Material vegetal

Para iniciar la investigación se seleccionaron hijuelos de zábila sanos de 20 a 30 cm de longitud, de un lote de plantas adultas ubicadas en los canteros del propagador del Vivero de la Universidad del Zulia, Venezuela (10°41'12"LN con 71°38'05"LO a 36 msnm).

Etapa de Establecimiento in vitro

Se diseñó un experimento totalmente al azar con un arreglo aleatorizado para evaluar el efecto del medio de cultivo líquido estático con puente Heller (soporte de filtro de papel) y compararlo con el medio gelificado con 4 g L^-1 de agargel (SIGMA).

Los hijuelos de zábila seleccionados del vivero universitario se sometieron a un primer lavado con agua corriente y jabón líquido comercial, eliminándoles los restos de sustrato y raíces. Seguidamente se realizó el procedimiento de desinfección descrito por ^{Albany et al. (2006)} y en condiciones asépticas los vástagos de 3 cm de longitud fueron seccionados hasta obtener el explante, constituido de la yema apical del vástago recubierta en la base por 3 a 4 hojas, con una altura promedio de 1 cm y un diámetro de 0.5 cm, aproximadamente.

Los explantes fueron introducidos en tubos de ensayos de 150 x 20 mm (Bellco Glass) cubiertos con tapones de polipropileno (Bellco Glass INC. Kaputs), que contenían 15 mL de medio de cultivo MS (^{Murashige & Skoog 1962}) de pH 5.8 , suplementado con 100 mg L^-1 mioinositol, 100 mg L^-1 de ácido ascórbico, 25 mg L¹ de cisteína y 30 g L^-1 de sacarosa; sin adición de reguladores de crecimiento.

Se establecieron 10 repeticiones de 3 unidades experimentales cada repetición, para un total de 30 explantes en cada tratamiento (medio líquido y medio gelificado). La unidad experimental estuvo representada por un tubo de ensayo con un explante y las variables evaluadas fueron el porcentaje de explantes establecidos a los 7, 14 y 21 días de cultivo y el porcentaje de explantes contaminados y la altura del explante al finalizar el periodo de cultivo (21 días).

Multiplicación in vitro de zábila en los Recipientes de Inmersión Temporal Automatizado (RITA ^® )

Para evaluar el efecto del medio de cultivo líquido en la multiplicación in vitro de zábila se seleccionaron los envases comerciales denominados RITA^® y se comparó con el medio gelificado, ya que éste es el comúnmente utilizado en la multiplicación in vitro de zábila (control).

Se realizaron dos experimentos, en el primero se evaluó la frecuencia de inmersión de cada 6, 8 y 12 h con 1 min de inmersión. En el segundo experimento se evaluó el tiempo de inmersión de 1, 2, 3 y 4 min con la frecuencia seleccionada del primer experimento de cada 8 h.

En cada experimento se utilizó un diseño experimental totalmente al azar con cuatro repeticiones por tratamiento. Para los tratamientos líquidos se agregaron 200 mL de medio de cultivo a los RITA^® y para el tratamiento control se agregó 50 mL de medio de cultivo gelificado con 4 g L^-1 de agargel (SIGMA) en frascos de vidrio de 1 L de capacidad.

Se seleccionaron brotes de zábila in vitro que poseían entre 2 y 3 cm de longitud con un mínimo de 3 hojas desarrolladas, del cuarto ciclo de multiplicación. En condiciones asépticas se individualizó cada brote y se decapitó a una longitud promedio de 1 cm desde la base hacia el extremo distal de las hojas y se sembraron diez explantes en cada envase.

En los dos experimentos se utilizó el medio de cultivo MS (^{Murashige y Skoog 1962}), suplementado con 100 mg L^-1 mioinositol, 100 mg L^-1 de ácido ascórbico, 25 mg L¹ de cisteína, 1 mg L^-1 de Bencilaminopurina (BAP) y 30 g L^-1 de sacarosa; a pH 5.8. Las variables evaluadas fueron el número de brotes/explante y la altura del explante a los 30 días de cultivo.

