Identificación de cultivares

Se emplearon un total de ocho cultivares de caña de azúcar de 7-9 meses de edad, de los más empleados en el Ecuador. Estos fueron previamente identificados mediante caracteres morfológicos: Ragnar, CC85-92, RD75-11, CR74-250, BJ70-46, C87-51, SP70-1143 y Mex64-1487. En este trabajo se confirmó la identificación mediante el empleo de isoenzimas peroxidasas, como describen ^{Arellano et al. (2012)}. Se escogieron hojas +3 de plantas adultas de cada cultivar empleada empleado y se maceraron en Nitrógeno líquido. Luego se añadió una solución que contenía sacarosa 20% y 0,025% dietil-ditiocarbamato de sodio (DECA). La electroforesis en condiciones nativas se realizó empleando un sistema de corrida vertical, usando un gel de separación de poliacrilamida de 8,5 %, con un tampón de corrida de Tris-Glicina 0,04 M a pH 8,3. El método de tinción se basó en el empleo de o-dianisidina, en presencia del sustrato peróxido de hidrógeno.

Primera etapa de saneamiento del material vegetal

El material vegetal procedente de los cultivares de la caña de azúcar empleados en este trabajo estaba vigoroso y sin síntomas visibles de las principales enfermedades. Las estacas, con yemas laterales del tercio medio del tallo, se cortaron empleando herramientas desinfectadas con alcohol etílico al 70% y se lavaron cuidadosamente con agua corriente y detergente, sin afectar la integridad de las yemas laterales. Estas yemas se colocaron en un baño de agua caliente a 52 °C por 2 h. Después de realizar la hidrotermoterapia, las yemas se colocaron esta vez en un baño de agua helada para detener el tratamiento y puestas en una solución del fungicida vitavax® 2 g.L^-1 para su desinfección. Luego de 20-25 min las yemas se incubaron a 37 °C por 12-15 días para su germinación, cubiertas con gasa y algodón humedecidos. El mantenimiento se realizó cada 48 h. Las yemas germinadas se sembraron en pequeñas fundas plásticas negras que contenían un sustrato estéril compuesto por tierra- cascarilla de arroz (tamo)-cachaza- arena en las proporciones 2:1:1:1. Luego se aplicó formol al 2% durante 15 días, aplicando posteriormente el riego diario a este material. Estas yemas germinadas en condiciones controladas se trataron con el fungicida oxicloruro de cobre 2,5 g.L^-1 junto al bactericida sulfato de cobre 0,5 mg.L^-1 una vez por semana.

Segunda etapa de saneamiento de plantas de caña de azúcar y establecimiento del cultivo in vitro

A los 3-4 meses después de haber sembrado las yemas saneadas en el invernadero, los verticilos apicales de las plantas que poseían 2-3 nudos visibles, se emplearon para la obtención de los meristemos apicales. Para ello se realizó la desinfección del cogollo y los meristemos apicales cubiertos con 2-3 hojas primordiales inmaduras (generalmente de color amarillento), de un tamaño de hasta 4 mm de altura y 1-2 mm de base, se extrajeron y colocaron en tubos de ensayo que contenían 10 ml de agua estéril calentada a 51 °C. Diez minutos después, la hidrotermoterapia de los meristemos se interrumpió bruscamente y se colocaron los tubos con los meristemos en agua fría a 4 °C con agitación. Las condiciones asépticas en el medio de establecimiento se mantuvieron en presencia de 0,2 mg.^L-1 de 6-benzyl-aminopurina (BAP), donde permanecieron de 15 a 20 días a temperatura de 26-28 °C y 6000 lux de iluminación. Posteriormente, los cultivos se re-sembraron en el medio de multiplicación en presencia de BAP hasta lograr su establecimiento. Esta hormona solamente se añadió en la etapa de multiplicación.

Tercera etapa de saneamiento de diferentes cultivares de caña de azúcar

Una vez establecido el cultivo, las vitroplántulas se resembraron en el medio de propagación en presencia del antibiótico gentamicina 50 mg.L^-1, donde permanecieron durante 7 días. Luego las plantas se resembraron en el medio de enraizamiento en presencia de altas concentraciones (20-30 g.L^-1) de sacarosa y ácido 3-indol acético (AIA) (1-6 mg.L^-1), eliminando las que mostraron hojas amarillentas provocadas por efecto del antibiótico y que no presentaban buenas características después del tratamiento. Las vitroplantas propagadas después de la segunda etapa de tratamiento se utilizaron para la extracción de micromeristemos, los cuales tenían dimensiones entre 0,5 a 0,8 mm bajo el microscopio estereoscópico. Una vez obtenida la cantidad de plantas necesarias, se procedió al enraizamiento y pase a fase I de aclimatización (invernadero). En todos los casos, los medios de cultivo sintéticos empleados tuvieron como base el medio descrito por ^{Murashige y Skoog (1962)}, con las modificaciones descritas por ^{Korneva et al. (1986)}.

