Experimento 1: Determinación del solvente para la obtención de los extractos crudos de exudados foliares de tabaco.

Con el objetivo de seleccionar el mejor solvente para obtener los extractos crudos de exudados foliares de tabaco, se evaluaron cinco solventes con polaridades entre 3 and 6: diclorometano (3.1), n-butanol (3.9), acetato de etilo (4.4), metanol (5.1) y etanol 90% (6.2).

Se utilizaron de 5 a 6 hojas más jóvenes de dos plantas de la línea Nic 1061 para cada tratamiento lo que correspondió con una masa fresca de aproximadamente 60 g. Las plantas tenían una altura promedio de 80 cm. Se sumergieron las hojas en 500 mL del solvente, cuatro veces durante siete segundos, se filtraron a través de papel, se concentraron por rotoevaporación hasta un volumen de 50 mL y se guardaron a -20°C hasta su posterior evaluación. Se determinó el rendimiento expresado en mg de masa seca del extracto/g de masa fresca foliar.

Para determinar la presencia de metabolitos secundarios en los extractos de exudados foliares obtenidos a partir de diferentes solventes, se corrieron en cromatofolios de gel de sílice (DC-Tarjetas SI F 20 x 20 cm, Riedel de la Haën). La placa se activó 10 min a 60°C y la aplicación se realizó con 10 gotas por muestras. Se utilizó como sistema eluyente: benceno: acetato de etilo (86:14). Después de la corrida los cromatofolios se secaron 2-3 min a 60°C. El revelado se realizó con una solución de ácido fosfomolíbdico (20 g de ácido fosfomolíbdico en 100 mL de etanol absoluto.

Experimento 2: Obtención de extractos crudos a partir de exudados foliares de líneas de tabaco.

Se tomaron tres plantas de las 10 líneas sembradas y se evalúo el número de hojas, la altura de las plantas, la masa fresca foliar y la masa seca foliar para determinar la tasa masa seca/masa fresca.

A partir de las hojas de tres plantas la extracción se realizó de la misma manera que en el experimento anterior utilizando como solvente el etanol 90 %. Se determinó la concentración de los extractos expresada en mg de masa seca·mL^-1 de solvente (dato no mostrado), y el rendimiento expresado en mg de extracto seco·g^-1 de masa fresca foliar, así como también se realizó una cromatografía de capa fina como se explica en el experimento anterior.

Experimento 3: Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de tabaco frente a bacterias fitopatógenas.

El ensayo de actividad antibacteriana se realizó por el método de difusión en agar usando discos de papel de filtro (^{Valgas et al., 2007}). Las placas se inocularon con cada bacteria (Xanthomonas campestris y Pectobacterium carotovorum) a DO 625 nm de 0.15 y 0.17 respectivamente. Una alícuota de 100 µL de solución bacteriana se extendió encima del medio Luria Bertani (LB).

Los extractos secos se disolvieron con dimetilsulfóxido (DMSO) a 5 y 25 µg·µL^-1. Con el objetivo de determinar la actividad antimicrobiana de los extractos crudos obtenidos a partir de los de diferentes solventes y los obtenidos a partir de las diferentes líneas utilizando el solvente seleccionado (experimentos 1 y 2) se aplicaron 20 µL de la concentración 25 µg·µL^-1 en discos de papel de filtro estériles de 0,7 cm de diámetro.

Con el objetivo de determinar diferentes concentraciones de los extractos se aplicaron 1, 5, 10, 15 y 20 µL (5, 25, 50, 75 y 100 µg respectivamente) de la concentración 5 µg·µL^-1 y 8, 12, 16 y 20 µL (200, 300, 400 y 500 µg respectivamente) de la concentración 25 µg·µL^-1 en discos de papel de filtro estériles de 0,7 cm de diámetro.

Los discos con los extractos se secaron y colocaron a una distancia entre ellos de 1.5-2,0 cm en las placas, previamente inoculadas con cada bacteria. La solución de kanamicina a 50 µg·µL^-1 (10 µL) se usó como un control positivo en el ensayo in vitro, al ser la bacteria susceptible a este antibiótico. Se utilizó el dimetilsulfóxido como control negativo o control de solvente (20 µL) para todos los casos, ya que este fue el solvente utilizado para disolver los extractos secos.

