Pruebas de antagonismo

Se utilizaron las cepas nativas Burkholderia cepacia, Pseudomonas sp, Pseudomonas luteola y Pantoea sp. aisladas de suelos rizosféricos de zonas cultivables del departamento de Córdoba - Colombia, que demostraron ser eficientes en su capacidad de solubilizar fosfato y que pertenecen al Banco de cepas del laboratorio de Biotecnología GRUBIODEQ (Universidad de Córdoba) (^{Lara et al., 2011}). Las cepas fueron sometidas a pruebas de antagonismo con el fin de verificar que no existiera inhibición entre ellas y así poder formar los consorcios; las pruebas de antagonismo se realizaron en el agar Mueller Hinton, mediante la técnica de difusión en agar (^{Beltrán et al., 2005}). El criterio de eliminación de cepas se determinó por la presencia de halos de inhibición de crecimiento con diámetros mayores a 5 mm entre la cepa sembrada masivamente y la cepa enfrentada (^{Barragán et al., 2003}).

Pruebas cualitativas y cuantitativas

Para la realización de las pruebas cualitativas y cuantitativas se fabricaron biopreparados de cada cepa, empleando Erlenmeyers de 100 mL que contenían 45 mL de medio de cultivo estéril y teniendo en cuenta las condiciones de crecimiento microbiano: temperatura ambiente (28±2°C), tiempo de incubación de 12 -18 horas y agitación constante de 150 rpm. Se produjeron biopreparados de concentraciones de 10⁸,10⁷ y 10⁶ UFC/mL, las cuales fueron cuantificadas a través de diluciones seriadas por la técnica de microgota (^{Moreno et al., 2000}). Posteriormente se procedió a realizar la evaluación cualitativa y cuantitativa de la capacidad solubilizadora de fosfato de las cepas nativas individual, como en consorcio, a concentraciones 10⁸, 10⁷ y 10⁶ UFC/mL; los consorcios se formaron con las cepas aisladas que no presentaron ningún efecto antagonista a concentraciones iguales.

Evaluación cualitativa de la solubilización de fosfato

A los biopreparados elaborados con cepas puras por individual y en consorcios, se les determinó en medio NBRIP (^{Nautiyal, 1999}), la capacidad cualitativa de solubilización de fosfatos que presentaban los microorganismos a concentraciones de 10⁸,10⁷ y 10⁶ UFC/mL. Las cajas de NBRIP luego de ser inoculadas por la técnica de pozos, con cada una de las cepas puras y con el consorcio bacteriano, se incubaron a 28 °C durante 14 días hasta la aparición de halos claros alrededor de las UFC solubilizadoras de fosfato. El tamaño de los halos se calculó según el índice de solubilización: IS=A/B (A: diámetro de la colonia + diámetro del halo y B: diámetro de la colonia) (^{Kumar y Narula, 1999}) las mediciones se realizaron a los 7 y 14 días respectivamente después de la inoculación con el fin de evaluar el comportamiento de las cepas a través del tiempo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Evaluación cuantitativa de la solubilización de fosfato

La capacidad cuantitativa de solubilización de fosfato se determinó en medio NBRIP (Liquido), se utilizó el método colorimétrico ácido vanadomolibdofosforico (^{Kitson y Mellon, 1944}) basado en una solución diluida de ortofosfato, el molibdato amónico reacciona en condiciones ácidas para formar un heteropoliácido, ácido molibdofosfórico. En presencia de vanadio forma ácido vanadomolibdofosfórico amarillo, la intensidad del color amarillo es proporcional a la concentración de fosfatos. Por éste método se evalúan bacterias que poseen capacidad de solubilizar componentes fosfatados inorgánicos insolubles, como el fosfato tricalcico, fosfato dicalcico y hidroxiapatitas. Para esta prueba se tomó 1 mL de biopreparado y se adiciono a 9 mL de medio NBRIP estéril, se incubó por 72 h a temperatura ambiente (28±2 °C), en agitación constante a 150 rpm; trascurrido este tiempo, se tomó el sobrenadante, se aplicó el reactivo (vanadomolibdato) y se leyó la absorbancia a la longitud de onda de 440nm utilizando un espectrofotómetro Genesys 20 Vis (Thermo Fisher Scientific Inc.) y empleando la curva de calibrado y = 0,0059x + 0,0037, R² = 0,9912, estandarizada por el equipo de investigación del Laboratorio GRUBIODEQ. Se determinaron las concentraciones en ppm. Como blanco se tomó únicamente el medio NBRIP y se realizó todo el proceso Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Evaluación del efecto de los bioinoculantes en plantas de pasto Angleton (Dichantium aristatum)