Enraizamiento in vitro de zábila en medio líquido y gelificado

Para comparar el efecto del medio líquido y gelificado en el enraizamiento in vitro se seleccionaron brotes de zábila de tamaño comprendido entre 3 y 6 cm de altura, procedentes de un séptimo subcultivo de propagación in vitro. A estos brotes se les eliminó toda brotación de yemas laterales y se les realizó un corte transversal del follaje para reducir la altura de los propágulos a 3 cm aproximadamente.

Los explantes fueron colocados individualmente en tubos de ensayo que contenían 15 mL de medio de cultivo líquido estático con puente Heller o gelificado con 4 g L^-1 de agargel (tratamientos). Se utilizó el medio de cultivo MS (^{Murashige y Skoog 1962}) con una reducción del 50% de las sales, suplementado con 100 mg L^-1 mioinositol, 100 mg L^-1 de ácido ascórbico, 25 mg L¹ de cisteína y 30 g L^-1 de sacarosa; a pH 5.8.

A los 10, 20 y 30 días de cultivo se evaluó el porcentaje de brotes enraizados; y al finalizar el cultivo (30 días) se evaluó la altura de la vitroplanta, el número y longitud de raíces. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar, con ochenta repeticiones por tratamiento.

Condiciones generales de crecimiento in vitro

Las etapas de establecimiento, multiplicación y enraizamiento, se desarrollaron en un cuarto de crecimiento in vitro con una temperatura promedio de 26°C±2°C con luz blanca fluorescente continua (40W) y una intensidad de 150 µmol m^-2 s^-1.

Para el análisis estadístico los valores porcentuales de las variables dependientes en la etapa de establecimiento y enraizamiento, fueron transformados a través de la ecuación n^1/2 + ½, donde n es el valor porcentual.

Los datos de todas las variables dependientes fueron evaluados mediante el análisis de varianza simple y la prueba de comparación de medias por Tukey. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa computarizado ^{Statistix versión 8.0 (2003)} para ambiente Windows de Microsoft^®.

Establecimiento in vitro en medio líquido y gelificado

El porcentaje de explantes contaminados, la altura del explante y el porcentaje de explantes establecidos a los 7 y 14 días, fueron afectados por la condición del medio de cultivo en la etapa de establecimiento in vitro de zábila. Sin embargo, todos los explantes que sobrevivieron lograron establecerse independientemente del medio de cultivo a los 21 días (tabla 1).

Tabla 1 Efecto del medio líquido estático con puente Heller y gelificado con agargel sobre el porcentaje de explantes contaminados, porcentaje de explantes establecidos y altura del explante en la etapa de establecimiento in vitro de zábila. 

Valores seguidos de letras distintas difieren estadísticamente (P ≤ 0.05) para la prueba de mínima diferencia significativa de Tukey.

El porcentaje de explantes contaminados observado en el medio gelificado fue duplicado en el medio líquido. La presencia de microorganismos en los medios líquidos puede ser detectada fácilmente por los colores, texturas, turbidez uniforme o no, películas o sedimentos de las sustancias que estos microorganismos segregan en el medio (^{Alvarado 1998}). En los medios gelificados se observó oscurecimiento del medio probablemente por liberación de fenoles que dificultó la detección de los contaminantes, incrementándose el riesgo de obtener pérdidas en etapas posteriores a la del establecimiento, como la multiplicación. En tal sentido, la necesidad de observar los contaminantes para su eliminación oportuna es un aspecto que debe tomarse en cuenta incluso para elegir el agente gelificante (Capote et al., 2002), los que brindan una apariencia traslucida similar al medio de cultivo líquido (phytagel y gellan gum) son los más costos.

Se ha evaluado el porcentaje de explantes contaminados en la etapa de establecimiento in vitro de zábila en medios de cultivo gelificado; pero para demostrar la influencia del contenido de sacarosa (^{Tanabe y Horiuchi 2006}) y el efecto del método de desinfección superficial empleado (^{Albany et al., 2006}; ^{Matos et al., 2000}). No obstante, el resultado obtenido en esta investigación de 11.11 % de explantes contaminados en el medio gelificado fue similar al reportado por ^{Albany et al. (2006)} de 9.09 % e inferior al obtenido por ^{Matos et al. (2000)} con el 24 %. En cuanto al medio líquido no hay precedentes para establecer comparaciones apropiadas; y aunque resultó estadísticamente superior al medio gelificado en este estudio, permitió identificar rápidamente el material contaminado y excluir de forma temprana cualquier fuente de contaminación.