Las placas se incubaron por 24 h a 37°C y se midió el diámetro del halo de inhibición incluyendo el diámetro del disco. Cada tratamiento se hizo por triplicado y el experimento por duplicado.

Experimento 1: Determinación del solvente para la obtención de los extractos crudos de exudados foliares de tabaco.

En este experimento se logran mayores rendimientos con el uso del etanol 90%, seguido del diclorometano y al final los solventes: metanol, acetato de etilo y n-butanol sin diferencias entre ellos (figura 1 A). El incremento en la polaridad del etanol 90%, teniendo en cuenta además el 10% de agua que presenta, pudo haber contribuido a la extracción de otros compuestos más polares que no fueron extraídos con los otros solventes y estos incrementan la masa del extracto seco y por supuesto el rendimiento. Por lo que este solvente puede tener la capacidad de extraer compuestos polares y menos polares.

Figura 1 A. Rendimiento de la extracción en mg de extracto seco·g^-1 de masa fresca foliar de los exudados obtenidos en 500 mL de los diferentes solventes: etanol 90%, metanol, DCM (diclorometano), acetato de etilo y n-butanol a partir de la línea Nic 1061 B: Cromatografía en capa fina para la separación de los extractos crudos obtenidos a partir de exudados foliares de la línea Nic 1061 con diferentes solventes. 1. Extracto con etanol 90%. 2. Extracto con metanol 3. Extracto con diclorometano 4. Extracto con acetato de etilo 5. Extracto con butanol. Medias con letras diferentes representan diferencias significativas entre solventes (Anova de un factor y Tukey en un análisis estadístico realizado en SPSS para p≤0.05, n=6). 

La cromatografía en capa fina de los extractos reveló una extracción efectiva y similar de los compuestos mayoritarios en todos los casos (figura 1 B). Todos los solventes evaluados fueron capaces de extraer los compuestos mayoritarios, sin grandes diferencias en el patrón cromatográfico. En todos los extractos obtenidos con diferentes solventes se revela un compuesto A cerca del punto de aplicación y un compuesto B cerca del frente de corrida, con una mayor intensidad del compuesto A para el extracto etanólico, seguido del extracto metanólico y menor para el extracto butanólico (figura 1 B).

Debido a que el diclorometano se ha convertido en un factor de referencia para los lavados de las superficies foliares de tabaco, existen pocos datos publicados en la última década relacionados con la eficiencia de extracción de otros solventes para estos fines (^{Whitfield, 2004}). Existe una mayor tendencia a utilizar el tabaco en la producción y obtención de productos naturales por lo que es determinante el desarrollo de métodos de extracción escalables.

^{Whitfield (2004)} con el objetivo de desarrollar métodos para la producción y extracción de proteínas de la superficie foliar de tabaco transgénico también evaluó diferentes solventes y el número de lavados. Sus estudios mostraron que un mayor número de lavados de los solventes evaluados (3 lavados) puede lograr rendimientos comparables para algunos casos a los alcanzados con diclorometano. Además, demostró que la extracción individual de cada compuesto también dependía del número de lavados pero en todos los casos el 100% de la cantidad de cada compuesto se alcanzó después de los tres lavados. De forma general obtuvo los mejores resultados con n-propanol, metanol y etanol.

En este experimento los 4 lavados realizados para todos los solventes deben permitir una mayor extracción de metabolitos en general del etanol 90% en comparación con el diclorometano y el resto de los solventes en igualdad de condiciones por lo que la intensidad de los compuestos A y B representados en la cromatografía parece corresponder con el máximo para cada compuesto, lo que determina que el n-butanol no es capaz de extraer en estas condiciones iguales cantidades del compuesto B si lo comparamos con el diclorometano y el resto de los solventes evaluados. No obstante se requiere un estudio de la composición química de todos los extractos obtenidos para llegar a esta conclusión.

