 (7.2 x 107 CIs/mL) se colocaron en un recipiente de vidrio y se infestaron con 10 larvas, lo cual se tomó como unidad experimental. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento. Se contó con un tratamiento control consistente en larvas alimentadas con hojas sin inocular. La evaluación de mortalidad se realizó 3 y 5 días después de la inoculación. La mortalidad en los tratamientos fue corregida con respecto al testigo mediante el cálculo del porcentaje de eficacia utilizando la fórmula de Schneider-Orelli (Schneider-Orelli, 1947).

Eficacia= ((A-B)/(100-B)) x 100

donde, A es la mortalidad larval obtenida en el tratamiento y B es la mortalidad obtenida en el control negativo.La eficacia en campo se determinó en una plantación comercial de caucho (MAVALLE S.A), en un área de 16,4 ha y con presencia de larvas de E. ello entre primer y tercer estadío. Se asperjaron 2.9 x1 07 CIs/ ha del aislamiento viral VG010, suspendidos en 250 L de agua, mediante una pulverizadora Jacto AJ-401LH. El diseño fue completamente al azar y cada unidad experimental consistió en 4 surcos, cada uno con 50 árboles, de los cuales se escogieron 20 árboles al azar con presencia de larvas para hacer los muestreos. De los 20 árboles por repetición, 18 se evaluaron en el tercio medio del árbol y 2 en el tercio superior, contabilizando la población natural de larvas vivas antes de la aplicación. Posteriormente se contabilizó el número de larvas vivas y el número de larvas muertas con sintomatología viral, 1, 3 y 5 días después de la aplicación. El tratamiento control se realizó sobre un área de 2 ha, en la cual no se aplicó virus. Los resultados fueron transformados mediante la fórmula Henderson y Tilton (1955) para el cálculo de la eficacia.

Resultados y discusión

Caracterización morfológica

Los cuerpos de inclusión presentaron forma típica de gránulo con un único virión interno. El tamaño de los gránulos fue de 302,9 ± 22 x 181,5 ± 16 nm sin presentarse diferencias significativas entre los tres aislamientos de EeGV analizados (P>0,05). La morfología y el tamaño coincide con lo observado por Finnerty y colaboradores (2000) en un aislamiento colombiano recuperado en plantas de yuca (figura 1)

Caracterización molecular

Los perfiles de restricción de los tres aislamientos de granulovirus de E. ello fueron similares, sin diferencias evidentes en el tamaño y número de bandas generados, por lo cual se consideraron pertenecientes a la misma cepa viral, la cual se denominó VG010. Los perfiles de restricción con diferentes enzimas mostraron entre 6 y 16 fragmentos de diferente tamaño, los cuales se designaron alfabéticamente asignando la letra A a los de mayor tamaño para cada endonucleasa (figura 2; tabla 1). Los fragmentos con migración similar se detectaron por la intensidad de la banda generada y se encontraron en los perfiles generados con PstI (A-B y C-D), HindIII (A-B), BglII (A-B y E-F) y EcoRI (C-D).

De acuerdo con lo anterior se calculó el tamaño del genoma total de aproximadamente 88,7 Kb, el cual es pequeño, comparado con los tamaños de los betabaculovirus secuenciados a la fecha y similar al estimado por perfiles REN para otro aislamiento de granulovirus de E. ello proveniente de Colombia (Finnerty et al., 2000). Las diferencias entre el aislamiento VG010 y el aislamiento previamente publicado se presentaron en el número y tamaño de bandas generadas con las enzimas KpnI, EcoRI y HindIII, lo que sugiere que se trata de variantes genotípicas de la misma especie viral. Trabajos previos con perfiles de restricción en baculovirus han servido para determinar la diversidad genética entre aislamientos de la misma especie que provienen de diferentes regiones geográficas e inclusive para determinar la variedad genotípica en aislamientos de un solo individuo hospedero (Barrera et al., 2011; Rowley et al., 2010). La diversidad genética observada entre los aislamientos de EeGV puede ser resultado de procesos de recombinación en eventos de infección múltiple o podría ser resultado de la deriva genética por mutaciones durante el ciclo infeccioso y puede ser la fuente para la selección natural, debido a que los cambios en el genoma producen cambios en patogenicidad y virulencia (Erlandson, 2009).