El porcentaje de explantes establecidos a los 7 días de cultivo en el medio líquido fue superior que en el medio gelificado (tabla 1), tendencia que se mantuvo hasta los 14 días de cultivo. Sin embargo, todos los explantes lograron establecerse a los 21 días, independientemente de la condición del medio de cultivo.

Estos resultados parecieran estar relacionados con la facilidad que tienen los tejidos de absorber los nutrientes de los medios líquidos y manifestar crecimiento en poco tiempo; mientras que los medios de cultivo gelificados limitan la absorción de los nutrientes (^{Lorenzo et al., 1998}), ya que éstos pasan a formar parte de la matriz del gel y los explantes requieren mayor tiempo para manifestar crecimiento.

Por otra parte, durante los primeros 7 días de cultivo se observó la presencia de compuestos fenólicos en la base de los explantes en ambos medios de cultivo (líquido y gelificado); sin embargo, en el medio gelificado se evidenció mayor ennegrecimiento en la superficie de contacto con el medio de cultivo debido a la menor tasa de difusión. El alto contenido de estos compuestos fenólicos causa oxidación en el medio de cultivo (Matos 2007), dificultando el establecimiento de la zábila in vitro, ya que estas sustancias fenólicas son reconocidas como inhibidores del crecimiento (^{Roy y Sakar 1991}). Estas razones pudieran estar relacionadas con la disminución del crecimiento de los explantes en los medios de cultivo gelificado durante las primeras semanas de cultivo; contrariamente los explantes del medio líquido lograron contrarrestar los efectos negativos de la oxidación, ya que estos compuestos se diluyen con mayor facilidad en el medio líquido; afectando en menor grado el crecimiento de los explantes.

Hasta el momento, sólo se ha utilizado medio gelificado para el establecimiento in vitro de zábila con resultados similares en cuanto al tiempo de crecimiento de los explantes; reportándose después de 15 días (^{Natali et al., 1990}; ^{Matos et al., 2000}) y de 4 semanas de cultivo (^{Liao et al., 2004}). Los resultados de esta investigación ponen de manifiesto la eficiencia de los medios de cultivo líquido para la etapa de establecimiento in vitro de zábila.

Al cabo de 21 días de cultivo se observó mayor altura en los explantes establecidos en el medio de cultivo líquido en comparación con el medio gelificado (tabla 1). Esta respuesta está directamente asociada a la absorción de nutrientes sin mayores restricciones en los explantes cultivados en medio líquido.

Resultados similares a esta investigación fueron reportados por ^{Matos et al. (2000)}, ^{Natali et al. (1990)} y ^{Aggarwal y Barna (2004)} con valores que oscilaron entre 2 y 4 cm de altura de explantes de zábila en la etapa de establecimiento, pero después de 30 días de cultivo.

Multiplicación in vitro de zábila en los Recipientes de Inmersión Temporal Automatizado (RITA ^® )

La frecuencia de inmersión durante la multiplicación in vitro de zábila, afectó el número de brotes de los explantes crecidos en los RITA^®; resultando mayor cuando se incrementó la frecuencia a 8 y 6 h, sin diferenciarse del número de brotes obtenidos en el medio gelificado. Entre tanto, la altura del explante siempre fue mayor en todas las frecuencias de los RITA^® que en el medio gelificado (tabla 2).

Tabla 2 Efecto de la frecuencia (6, 8, 12 h) con 1 min de inmersión en los RITA^® sobre el número de los brotes/explante y la altura del explante en la etapa de multiplicación in vitro de zábila. 

Valores seguidos de letras distintas difieren estadísticamente (P ≤ 0.05) para la prueba de mínima diferencia significativa de Tukey.

El tiempo de inmersión en los RITA^® sólo afectó el número de brotes por explante, obteniendo una mayor brotación en el menor tiempo con un valor promedio similar al control (medio gelificado); mientras que la altura del explante no varió entre los tratamientos en los RITA^®; pero todas fueron superiores a la alcanzada por los explantes crecidos en el medio gelificado (tabla 3).

Tabla 3 Efecto del tiempo de inmersión (1, 2, 3 y 4 min) con una frecuencia de cada 8 h en los RITA^® sobre el número de los brotes/explante y la altura del explante en la etapa de multiplicación in vitro de zábila. 