Es conocido además el efecto de deterioro que ocasiona en las hojas el diclorometano. En este experimento se observaron algunos daños no evaluados en las hojas tratadas con diclorometano, y en mejores condiciones las hojas tratadas con etanol 90 % lo que ha sido comprobado por ^{Whitfield (2004)} quien observó menor efecto en las condiciones de las hojas cuando se usaron solventes como etanol y metanol, medianamente afectadas las hojas tratadas con isopropanol y n-propanol y altamente afectadas las hojas tratadas con diclorometano, por lo que esto es un aspecto también a tener en cuenta en la selección del solvente si se quiere integrar el paso de extracción de los compuestos de la superficie en operaciones de bioprocesos o de análisis químico del interior de la hoja.

Teniendo en cuenta los rendimientos en los extractos secos (mayor en etanol 90 %) y la semejanza en el patrón cromatográfico de los extractos de diclorometano y etanol, y aún cuando los solventes de metanol y acetato de etilo presentan patrones similares, proponemos el empleo del etanol 90% en la obtención de los exudados foliares a partir de las diferentes líneas por ser más eficiente que el diclorometano y el resto de los solventes y teniendo en cuenta las otras consideraciones como que el etanol 90 % es más inocuo, más seguro, menos agresivo, de más fácil manipulación, concentración y recuperación, más disponible y más económico.

El etanol 90% se ha seleccionado para la obtención de extractos crudos para los próximos experimentos, no obstante la selección del solvente más adecuado siempre depende de los compuestos que uno pretende aislar y su actividad, por lo que es posible que el 100 % de efectividad no se logre debido a la gran diversidad de estructuras químicas presentes en la superficie de la hoja del tabaco entre diferentes genotipos, pero al menos se logra una buena representación de los compuestos mayoritarios. Es necesario comprobar la actividad de los compuestos aislados luego de la extracción.

Experimento 2: Obtención de extractos crudos a partir de exudados foliares de líneas de tabaco

Se obtuvieron los exudados foliares de tabaco a partir de diez líneas de tabaco utilizando como solvente el etanol 90%. Los extractos crudos concentrados hasta 50 mL mostraron intensidad diferente en la coloración (datos no mostrados) que correspondió con diferentes concentraciones en mg de extracto seco·mL de etanol 90% (datos no mostrados). Las líneas presentaron un rendimiento diferente entre ellas, (figura 2 A).

Figura 2 A. Rendimiento de la extracción en mg de extracto seco·g^-1 de masa fresca foliar de los exudados obtenidos en 500 mL de etanol 90 %: a partir de las 10 líneas B: Cromatografía en capa fina para la separación de los extractos crudos C: Se utilizó como control el extracto etanólico obtenido de la línea 1061 en el experimento 1 de diferentes solventes. 1: CE, 2: SNN, 3: Nic 1017, 4: Nic 1019, 5: BHmN, 6: Nic 10103, 7: Nic 1061, 8: Nic 1015, 9: Nic 1016, 10: Nic 1006. Se señalan con letras A-G diferentes compuestos revelados. Medias con letras diferentes representan diferencias significativas entre líneas de tabaco (Anova de un factor y Tukey en un análisis estadístico realizado en SPSS para p≤0.05, n=6). 

El mayor rendimiento se alcanzó con la línea Nic 1006 con valores de 8 mg de extracto seco·mg^-1 de masa fresca foliar, luego le siguió la Nic 1003, y luego la Nic 1019 y Nic 1015, esta última sin diferencia con la Nic 1061 cubriendo valores entre 4 y 7 mg de extracto seco·mg^-1 de masa fresca foliar. El rendimiento más bajo se obtuvo con la línea Nic 1016 (figura 2 A), la que a pesar de tener una gran masa fresca foliar, altura y número de hojas por planta (tabla 1) no se extrajeron grandes cantidades de componentes de la superficie foliar. Esto demuestra que los indicadores morfológicos no son determinantes en la selección de las líneas candidatas, la composición química de las líneas está más relacionada con el factor genético. No obstante una vez detectada la capacidad genética de síntesis de los compuestos de interés, el conocimiento de los aspectos morfológicos es importante a la hora de establecer un proceso de producción.