Para analizar las relaciones filogenéticas del aislamiento VG010 se secuenciaron regiones de tres genes altamente conservados en baculovirus, gran, lef-8 y lef-9 (Jehle et al., 2006). El tamaño de la secuencia obtenida para el gen gran fue de 735pb, representando el 100% del gen, mientras que los fragmentos secuenciados de lef-8 y lef-9 fueron de 785 y 311 pb respectivamente, similares al tamaño de los fragmentos obtenidos con los mismos cebadores en otros granulovirus (Jehle et al., 2006).

Las principales diferencias entre los aislamientos de granulovirus de E. ello M34-4 (Jehle et al., 2006) y VG010 se encontraron en la secuencia del gen lef-8, donde se observaron 11 substituciones no sinónimas. El gen gran presentó un alto grado de conservación entre los dos aislamientos, con sólo tres substituciones sinónimas presentes. Debido a su alto grado de conservación y por ser la proteína mayoritaria dentro del género betabaculovirus, la granulina ha sido de gran utilidad para el desarrollo de sistemas de detección por técnicas moleculares (Barrera et al., 2011) e inmunoenzimáticas (Parola et al., 2003). Adicionalmente, los genes lef-8, lef-9 y gran son de gran utilidad para la inferencia filogenética basada en las distancias genéticas (Jehle et al., 2006). Existe un límite establecido de 0,015 como la mayor distancia existente entre dos aislamientos para ser considerados de la misma especie. En contraste, distancias superiores a 0,050 se consideran de diferente especie (Jehle et al., 2006). En el presente trabajo, las distancias genéticas entre los aislamientos VG010 y M34-4 fueron bajas (0,014), por lo cual se puede sugerir que son variantes genotípicas de la misma especie. De forma similar, se observó que aislamientos pertenecientes a la misma especie de hospedero como los granulovirus de Agrotis segetum, Adoxophyes orana y Cydia pomonella presentaron distancias bajas (<0,01) (tabla 2).

Las diferencias genéticas entre aislamientos de baculovirus se relaciona con el tipo de planta de la cual se alimenta el insecto hospedero (Hodgson et al., 2002).

La distancia genética entre VG010 y M34-4 indica que existen diferencias genéticas para ser considerados cepas diferentes, lo cual podría relacionarse con el tipo de cultivo de sus hospederos originarios. El aislamiento VG010 fue obtenido de larvas colectadas en un cultivo de caucho, mientras que el aislamiento M34-4 proviene de larvas colectadas en un cultivo de yuca. El cladograma de relaciones filogenéticas basado en las secuencias concatenadas de las proteínas granulina, lef-8 y lef-9 mostró una topología compatible con la descrita para baculovirus por otros autores con estos tres genes (Jehle et al., 2006) y con 31 genes núcleo (Miele et al., 2011) (figura 3). El granulovirus de E. ello VG010 se agrupó en un clado junto con el aislamiento M34-4 con un alto valor de soporte (100%). A su vez, los granulovirus de E. ello (Sphingidae) se agruparon con granulovirus de Andraca bipunctata (Bombycidae) con alto valor de soporte (79%).

El perfil de proteínas del granulovirus de E. ello VG010 evidenció una banda intensa con peso molecular de 34,50 kDa similar a la observada en el perfil proteico de un aislamiento del granulovirus de P. operculella (figura 4). El tamaño y la intensidad de la banda generada coincide con la proteína granulina, mayoritaria en el género betabaculovirus, la cual oscila entre 29 a 38 kDa (Caballero et al., 2001). El perfil proteico de un aislamiento colombiano del granulovirus E. ello previamente descrito, presentó 10 bandas de diferente tamaño, una de ellas en mayor cantidad correspondió a la granulina, con un tamaño similar al encontrado en VG010 (Finnerty et al., 2000). Esta proteína altamente conservada ha sido descrita en perfiles proteicos de diferentes granulovirus (Sciocco-Cap et al., 2001). Adicionalmente, en VG010 se observaron proteínas de mayor tamaño y menor concentración, similares a las descritas por Finnerty et al., (2000) para un aislamiento de EeGV, una de ellas con tamaño (37 kDa) compatible con una proteína de cápside viral.

Caracterización biológica

Patogenicidad

Los valores de P obtenidos del análisis Probit fueron superiores a 0,05 (tabla 3), lo cual sugiere que existe una correlación linear entre la dosis viral y la mortalidad de las larvas. Adicionalmente, los bajos valores de Chi-cuadrado (χ2) indican homogeneidad entre los datos, es decir que la distribución experimental se ajustó a la teórica (Zar, 1999) (tabla 3).