Valores seguidos de letras distintas difieren estadísticamente (P ≤ 0.05) para la prueba de mínima diferencia significativa de Tukey.

Los valores obtenidos para la altura del explante en relación al número de brotes en ambos experimentos de los RITA^®, parecieran indicar que los nutrientes del medio líquido son asimilados rápidamente por los explantes, evidenciándose en mayor altura del explante en detrimento de la formación de brotes. Esta hipótesis puede ser corroborada con el comportamiento de los explantes en el medio gelificado (control) los cuales mostraron mayor equilibrio entre el crecimiento del explante y el número de brotes emitidos por éstos; como consecuencia de la absorción de los nutrientes sólo por la base del explante y de forma paulatina, debido a la retención que ejerce la matriz del gelificante; mientras que en los RITA^® el contacto intermitente del medio nutritivo con los explantes le proporciona una capa delgada de medio que se adhiere en toda la superficie del explante por cohesión y se renueva con cada inmersión.

Al respecto se ha demostrado que las condiciones de los sistemas de inmersión temporal (SIT) y de los medios líquidos en agitación orbital favorecen un mayor crecimiento de tallos y hojas que no son aprovechables para la etapa de multiplicación (^{Albany et al., 2006} y ²⁰⁰⁵).

En la multiplicación in vitro de zábila, se ha señalado una mayor altura del explante en medios de cultivo líquidos en agitación orbital (50 rpm) en comparación al medio gelificado con 3.85 y 2.83 cm, respectivamente y similar coeficiente de multiplicación entre ambos tipos de medio de cultivo con 3.75 brotes por explante (^{Albany et al., 2006}). Mientras que ^{Aggarwal y Barna (2004)} compararon el medio de cultivo líquido estático con el medio gelificado; obteniendo 5.1 brotes por explante en los medios líquidos y 4.8 brotes/explante en los medios gelificados.

Cabe destacar que el origen de las diferencias entre el número de brotes obtenidos en esta investigación y los señalados con anterioridad, se debe principalmente a las diferencias entre las formas de cultivo líquido empleado, relacionadas con el RITA^®, el medio líquido estático (^{Aggarwal y Barna 2004}) y en agitación orbital (^{Albany et al., 2006}). Además, la composición de los medios de cultivo utilizados y la manera de medir la variable con seguridad afianzaron las diferencias.

Estudios realizados por ^{Vilchez et al. (2007)} en la multiplicación in vitro de zábila demuestran que una frecuencia de 3 veces al día durante 2 min, permite obtener mayor número de brotes en los RITA^® (2.75) y al variar los tiempos de inmersión (1, 2 y 3 min) no se reportaron diferencias para el número de brotes; pero sí mayor longitud del explante (5.01 cm) en los RITA^® con 1 min de inmersión tres veces al día. Estos resultados son similares a los mostrados en esta investigación con las frecuencias de 8 y 6 h, que arrojaron los mayores valores de brotes por explante con 2.86 y 2.99, respectivamente; y cuando se variaron los tiempos de inmersión (1, 2, 3 y 4 min) se observó mayor número de brotes (2.93) en inmersiones de 1 min cada 8 h, con similar altura entre los explantes de los RITA^®.

Enraizamiento in vitro de zábila en medio líquido y gelificado

Transcurridos 30 días de cultivo en la etapa de enraizamiento, las variables altura de la vitroplanta, el número y la longitud de las raíces; no mostraron diferencias estadísticas (P ≤ 0.05) por efecto del medio líquido en comparación con el medio gelificado. El porcentaje de explantes enraizados, mostró diferencias por efecto de la condición del medio de cultivo sólo a los 10 y 20 días de cultivo (tabla 4).

Tabla 4 Efecto del medio líquido-estático y gelificado con agargel sobre el porcentaje de brotes enraizados, altura de la vitroplanta, número y longitud de las raíces en la etapa de enraizamiento in vitro de zábila. 

Valores seguidos de letras distintas difieren estadísticamente (P ≤ 0.05) para la prueba de mínima diferencia significativa de Tukey.

Durante los primeros días de cultivo fue notoria la diferencia en el crecimiento de los brotes cultivados en el medio líquido; corroborando de esta manera la facilidad que tienen los explantes de absorber los nutrientes del medio líquido en comparación con el medio gelificado.