La cromatografía en capa fina de los extractos en estas condiciones reveló una diversidad en composición química dada por la línea de tabaco, así como también la concentración de los extractos y los compuestos mayoritarios en todos los casos (figura 2 B). En la mayoría de los extractos se revela un compuesto A cerca del punto de aplicación que no aparece en los extractos (3 y 9, figura 2 B) y un compuesto B cerca del frente de corrida que no aparece en los extractos (2 y 8, figura 2 B) y Otros compuestos C y D se muestran en los extractos 4 y 6 (figura 2B). Se observa la presencia de un compuesto E en las líneas 1, 4 y 5 y de un compuesto F en las líneas, 1, 4, 5 y 6 (figura 2 B). Otro compuesto G más próximo al frente de corrida se muestran solo en los extractos 5 y 6 (figura 2 B).

Este sistema permite la separación de diferentes componentes de una muestra y mostrar la diversidad química que presentan los extractos etanólicos obtenidos, dado por la gran diversidad química característica de la familia Solanaceae en general y la diversidad de genotipos (Wollenweber et al., 2005; ^{Cui et al., 2011}; ^{Tissier, 2012}, ^{Sallaud et al., 2012}), lo que posibilita una diversidad de aplicaciones potenciales de estos extractos. Otros métodos de cromatografía se requieren para la cuantificación e identificación de los compuestos presentes.

Aunque los metabolitos secundarios son los más frecuentemente asociados a la resistencia a enfermedades, también proteínas defensivas llamadas filoplaninas, relacionadas con la patogénesis, forman parte de la superficie foliar de hojas de tabaco y son consideradas productos de tricomas glandulares, confiriéndole resistencia a patógenos (Sheperd et al., 2005). En este caso con el uso de solventes de mediana polaridad se favorece la extracción de los metabolitos secundarios mayoritarios de la superficie foliar como diterpenos y ésteres de azúcares. Debido a que las filoplaninas son compuestos polares, sólo extracciones acuosas permitirían obtener filoplaninas en los extractos, por lo que no se espera la presencia de estas en los extractos obtenidos (Sheperd et al., 2005).

Todos los extractos son seleccionados para la evaluación de la actividad antibacteriana in vitro contra las bacterias patógenas: Xanthomonas campestris y Pectobacterium carotovorum.

Experimento 3: Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de tabaco frente a bacterias fitopatógenas.

En la determinación de la actividad antibacteriana de extractos obtenidos para la comparación de diferentes solventes frente a Xc y Pc, la línea Nic 1061 mostró su capacidad para inhibir el crecimiento de Xc con todos los extractos (tabla 2). Un análisis de los halos de inhibición no reveló diferencias significativas entre los extractos que provocaron una inhibición de 2,0 cm de diámetro aproximadamente. Esto evidencia dos resultados: los extractos de la línea Nic 1061 inhiben el crecimiento de Xc y los solventes evaluados son capaces de extraer el compuesto activo o los compuestos activos en cantidades similares.

Tabla 2 Efecto antibacteriano in vitro de extractos de exudados foliares de tabaco (N. tabacum L.), línea Nic 1061 obtenidos con el empleo de diferentes solventes contra las bacterias fitopatógenas Xanthomonas campestris (Xc) y Pectobacterium carotovorum (Pc). La zona de inhibición se determina por el diámetro expresado en centímetros (cm) e incluye el diámetro del disco (0,7cm). K: kanamicina como control positivo (500 μg). 

Medias con letras diferentes representan diferencias significativas entre solventes y kanamicina para cada bacteria independiente. (Anova de un factor y Tukey en un análisis estadístico realizado en SPSS para p≤0.05, n=6).