Bajo las condiciones experimentales evaluadas en este estudio, la mortalidad de las larvas se afectó por la concentración viral utilizada, siendo la concentración letal media (CL50) de 4,3 x 103 CI/mL y la concentración letal noventa (CL90) de 5,5 x 104 CI/mL (tabla 3). En todos los tratamientos inoculados con el virus se observaron larvas con síntomas típicos de infección por granulovirus como cambio en la coloración, pérdida de movimiento y de alimentación, pérdida de turgencia en el cuerpo de la larva y ruptura de la epidermis, al igual que lo reportado por otros autores para este virus (León et al., 2010).

Aunque en la literatura no se han reportado valores de concentraciones letales de aislamientos de granulovirus de E. ello, si se encuentran datos de otros aislamientos de granulovirus sobre larvas de otros lepidópteros. Sciocco-Cap et al., (2001)utilizando una técnica de bioensayo similar a la de este trabajo, encontraron valores de CL50 entre 4 y 5,6 x 103 CI/mL empleando un aislamiento de granulovirus de Epinotia aporema (Lepidoptera: Tortricidae) sobre larvas de este insecto; estos valores de CL50 fueron similares a lo encontrado en este trabajo. Por el contrario, para la mayoría de aislamientos de granulovirus como los de Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepidoptera: Noctuidae), Tecia solanivora (Povolny) (Lepidoptera: Gelechiidae) y Phthorimaea operculella (Zeller, 1873) (Lepidoptera: Gelechiidae) se han encontrado rangos más altos con valores de CL50 de 6,9 x 105 CI/mL, 3,6 x 106 CI/mL y 3,4 x 106 CI/mL, respectivamente (Espinel- Correal et al., 2009; Hatem et al., 2011).

Las variaciones de CL50 entre aislamientos de granulovirus de diferentes especies de insectos plaga se puede deber principalmente al hospedero y por ende a la adaptación del virus al mismo; adicionalmente dentro del género betabaculoviridae donde se encuentran los granulovirus de lepidópteros (Jehle et al., 2006), se agrupan tres tipos de virus diferentes según el tipo de infección que ocasionen y los tejidos susceptibles del insecto a la infección; estas variaciones en el proceso de infección repercuten directamente en la patogenicidad y en la virulencia del aislamiento viral (Caballero et
al., 2001; Rohrmann, 2010; Wang et al., 2008). Las cepas de alta patogenicidad como VG010 poseen ventajas como agentes de control y serían muy adecuadas para el control de plagas en cultivos de ciclo anual. Sin embargo, la patogenicidad no puede ser considerada de forma aislada, pero sí relacionada con otros aspectos del ciclo de vida del patógeno, como su tasa de transmisión y su capacidad de persistir en el ambiente (Caballero et al., 2001).

Productividad

Se determinó la cantidad promedio de cuerpos de inclusión producidos por gramo de tejido larval con el aislamiento de granulovirus VG010, la cual osciló entre 2,1 x 109 y 3,8 x 109 CIs/g. El resultado obtenido en el presente trabajo coincide con lo descrito por Hodgson y colaboradores (2001), quienes concluyeron que para la mayoría de larvas de lepidópteros infectadas por un virus de la familia Baculoviridae, el rendimiento promedio es de 109 CIs/g de larvas, presentándose la invasión de una gran variedad de tejidos del hospedero durante el ciclo de infección. Teniendo en cuenta que una larva de último estadio de E. ello puede pesar aproximadamente 7 g, una sola larva podría producir más de 1010 CIs, valor significativamente alto si se compara con los valores descritos para los granulovirus de otras especies de polillas como P. operculella para la cual la producción fue de 2,35 x 109 CIs/ larva (Zeddam et al., 2003) y Tecia solanivora para la cual la productividad se ha estimado en 1 x 109 CIs/ larva (Gómez et al., 2009). Esta alta productividad representa una ventaja desde el punto de vista tecnológico para el desarrollo de un bioplaguicida (Vásquez et al., 2002), ya que una de las principales limitantes de estos bioplaguicidas es la producción del virus a gran escala y a un costo aceptable, teniendo en cuenta que la producción se hace in vivo sobre el hospedero susceptible (Caballero et al., 2009), actividad altamente demandante de mano de obra que incrementa los costos del ingrediente activo. Por otra parte, la alta productividad viral mejora el potencial económico de un bioplaguicida, ya que reduce el número de insectos necesarios para producir una dosis de aplicación en campo (Grzywacz et al., 2001) y esto disminuye también el precio del producto por unidad comercial.