A los 10 días de cultivo, el porcentaje de brotes enraizados en el medio líquido duplicó el valor porcentual alcanzado en el medio gelificado. Sin embargo, a los 20 días de cultivo disminuyó esta diferencia; pero se mantuvo mayor porcentaje de brotes enraizados en el medio líquido. Treinta días después, los brotes colocados en medios gelificados (figura 1a) y líquidos (figura 1b) enraizaron casi en su totalidad, eludiendo las diferencias estadísticas existentes entre ellos.

Figura 1 Brotes enraizados in vitro de zábila obtenidos a los treinta días de cultivo. En sistemas de medio gelificado con 4 g L-1 de agargel (a). En medio líquido estático con puente Heller (b). 

Este comportamiento pudiera estar relacionado con la mayor resistencia que proporciona la matriz del medio gelificado a los brotes sin raíces para absorber los componentes del medio de cultivo, en comparación con el medio líquido. Es evidente que durante los primeros días de cultivo, los brotes colocados en el medio líquido comienzan a absorber rápidamente los nutrientes, por lo que se agotan estos nutrientes del medio de cultivo con la misma velocidad. Razón por la cual a medida que transcurre el tiempo de cultivo, comienza a disminuir la diferencia entre el porcentaje de brotes enraizados en el medio líquido con respecto al medio gelificado.

Al respecto, ^{Tanabe y Horiuchi (2006)}, señalan que la concentración del gelificante influye en la capacidad de las plántulas de zábila en absorber agua y otros componentes del medio de cultivo. Estos investigadores demostraron que el porcentaje de ganancia de peso de las plántulas aumentó a medida que se disminuyó la concentración del gelificante, obteniendo 74 % de ganancia de peso con 4 g L^-1 de gellan gum.

Por otra parte, ^{Orellana (1998)} señala que el uso del medio de cultivo líquido permite la difusión de los residuos tóxicos de las vitroplantas, principalmente los compuestos fenólicos que son abundantes durante la iniciación de las raíces en la etapa de enraizamiento y disminuyen el período de las plantas para ser llevadas a la etapa de aclimatación. Además ^{Gangopadhyay et al. (2002)}, afirman que existe una alta frecuencia de dañar las raíces al momento de extraerlas del medio gelificado para el trasplante, y cuando quedan restos del gelificante sobre las raíces puede favorecer el crecimiento de hongos y bacterias.

En los trabajos del género Aloe, se observa una alta capacidad de enraizamiento por parte de los brotes in vitro de zábila al utilizar diferentes agentes gelificantes con la adición o no de auxinas al medio de cultivo. Al respecto ^{Meyer y Van Staden (1991)}, reportaron el 100 % de brotes de zábila enraizados con una altura entre 5 y 6 cm utilizando IBA como fuente auxínica y el gelrite como agente gelificante. A diferencia de ^{Natali et al. (1990)} quienes utilizaron un medio de cultivo sin auxinas y gelificado con agar, pero igual obtienen el 100 % de enraizamiento a los 7 y 10 días de cultivo; tiempo similar (10 días aproximadamente) en el que ^{Matos et al. (2000)} en un medio de cultivo sin hormonas y con gellan como agente gelificante lograron el enraizamiento de zábila, mientras que ^{Aggarwal y Barna (2004)} después de 15 días de cultivo obtienen 100 % de brotes enraizados de zábila en medios de cultivo gelificados con agar y sin auxinas.

Los resultados anteriormente señalados indican que los brotes de zábila tienen un alto potencial de formar raíces adventicias, corroborándose en esta investigación tanto en los medios de cultivo líquido como en los gelificados. Ahora bien, en función del objetivo de esta investigación en disminuir de los costos de producción es pertinente destacar la eficiencia alcanzada en esta etapa, al obtener el 100 % de los brotes de zábila enraizados en un medio de cultivo sin agente gelificante, reguladores de crecimiento y con una reducción al 50 % de las sales de MS.

Esta investigación constituye el primer aporte científico del uso de medio de cultivo líquido en zábila para la etapa de establecimiento in vitro y el segundo señalamiento de empleo de RITA^® en la etapa de multiplicación y de medio líquido estático en la etapa de enraizamiento; con resultados satisfactorios en todos los casos.