La kanamicina utilizada como control positivo, provocó una inhibición de 3,0 cm de diámetro significativamente diferente a la de los extractos para el caso de Xc. Sin embargo, en el ensayo contra Pc no se mostró inhibición del crecimiento por los extractos, y una menor inhibición provocada por la kanamicina de aproximadamente 2,0 cm de diámetro. El uso de la kanamicina sólo nos permite en ensayos in vitro, lograr un indicador inhibición del crecimiento en bacterias susceptibles a ella, pero este antibiótico no es utilizado in vivo, además de que no es posible realizar una comparación real de su efecto con el efecto que podrían ocasionar los extractos crudos, que se conforman por una mezcla de compuestos. Otros autores han utilizado la kanamicina y otros antibióticos en ensayos in vitro de antibiogramas (^{Pino et al., 2012}; ^{Owoseni y Sangoyomi, 2014}). En próximos experimentos la kanamicina podría utilizarse en concentraciones más bajas para evitar influencia de esta sobre los discos evaluados en un reducido espacio de la placa, también un menor número de discos pueden ser evaluados por placa para evitar solapamiento de halos si los productos aplicados muestran una gran inhibición del crecimiento bacteriano.

El dimetilsulfóxido utilizado para disolver los extractos secos, no mostró inhibición del crecimiento al evaluarse como control negativo lo que demuestra la no interferencia de este disolvente en los resultados obtenidos y su uso eficaz para estos experimentos.

^{Geethaa et al. (2013)} comprobaron que el dimetilsulfóxido resultó ser el más seguro, en una comparación entre disolventes para detectar efectos fitotóxicos y presencia de compuestos bioactivos.

La semejanza encontrada en los ensayos de inhibición para los extractos obtenidos a partir del uso de diferentes solventes apoya la idea de sustituir el diclorometano por el etanol 90 % en este propósito en particular, ya que corrobora que se han extraído los mismos compuestos que tienen propiedades antibacterianas contra Xc. Esta línea mostró actividad sólo para una bacteria lo cual indica que todos los extractos deben ser evaluados contra las dos bacterias y sugiere la existencia de diferentes compuestos activos para la interacción con diferentes bacterias.

En la determinación de la actividad antibacteriana de extractos obtenidos para la comparación de líneas de tabaco frente a Xc y Pc se observó que todos los extractos crudos evaluados mostraron menor halo de inhibición en comparación con la kanamicina en los ensayos de ambas bacterias (figura 3). Para el caso de Xc los mejores extractos se obtuvieron a partir de las líneas Nic 1019 (4), BHmN (5), Nic 1061 (7) and Nic 1016 (9), mientras que para el caso de Pc sólo el extracto de la línea Nic 1015 (8) mostró efecto inhibitorio (tabla 3) (figura 3). Entonces es posible obtener extractos activos contra estas dos bacterias utilizando solventes más comunes, menos tóxicos y más baratos que el diclorometano.

Tabla 3 Efecto antibacteriano in vitro de extractos etanólicos (500 μg) de exudados foliares de tabaco (N. tabacum L.) (10 líneas) contra las bacterias fitopatógenas Xanthomonas campestris (Xc) y Pectobacterium carotovorum (Pc). La zona de inhibición se determina por el diámetro expresado en centímetros (cm) e incluye el diámetro del disco (0,7cm). K: kanamicina como control positivo (500 μg). 

Medias con letras diferentes representan diferencias significativas entre líneas de tabaco y kanamicina para cada bacteria independiente (Anova de un factor y Tukey en un análisis estadístico realizado en SPSS para p≤0.05, n=6).

Figura 3 Efecto antibacteriano in vitro de extractos crudos (500 μg) de exudados foliares de tabaco (N. tabacum L.) por el método difusión en agar con discos de papel de filtro contra dos bacterias fitopatógenas Xanthomonas campestris (A, B, C) y Pectobacterium carotovorum (D, E, F) determinado por el halo de inhibición de crecimiento bacteriano. Extractos obtenidos con cinco solventes (E: etanol 90 %, M: metanol, D: diclorometano, A: acetato de etilo, B: n-butanol) línea Nic 1061 contra Xanthomonas campestris (a) y Pectobacterium carotovorum (d). Extractos etanólicos obtenidos a partir de 10 líneas de tabaco 1: CE, 2: SNN, 3: Nic 1017, 4: Nic 1019, 5: BHmN, 6: Nic 10103, 7: Nic 1061, 8:Nic 1015, 9: Nic 1016, 10: Nic 1006 contra Xanthomonas campestris (b, c) y Pectobacterium carotovorum (e, f). K: kanamicina como control positivo 500 μg. C-: dimetilsulfóxido como control negativo. 