Aunque se partió de plantas sanas sin síntomas evidentes de enfermedad, en cada etapa de saneamiento se evaluó la presencia de la enfermedad "raquitismo de los retoños" (RSD), en las plantas usadas como material de partida de las yemas y posteriormente en las plantas adultas obtenidas por meristemos derivadas de estos tratamientos. El análisis de confirmación empleado para el diagnóstico de la enfermedad "raquitismo de los retoños" fue el método presuntivo previamente descrito en la literatura, basado en la transpiración del tejido vegetal y el conteo de haces vasculares funcionales y no funcionales (^{Chagas y Tokeshi, 1994}). Para ello se tomaron al azar 10 tallos adultos por réplica de cada plantón seleccionado del cultivar en estudio y se cortaron a nivel del suelo, dejando las hojas fisiológicamente activas de cada variedad a evaluar. Para la tinción de los haces vasculares los tallos se sumergieron en una solución de safranina (1,25% p/v) durante una hora y después se retiraron y dejaron secar. A partir del segundo entrenudo basal se sacaron láminas (rodajas) de 10 mm de diámetro, que se dejaron secar a temperatura ambiente. Luego se observaron en un estéreo-microscopio marca Boeco para el conteo de los haces funcionales y no funcionales, los cuales se identificaron por la presencia de una coloración rojiza o parda, respectivamente. También se usó un microscopio óptico Fischer Scientific modelo Micromaster con cámara acoplada y un objetivo con 40 aumentos para el conteo de los haces vasculares funcionales y no funcionales. Con esos resultados se calculó el porcentaje de vasos funcionales (VF) y no funcionales (VNF) según ^{Harrison y Davis (1988)}, según la ecuación: % VF= VF/VT x 100% y VNF= VNF/VT x 100%, donde VT es el total de vasos evaluados.

Adicionalmente, se determinó la presencia de síntomas correspondientes a la enfermedad sistémica escaldadura foliar, causada por la bacteria Xanthomonas albilineans Ashby (Dowson).

Para la creación del banco de ADN, se llevó a cabo la extracción del material genético de acuerdo a lo descrito por Doyle y Doyle en 1983.

Saneamiento y multiplicación de variedades de caña de azúcar destinadas para el establecimiento del banco germoplasma certificado

Con relación al saneamiento, durante el mantenimiento de las yemas tratadas, éstas se observaron detenidamente y se eliminaron los hongos que crecieron sobre la superficie, mediante el uso de algodón humedecido con alcohol. La gasa húmeda usada como soporte de las yemas, permitió mantener la humedad relativa del sistema. El lavado de las yemas laterales del tercio medio del tallo presente en las estacas, permitió un elevado nivel de desinfección sin afectar la integridad de dichas yemas. Los tratamientos semanales con el fungicida oxicloruro de cobre junto al bactericida sulfato de cobre, permitieron también estos altos índices de desinfección.

Las yemas sembradas en el sustrato estéril, mostraron diferentes porcentajes de germinación (tabla 1). Se observa que los porcentajes de germinación van desde 59,6% para el cultivar Mex64-1487 hasta 79% para CC85-92 y 95,8% para C87-51. Se conoce que los aumentos de la temperatura de tratamiento provocan disminución de la germinación de las yemas y la supervivencia de las plantas, pero trabajar a temperaturas inferiores no favorece el proceso de desinfección y saneamiento. Varios autores no lograron germinación de las yemas a los tratamientos de 50,5 °C durante 3 h (^{Chagas y Tokeshi, 1994}). ^{Pérez et al., (1998)} informaron entre 30-44 % de germinación utilizando un tratamiento de 50,5 °C por 2 h sobre propágulos de una yema de diferentes tamaños y en diversos cultivares. ^{Chinea y Pérez (1997)} obtuvieron 30% de germinación después de aplicar similar tratamiento a yemas individuales. ^{Pérez y Mauri (1986)} solo alcanzaron un 20% de brotación de yemas tratadas a 50 °C durante 2 h. En ese sentido, los resultados de este trabajo mostraron valores de mortalidad mucho más bajos que los informados con anterioridad. Con respecto al saneamiento, no se observó la presencia de síntomas de RSD.