Una vez seleccionados los microorganismos o consorcios eficientes, se sembraron por la técnica de estría masiva en agar nutritivo y se incubaron durante 24 h a 36 °C. Los bioinoculantes se produjeron en Erlenmeyer de 100 mL con 30 mL de caldo nutritivo estéril, cada Erlenmeyer se inoculó con los microrganismo eficientes y se incubo a temperatura ambiente (28±2 °C), manteniendo una agitación constante de 150 rpm en un shaker por un período de 24 h; con el fin confirmar la concentración celular en cada bioinoculante se evaluó el crecimiento por el método de diluciones seriadas, al final del proceso; todos los ensayos se realizaron por triplicado (^{Seeley et al., 1973}). De esta forma se ajustaron los inoculantes a la concentración que presentaron mayor rendimiento en la solubilización de fosfato.

Para realizar el experimento se utilizó semillas de pasto Angleton (Dichantium aristatum) desinfectadas con etanol al 70% durante 5 min. y luego con solución de hipoclorito de sodio 3% durante 5 min.; las semillas fueron inmersas en los bioinoculantes durante 60 min. y fueron evaluadas bajo condiciones controladas de vivero, para esto se utilizó un diseño completamente al azar (DCA) con tres tratamientos y cinco repeticiones, que consistieron en:

Tratamiento 1 (control): Semillas sin ningún tipo de tratamiento.

Tratamiento 2: Semillas tratadas con el bioinoculante en la concentración más eficaz y sin fertilización química.

Tratamiento 3: Semillas tratadas con fertilizantes químicos comerciales Fosfato diamonico (DAP) y Urea.

El suelo utilizado presentó las siguientes características: MO= 1.38%; P= 7,5 ppm, DA= 1.5 g/cm³ y K= 0.88 meq/ 100g) y la fertilización química se realizó de acuerdo al análisis de suelo y los requerimientos nutricionales para el pasto angletón (N: 230; P: 53; K: 252 ha/año). De acuerdo a lo anterior al tratamiento con fertilizante químico se le aplico 0,9 g/recp de urea y 0,0144g/recp de DAP a los 8 días después de la siembra (DDS). El experimento se desarrolló en macetas de 0.045 m² de área.

Se utilizaron 2 g de semillas para cada maceta, las cuales fueron sembradas al voleo a 1 cm de profundidad y esparcidas aleatoriamente por toda la superficie de la maceta. El ensayo se desarrolló en predios de la Universidad de Córdoba, (3 Km. vía Montería-Cereté), en un vivero del departamento de Ingeniería Agronómica, con una temperatura promedio de 29 °C, presión atmosférica de 756.96 mm y humedad relativa de 79 %; el suelo utilizado fue de textura arcillosa tomado de zonas sin cultivar de previos de la Universidad de Córdoba (^{Degiovanni et al., 2004}). No se utilizó ningún tipo de plaguicida. Se realizaron mediciones a los 21 y 35 días después de la germinación, en cada muestreo se recogieron 3 plantas al azar de cada repetición, las variables a tener en cuenta fueron los siguientes parámetros biométricos (^{Hernandez, 2002} y ^{Ramirez y Perez, 2006}): a) número de hojas (No.): conteo de las hojas cotiledonales y verdaderas fotosintéticamente activas en las diferentes plantas; b) área foliar (cm²): se midió tomando como referencia las cuadrículas de hojas de papel milimetrado en cada una de las hojas cotiledonales de las plantas muestreadas; c) longitud de la planta (cm): se tomó en cuenta la medida desde la raíz hasta la hoja más larga de cada una de las plantas muestreadas; d) longitud de la raíz (cm): medición de la raíz principal de cada planta muestreada; e) peso seco (g): se llevaron a secado en estufa a 60 °C hasta alcanzar peso seco constante, una vez secas se determinó su peso. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Análisis estadístico

Se realizó la evaluación de los datos obtenidos de los parámetros biométricos de las plantas de pasto Angleton en el paquete estadístico SAS 9.2 (SAS, 2010), se empleó un diseño completamente al azar y las medias se compararon mediante contrastes ortogonales en el mismo software; se consideró P<0.05 y P<0.01 como diferencias significativa y altamente significativa, respectivamente. También se aplicó la prueba de Tukey.