Para el ensayo de diferentes concentraciones menores a 500 µg/disc se seleccionaron los extractos de las líneas BHmN (5), Nic 1061 (7) and Nic 1016 (9) contra X. campestris y el extracto de la línea Nic 1015 (8) contra P.carotovorum. Los extractos 7 y 8 mostraron inhibición de las bacterias X. campestris y P. carotovorum respectivamente a la concentración de 5 µg/disc con diferencias significativas con concentraciones entre 300 y 500 µg/disc para la línea Nic 1061 y entre 400 y 500 µg/disc para la línea Nic 1015 (tabla 4).

Tabla 4 Efecto antibacteriano in vitro de diferentes concentraciones de extractos etanólicos de exudados foliares de tabaco (N. tabacum L.) de líneas seleccionadas por su actividad antibacteriana contra las bacterias fitopatógenas Xanthomonas campestris (Xc) y Pectobacterium carotovorum (Pc). La zona de inhibición se determina por el diámetro expresado en centímetros (cm) e incluye el diámetro del disco (0,7 cm). K: kanamicina como control positivo (500 μg). 

Medias con letras diferentes representan diferencias significativas entre concentraciones para cada línea de tabaco independiente (Anova de un factor y Tukey en un análisis estadístico realizado en SPSS para p≤0.05, n=6).

^{Shobha y Kale (2008)} encontraron extractos activos in vitro contra bacterias y hongos patógenos del suelo, entre ellos Xanthomonas campestris y Erwinia carotovora, pero a partir de preparaciones obtenidas de exudados de la lombriz de tierra Eudrilus Eugeniae.

Experimentos similares se llevaron a cabo por ^{Owoseni y Sangoyomi (2014)} en la búsqueda de solventes eficientes para obtener extractos de plantas activos contra la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum que afecta a miembros de la familia Solanaceae y mostraron extractos más activos in vitro a partir del cloroformo, seguido del metanol y el etanol con diámetros del halo de inhibición entre 0,8 y 1,5 cm.

^{Seo et al. (2012)} identificaron dos diterpenos naturales presentes en tabaco (esclareol y cisabienol) que inhibieron la enfermedad provocada por Ralstonia solanacearum en plantas de tabaco, tomate y Arabidopsis después de aplicado el producto a las raíces sin haber mostrado actividad antibacteriana. Lo que sugiere que es posible que los terpenos presentes en los extractos crudos estén involucrados en la respuesta antibacteriana pero según el mecanismo de acción estos podrían servir como inductores de defensa en la planta aun cuando no hayan mostrado una inhibición directa del crecimiento bacteriano.

La selección de candidatos para obtener extractos crudos que tengan efecto inhibitorio sobre las bacterias fitopatógenas de interés se basa como primer criterio, en que estos extractos etanólicos muestren un efecto inhibitorio in vitro de los patógenos. Otros criterios a tener en cuenta es que la planta, en el proceso de extracción, presente grandes rendimientos de los metabolitos en general, así como también algunos indicadores morfológicos que pudieran guardar relación con la síntesis del producto natural. Sin embargo, aun cuando el número de hojas es de los más bajos y los rendimientos son intermedios, según nuestros resultados para el control de P. carotovorum el extracto obtenido de la línea Nic 1015 se selecciona como candidato potencial por ser el único que mostró una evidente inhibición del crecimiento de la bacteria. Para el caso de X. campestris, cuatro extractos muestran similar efecto inhibitorio, por lo que este criterio en combinación con los resultados en número de hojas, y rendimiento, nos lleva a la selección de la línea Nic 1061 con mayor número de hojas y rendimiento intermedio. No obstante las líneas Nic 1019, BHmN y Nic 1016 también pueden considerarse como candidatos potenciales para la obtención de exudados foliares etanólicos en el control de X. campestris. Una combinación de un solo producto a partir de estos extractos seleccionados pudiera dar un buen resultado en el control de ambas bacterias.