Tabla1. Porcentaje de germinación de los cultivares de caña de azúcar en estudio luego del tratamiento térmico a 52 oC 

El principal objeto de saneamiento en la caña de azúcar en el Ecuador es la eliminación de la bacteria L. xyli ssp. xyli, aunque se ha descrito una disminución de esta enfermedad en el país (^{CINCAE, 2011}). El diagnóstico, basado en el método presuntivo de tinción de los haces vasculares, descrito previamente por ^{Chagas y Tokeshi (1994)}, es menos efectivo que otros informados, pero es de fácil desarrollo para un diagnóstico rápido. Aunque en muchos de los trabajos citados se partió de material enfermo para confirmar el saneamiento, en nuestro caso las plantas empleadas se encontraban vigorosas y libres de síntomas (figura 2). Es necesario mencionar que la metodología empleada no es la más moderna ni sensible para la detección de la bacteria. Por ello, puede haber falsos negativos dados por ejemplo por las bajas concentraciones bacterianas

Figura 2 Haces vasculares funcionales (sanos) del cultivar de caña de azúcar CC85-92. Obsérvese la coloración rojiza correspondiente a la tinción empleada. En la parte inferior izquierda la flecha indica un vaso dañado. 

Varios trabajos sobre esta temática realizaron el diagnóstico basado en el análisis dotblot y por inmuno-fluorescencia indirecta (IFI). ^{Hernández et al., (1997)} detectaron presencia de RSD, por lo que el tratamiento térmico no resultó efectivo en ningún caso para la eliminación de L. xyli. ^{Ramallo y de Ramallo (2001)} coincidieron con esos informes, donde no lograron saneamiento a RSD con el tratamiento hidrotérmico a 50,5°C durante 2h, aplicado a propágulos de una yema, aunque lograron la atenuación de la bacteria. Resultados similares obtuvieron ^{Pérez et al., (1998)}, quienes no consiguieron erradicar el patógeno empleando igual tratamiento, aunque si se disminuyó la concentración de células de la bacteria. Algunos de estos tratamientos no resultaron efectivos debido a diversas causas. ^{Iglesia et al. (2007a)} observaron dispersión en los datos de las diferentes determinaciones de cada variedad lo que podía atribuirse a la respuesta individual de cada planta y según el genotipo empleado. Esto obliga a que las evaluaciones abarquen un número superior de muestras, que las establecidas. Otra causa podía ser el número insuficiente de tratamientos. Algunos autores han planteado la necesidad de realizar como mínimo tres tratamientos sucesivos de hidrotermoterapia a semilla comercial, además de aplicar las medidas de control adecuadas, para poder controlar eficientemente el RSD. Se ha determinado también que un solo tratamiento no logra la inactivación total del organismo causal de la enfermedad (^{Chinea y Pérez, 1997}; ^{Piñón, 2001}). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que tratamientos sucesivos también disminuyen el porcentaje de germinación de las yemas.

En el presente trabajo, aunque no fue un objetivo esencial, tampoco se detectaron síntomas de la enfermedad sistémica Escaldadura foliar, causada por la bacteria Xanthomonas albilineans Ashby (Dowson). Hay que destacar que el cultivar CC85-92, uno de los de más rápido crecimiento entre los cañicultores en el Ecuador, es susceptible a esta enfermedad. Por tanto, la aplicación de estas técnicas de saneamiento, en combinación con la aplicación de la micropropagación acelerada mediante cultivo in vitro de meristemos, ^{Arellano et al., (2009)} evidencian una disminución de la incidencia de estas dos enfermedades bacterianas sistémicas.

Segunda etapa de saneamiento de plantas de caña de azúcar y establecimiento de cultivo in vitro

El saneamiento de los verticilos apicales de plantas de 3- 4 meses provenientes de las yemas saneadas en el invernadero, se muestra en la tabla 2. La tabla muestra el número de meristemos a los que se les realizó termoterapia, de estos los que sobrevivieron al salir de P0 y su porcentaje, luego los que pasaron a P1 y sobrevivieron y finalmente en P2 el total de brotes obtenidos. Puede apreciarse que los porcentajes de supervivencia van desde 65,6% para el cultivar Mex64-1467 hasta 96% para C87-51 en el primer pase. Este comportamiento evidencia la dependencia del cultivar con relación a la supervivencia.

Tabla 2 Tratamiento térmico a meristemos de los cultivares de caña de azúcar en estudio provenientes de las yemas tratadas. 

En las técnicas de cultivo in vitro de tejido, la mayor pérdida del material vegetal ocurre en los primeros pases P0 y P1 por el establecimiento del cultivo. A partir de P2 esto disminuye, pues la planta se ha formado completamente. Por esa razón se evaluó el porcentaje de sobrevivencia en P0 y P1.