El rendimiento de un virus se ve afectado por muchos factores involucrados en el ciclo de infección sobre el insecto hospedero como el tiempo letal y la virulencia (Kamiya et al., 2004). Por ejemplo, Cherry y colaboradores (2002) evaluaron entre otros factores, el rendimiento de un granulovirus en larvas de la polilla dorso de diamante Plutella xylostella (Lepidoptera: Yponomeutidae), encontrando que a pesar de la alta patogenicidad del aislamiento de granulovirus empleado, la cual fue reflejada en la dosis letal media, los rendimientos fueron bajos posiblemente debido a la reducción de los tiempos de mortalidad. Al igual que el tiempo letal, la dosis proporcionada a las larvas y el aumento del peso y el tamaño inicial, son factores que pueden afectar el rendimiento del virus, obteniéndose menores rendimientos cuando el insecto se infecta consumiendo altas concentraciones virales debido a que su muerte ocurre más rápidamente (Boucias et al., 1980; Hodgson et al., 2001).

Otros factores importantes en la productividad viral están relacionados con el sistema de propagación, en el cual se debe tener en cuenta la dosis de inoculación, la edad de las larvas, el tiempo de recolección y la temperatura de incubación de las larvas, entre otros (Caballero et al., 2001; 2008). En un estudio realizado por Grzywacz y colaboradores (1998), en el cual se optimizó el sistema de producción del nucleopoliedrovirus de Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae), determinaron que uno de los factores más importantes para la productividad viral es el momento de la recolección de las larvas, el cual se encuentra relacionado con la cantidad máxima de producción de partículas virales y con la presencia de altos niveles de contaminación bacteriana cuando esta actividad se realiza después de la muerte del insecto.

Con respecto a la temperatura, éste es un factor que influencia tanto el crecimiento de las larvas como la replicación del virus y su capacidad infectiva (Sajap et al., 2007), por tal razón este factor se debe controlar para aumentar la productividad, siendo recomendada una temperatura de incubación entre 25 °C y 28 °C después de la inoculación con el virus (Subramanian et al., 2006).

En el caso del granulovirus de E. ello, a pesar del gran tamaño de las larvas que permiten obtener grandes cantidades de virus, es necesario estandarizar las condiciones tanto de cría masiva del insecto como de producción viral con el fin de aumentar la productividad y disminuir los costos, factores claves en la viabilidad económica de un producto comercial.

Evaluación de eficacia en laboratorio

Los resultados de eficacia (mortalidad corregida) en condiciones de laboratorio se muestran en la figura 5, donde se puede observar que se presentó una mayor mortalidad de larvas cuando éstas fueron inoculadas en segundo estadio (L2) en comparación con la mortalidad obtenida con larvas de mayor edad (L4) (figura 5). La mortalidad de individuos a los tres días después de la infección fue del 23% para larvas L2 y del 20 % para larvas L4. Cinco días después de la inoculación estos valores aumentaron alcanzando el 100 % para larvas L2 y el 64 % para larvas L4.

La mayor susceptibilidad de larvas más jóvenes a la infección viral ha sido descrita por otros autores como Schmitt (1988), quien recomendó la infección de larvas en segundo y tercer estadío para asegurar la infección eficiente de las mismas. Las diferencias en susceptibilidad a los baculovirus dependiendo de la edad de las larvas también han sido evidenciadas en varios trabajos (Hochberg, 1991; Sporleder et al., 2007; Teakle et al., 1986) y para otros patógenos de este insecto como la bacteria Bacillus thuringiensis (CIAT, 1989).

En trabajos realizados por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en los años 80s se obtuvieron resultados similares a los del presente estudio en laboratorio, alcanzándose un 100% de mortalidad de larvas de los primeros estadíos, tres días después de la inoculación del sustrato de alimentación consistente en hojas de yuca (CIAT, 1989). La mortalidad de las larvas aumentó progresivamente a medida que pasó el tiempo después de la inoculación. Se obtuvo una eficacia significativamente superior a los cinco días después de la inoculación con respecto a las mediciones anteriores, tanto para larvas en segundo como en cuarto estadío (F=94,2; P=0,0001; gl=17). La rápida mortalidad de las larvas infectadas con este virus, que alcanza el 100% a los cinco días de la inoculación de larvas L2, demuestra una alta virulencia, en comparación con granulovirus de otras especies que requieren un mayor tiempo para evidenciar su letalidad. Por ejemplo, un aislamiento del granulovirus de Adoxophyes orana (Lepidoptera: Tortricidae) mostró un tiempo letal medio de 37 días en larvas de primer estadio según lo determinaron Hilton y Winstanley (2008). Para el granulovirus de Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) también se han establecido tiempos letales medios prolongados que oscilan entre 15 y 27 días dependiendo de la edad de larvas al ser inoculadas (Hatem et al., 2011). En el caso del granulovirus de Plodia interpunctella (Hübner) (Lepidoptera: Pyralidea) se estimaron tiempos letales medios entre 15 y 21 días dependiendo de la calidad de la dieta de alimentación (McVean et al., 2002).