Prueba de Antagonismo

Al realizar la lectura no se evidenció antagonismo por parte de ninguna de las cepas, ya que se desarrollaron sin inhibir el crecimiento entre ellas. Lo anterior indica que no existe ningún tipo de antibiosis, competencia por espacio o por nutrientes, interacciones directas con el patógeno (Lisis enzimática) que impidan el libre desarrollo de los microorganismos.

Evaluación cualitativa de la capacidad solubilizadora de fosfato

Las mediciones de la capacidad cualitativa de solubilización de fosfato realizada a los 7 y 14 días de forma individual y en consorcios, se muestran en la tabla 1 y tabla 2.

Tabla 1 Promedio de índices de solubilización a los 7 días. 

1.Burkholderia cepacia, 2. Pantoea sp, 3.Pseudomona luteola, 4. Pseudomona sp, Índices de solubilización (IS), Diámetros totales promedios de las colonias (DT), a. Medias aritméticas ± desviación estándar de experimentos por triplicado. Los valores seguidos con letras superíndices distintas indican diferencias significativas (p < 0,05) según tukey.

Tabla 2 Valores promedio de índices de solubilización a los 14 días. 

1.Burkholderia cepacia, 2. Pantoea sp, 3.Pseudomona luteola, 4. Pseudomona sp, Índices de solubilización (IS), Diámetros totales promedios de las colonias (DT), a. Medias aritméticas ± desviación estándar de experimentos por triplicado. Los valores seguidos con letras superíndices distintas indican diferencias significativas (p < 0,05) según tukey.

A los 7 días del ensayo se observaron que los valores promedios de los índices de solubilización oscilaron entre 2,3 a 4,8 mm (tabla 1). En esta etapa se destacaron los consorcio Burkholderia cepacia + Pantoea sp + Pseudomona sp a la concentración 10⁸ UFC/mL, Pseudomona luteola + Pseudomona sp a la concentración 10⁷ UFC/mL y Burkholderia cepacia + Pantoea sp a la concentración 10⁶ UFC/mL; lo anterior demuestra que la formación de consorcio representa una mayor solubilización que de forma individual, superando a lo encontrado por ^{Lara et al. (2011}a) con IS de 4,0 mm y similares a los encontrados por ^{Bobadilla y Rincón (2008)} con IS entre 3,3 - 5 mm.

En la tabla 2 se resumen los valores promedio de los índices de solubilización de las cepas individual y en consorcio a los 14 días de ensayo; los valores oscilaron entre 5,6 a 2,1 mm.

A los 14 días se observó una tendencia similar de las cepas individuales y en combinación, al obtenido durante los 7 días; se destacaron nuevamente los consorcios y, entre ellos, Pantoea sp + Pseudomona luteola, Pantoea sp + Pseudomona sp y Pantoea sp + Pseudomona luteola + Pseudomona sp; este último presentó los valores más altos en los índices de solubilización con 5,6 mm, resultados que superan a los encontrados por ^{Guzmán (2012)} en donde el mayor índice de solubilización a los 14 días fue de 5,05.

Los resultados de la prueba demostraron que los índices de solubilización de fosfato de algunos consorcios fue mayor en comparación con los IS de las cepas individuales, demostrándose un efecto sinérgico favorable.

Evaluación cuantitativa de la capacidad solubilizadora de fosfato

Los datos obtenidos de la evaluación cuantitativa de la capacidad solubilizadora de fosfato de las cepas nativas, utilizando el método colorimétrico vanadomolibdofosforico se resumen en la tabla 3; se observan valores entre 117 y 842 ppm.