A pesar de los controles en las condiciones experimentales, no fue posible disminuir las pérdidas ocasionadas en esta etapa. Las excesivas manipulaciones del material vegetal (manejo de instrumentos, calor excesivo, corte inadecuado del meristemo) pudieran ser algunas de las causas de las pérdidas. Estas pérdidas en la supervivencia no pueden vincularse a una reducción de la masa seca, la cual está asociada a la presencia de brotes hiperhídricos. Según ^{Kevers et al. (2004)}, la hiperhidricidad implica problemas de diferenciación celular, por lo que los brotes no pueden tener un desarrollo morfo-fisiológico normal. Este fenómeno que no ha sido dilucidado completamente ha sido descrito como un desorden multicausal (^{Quiala et al., 2012}).

El cultivar Mex64-1467, que durante el tratamiento prolongado a 51 °C resultó el de más bajo porcentaje de germinación, mostró también los menores porcentajes de supervivencia.

Debe señalarse que la utilización de 6-BAP en el medio de establecimiento facilitó el incremento del número de brotes a pesar de la aplicación del tratamiento térmico prolongado. El 6-BAP ha sido utilizado con éxito para estimular la proliferación de brotes en diferentes protocolos de cultivo in vitro de otros cereales (^{Martínez-Medina et al., 2012}; Medina et al., 2012; ^{Syamala y Devi, 2003}).

Tercera etapa de saneamiento de diferentes cultivares de caña de azúcar

El siguiente paso de resiembra de las plantas en el medio de propagación en presencia de 50 mg.L^-1 del antibiótico gentamicina, permitió incrementar el número de brotes, el número de plantas saneadas y consecuentemente, el número de plantas en fase de enraizamiento (tabla 3). La inclusión de este antibiótico de amplio espectro, facilitó la disminución de la contaminación exógena. En estas condiciones de trabajo, este paso conlleva el empleo de antibióticos y el uso de micromeristemos como un tercer tratamiento. La tabla muestra el incremento en el número de plantas en los sucesivos pases, desde P3 hasta P6, que alcanzaron hasta miles de plantas saneadas y enraizadas.

Tabla 3 Tratamiento con antibiótico y número de plantas saneadas de los cultivares de caña de azúcar en estudio 

Como ya se ha referido antes, en estos experimentos se partió de material libre de enfermedades, o al menos sin síntomas visuales de las mismas. En estas circunstancias resulta difícil referirse a saneamiento si se parte de plantas de apariencia sana y vigorosa, pero la idea inicial era garantizar la creación de un banco de germoplasma listo para utilizarse como semilla básica de forma inmediata.

El empleo de ápices meristemáticos ha sido empleado para la micropropagación de la caña de azúcar. ^{Victoria et al. (1998)} lograron eliminar a la bacteria causante del Raquitismo al utilizar tratamientos combinados de hidrotermoterapia previo al cultivo de meristemos. Similares resultados obtuvieron ^{Peteira et al. (1992)} quienes alcanzaron entre 96-100% de saneamiento al combinar el cultivo de ápices con termoterapia (50º C durante 10 minutos). El empleo de sistemas combinados ha logrado la eliminación del RSD y también de otros patógenos sistémicos de la caña de azúcar, como la bacteria causante de la escaldadura foliar y el Virus del mosaico de la caña de azúcar (^{Matsuoka et al., 1988}; ^{Sordi y Tokeshi, 1988}; ^{Matos, 2002}; ^{McGuire et al., 2009}).

Con respecto al diagnóstico, aunque el método empleado fue el de tinción de los haces vasculares (STM) descrito por ^{Chagas y Tokeshi (1994)}, hay que señalar que su carácter presuntivo permite facilitar el análisis y elevar los volúmenes de muestras por su relativa simplicidad, pero puede provocar confusión con otras patologías. El método ha sido previamente empleado como una alternativa inicial a los trabajos de diagnóstico (^{Iglesia et al., 2007a}) y a pesar de la falta de precisión dada por la inespecificidad de los síntomas de esta enfermedad, lo simple del método facilita su realización, ejecución directa en el campo, así como la poca necesidad de equipamiento para el conteo de los haces funcionales y no funcionales. A la vez permite disponer de una escala para interpretar los resultados.