Las cepas muy virulentas naturalmente poseen ventajas como agentes de control y serían muy adecuadas para el control de plagas en cultivos de ciclo anual. Sin embargo, la virulencia no puede ser considerada de forma aislada, pero sí relacionada con otros aspectos del ciclo de vida del patógeno, como su tasa de transmisión y su capacidad de persistir en el ambiente (Caballero et al., 2002).

Evaluación de eficacia en campo

En las evaluaciones realizadas en cultivos de caucho después de aplicar el aislamiento de granulovirus VG010 se encontraron larvas con sintomatología típica de la infección (Figura 6), la cual se caracteriza por la presencia de larvas muertas colgando de las ramas por sus pseudopatas anales y evidenciando un tegumento frágil con licuefacción de los tejidos internos (Mukhopadhyay and Dev, 2009).

Cuando el aislamiento viral fue aplicado en un cultivo de caucho se observó mortalidad de las larvas a partir de las 24 horas post inoculación con valores de eficacia entre el 7 % y el 30 % para el tercio superior y medio respectivamente (figura 7). Pasados tres días se detectó un incremento significativo de la eficacia (F=8,23; P=0,0001; gl=31), con valores del 54 % y 71 % para los tercios superior y medio respectivamente. La población de larvas en el tercio medio de los árboles fue mayor (18 a 66 larvas/árbol) a la encontrada en el tercio superior de estos (entre 6 y 17 larvas/árbol), lo cual sugiere que las larvas prefieren alimentarse de hojas del tercio medio de los árboles. A medida que transcurrió el tiempo, la mortalidad de los individuos aumentó progresivamente sin presentar diferencias estadísticas entre los valores de eficacia obtenidos en las dos alturas de los árboles a los tres, cinco y siete días después de la aspersión del virus.

Después de siete días de haber realizado la aspersión del tratamiento, la eficacia osciló entre el 76 % y el 83 % para los tercios medio y superior respectivamente, sin detectarse diferencias significativas entre las dos alturas, lo que podría sugerir que la aspersión del virus fue homogénea a lo largo de los árboles. La homogeneidad en la aplicación en campo es de gran importancia para estos organismos debido a su actividad mediante infección oral, que requiere una alta cobertura para aumentar la posibilidad de infección de los individuos susceptibles (Caballero et al., 2002).

La alta eficacia de este virus sobre larvas del gusano cachón también ha sido demostrada en campo en cultivos de yuca, en los cuales se han alcanzado mortalidades del 100 %, cinco días después de la aplicación con bomba de espalda (CIAT, 1989).

El uso de este baculovirus se generalizó en países como Brasil, donde tuvo un gran auge en la década de los 80s y luego decayó, aunque aún se pueden conseguir algunos productos a nivel semicomercial para el control del gusano cachón en cultivos de yuca principalmente (Souza, 2001).

Conclusiones

El análisis de la morfología de los cuerpos de inclusión de los aislamientos analizados demostró que pertenecen al género betabaculovirus por sus características típicas de gránulo y virión único. Los perfiles de restricción de los tres aislamientos colombianos de E. ello analizados en el presente trabajo, no presentaron diferencias entre ellos, por lo cual se consideraron como una misma especie viral. Los perfiles de restricción y el análisis de la secuencia de genes altamente conservados de VG010 demostró diferencias genéticas comparadas con aislamientos de Granulovirus de E. ello previamente reportados, lo cual sugiere que se trata de un aislamiento nuevo. La caracterización biológica del aislamiento VG010 demostró su efectividad para el control de la plaga en condiciones de laboratorio y campo, especialmente en los primeros estadios larvales. Estos resultados representan la base para el desarrollo de un bioinsecticida para el control de E. ello en caucho.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por el apoyo financiero del presente trabajo.

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