Una posibilidad que brindan los bancos de germoplasma es conservar y mover material de alta calidad fitosanitaria. La utilización de termoterapia junto a la desinfección del material de trabajo, es una práctica antigua pero muy eficiente para erradicar patógenos que se mueven de forma sistémica a través del vegetal. En el caso de trabajar con meristemos in vitro, su pequeño tamaño y su velocidad de propagación disminuyen extraordinariamente la probabilidad de desarrollo de esos patógenos sistémicos, bacterias o virus principalmente. Unido a esto, se conoce de la existencia de sustancias que actúan impidiendo el desarrollo de patógenos, en particular la presencia de guanina, que según estudios realizados, parece tener una acción antimicrobiana (^{Shuravlev, 1979}).

La preservación de los recursos fitogenéticos entendidos éstos como el material hereditario con valor económico, científico o social contenido en las especies, es de importancia capital en la lucha contra diferentes calamidades, como el hambre, la malnutrición mundial, pero también el decaimiento genético de los cultivos y la pérdida de diversidad genética. Es aquí donde juegan un papel importante los bancos de germoplasma y de genes. Los bancos de germoplasma resguardan la fuente de variabilidad requerida por los mejoradores de plantas para el desarrollo de cultivares que permitan al agricultor superar las limitaciones naturales a fin de obtener mayores beneficios de su actividad, así como asegurar la fuente contra la erosión genética (^{Demey, 2008}). Los estudios de la diversidad genética dentro de estos bancos de genes son una de las herramientas que ayudan a tener un control más efectivo sobre la erosión genética. Permiten definir los patrones de variación que determinan la incorporación de individuos a programas de mejoramiento genético, ya sea por sus características promisorias o por susceptibilidad a condiciones bióticas o abióticas, facilitando la incorporación de genes y el establecimiento de la mejor estrategia reproductiva. Esto garantiza la elevada calidad genética.

Un importante aspecto que se debe también señalar como resultado de este trabajo es el mantenimiento de un Banco de germoplasma in vitro con las variedades que hay en el banco in situ en el campo. Aunque no se muestran detalles en este trabajo, como complemento de ésto, el genofondo se conservó a través del mantenimiento del ADN a temperaturas de -20 ^oC durante tiempos prolongados. Esta creación de los bancos in vitro y del "banco de ADN" permite conservar el material genético en espacios muy reducidos, durante largos periodos con independencia de las condiciones ambientales.

Finalmente, se propone una metodología de obtención de material agámico de caña de azúcar, donde se combinan el tratamiento hidrotérmico con el cultivo de yemas mediante la micropropagación de meristemos en diferentes etapas. Esta propuesta de metodología esta fundamentalmente dirigida a la enfermedad bacteriana sistémica de la caña de azúcar RSD (Leifsonia xyli ssp. xyli Davis), aunque puede favorecer la disminución de otras enfermedades sistémicas del cultivo como la LSD (Xanthomonas albilineans Ashby Dowson), que se está presentando con frecuencia en un cultivar en crecimiento en el Ecuador como es CC85-92, así como la enfermedad viral Mosaico de la caña de azúcar (VMCA). Con relación al método de confirmación del saneamiento, éste constituye el primer acercamiento, pues debe completarse con el análisis basado en los métodos moleculares (PCR) para ambas enfermedades bacterianas. Estos resultados están en fase de complementación con el método molecular basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con el empleo de cebadores específicos de la bacteria Leifsonia xyli spp. xyli y con el método inmunoquímico ELISA. En la actualidad estos métodos son los más empleados y poseen una alta eficiencia de detección (^{Iglesia et al., 2007b}; ^{Taher-Khani, 2010}). Partir de un material vigoroso y al parecer libre de la enfermedad, dificultó la certeza de si efectivamente el saneamiento se llevó a cabo. Sin embargo, la no aparición de los síntomas confirmó la limpieza del material, aun cuando se empleó el método presuntivo de tinción de los vasos no funcionales.

Con relación a la micropropagación, es conocida la condición de rejuvenecimiento fisiológico que introduce y que ha sido descrita desde los primeros trabajos de propagación in vitro de meristemos.

Todos estos datos constituyen importante información para lograr un manejo adecuado en la utilización de los recursos fitogenéticos de la caña de azúcar.

Además de lo anterior, este trabajo puede constituir una estrategia para prevenir o disminuir la diseminación de estas enfermedades sistémicas, mediante la entrega a los Cañicultores de semilla de alta calidad fitosanitaria y genéticamente bien identificada, como la obtenida por estos procedimientos. De igual forma, esta semilla puede constituir un material idóneo para el intercambio genético entre países.

Recomendaciones

Se recomienda completar con métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con el empleo de cebadores específicos para la bacteria L. xyli spp. xyli, asi como el método inmunoquímico ELISA, que son los más empleados y de mayor eficiencia de detección