Tabla 3 Promedios de concentraciones en partes por millón (ppm) de solubilización de fosfato. 

1. Burkholderia cepacia, 2. Pantoea sp, 3.Pseudomona luteola, 4. Pseudomona sp, Concentración en partes por millón ([] en PPM), a. Medias aritméticas ± desviación estándar de experimentos por triplicado. Los valores seguidos con letras superíndices distintas indican diferencias significativas (p < 0,05) según tukey.

Los microorganismos en consorcios presentaron mayor solubilización de fosfato que aquellos que se encontraban por individual debido a que los consorcios microbianos en muchos casos interactúan de manera sinérgica estimulando algunas actividades físicas o bioquímicas de las bacterias involucradas en las mezclas; la concentración a la cual presentaron mayor eficiencia fue a 10⁸ UFC/ml, destacándose el consorcio conformado por Pantoea sp + Pseudomona sp, además este mismo mostró buenos resultados en las concentraciones de 10⁷ y 10⁶ UFC/ml; también en esta etapa se destacó el consorcio formado por Burkholderia cepacia, + Pantoea sp a la concentración de 10⁷ UFC/ml.

Los anteriores resultados superan a los encontrados por ^{Cordero et al., (2008)} en la evaluación de una cepa de Pantoea sp. (9C) la cual presentó solubilización de aproximadamente 400 μg P mL-1 entre las 40 - 60 horas. Igualmente superaron a estudios realizados por ^{Osorio y Lara (2013)} que evaluaron consorcios formados por Pantoea sp y Azotobacter sp obteniendo resultados 602.60 ppm a la concentración de 10⁶ UFC/ml.

Los resultados de la evaluación cuantitativa confirmaron que el consorcio formado por Pantoea sp + Pseudomona sp a la concentración 10⁸ UFC/mL fue el mejor corroborando los resultados obtenidos en la evaluación cualitativa. Por lo anterior el consorcio fue escogido para el ensayo siguiente.

Ensayos en semillas de pastos angleton (Dichantium aristatum)

La tabla 4 muestra los resultados promedios de los parámetros biométricos medidos, correspondientes a, cantidad de hojas, longitud de la planta, área foliar, longitud de raíz principal y peso seco para los diferentes tratamientos:

Tabla 4 Efecto de los bioinoculantes en el crecimiento y desarrollo de plantas de pasto angletón (Dichantium aristatum). 

^A,B Letras iguales no presentan diferencias significativas, con un alfa de 0.05. Los datos representan el promedio de 5 repeticiones. Las comparaciones estadísticas fueron realizadas de forma independiente para cada tiempo en las diferentes variables. Tratamiento 1 (control): Semillas sin ningún tipo de tratamiento; Tratamiento 2: Semillas tratadas con el consocio Pantoea sp + Pseudomona sp a la concentración 108 UFC/mL; Tratamiento 3: Semillas tratadas con fertilizantes comerciales fosfato diamonico (DAP) y Urea.

Longitud de la planta (cm). Estadísticamente no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, durante los días 21 y 35; sin embargo se evidenció mayor longitud para T3 y T2 (45y 38 cm respectivamente) en comparación con T1. El tratamiento T2 ( consorcio) mostró un valor más alto que el testigo (T1) lo cual puede ser debido a la disponibilidad del fósforo proporcionado por el consorcio teniendo en cuenta que éste nutriente es esencial para el desarrollo y crecimiento de las plantas (^{Coyne, 2000}); también es posible que las cepas puedan producir fitohormonas de crecimiento vegetal favoreciendo el crecimiento de la planta puesto que dentro de los géneros bacterianos que han sido reportados como productores de AIA, se encuentra Pseudomonas sp. (Ahmad et al,. 2006). Los datos obtenidos están en concordancia con las investigaciones realizadas por ^{Rajkumar et al. (2006)} quienes reportan incremento en la longitud de las plantas de mostaza inoculadas con Pseudomonas sp y Bacillus sp en comparación con las plantas no inoculadas; similares resultados se obtuvieron en el trabajo de ^{Galvis y Lara (2013)} utilizando plantas de pasto Angleton.

Cantidad de hojas (No.). Para esta variable biométrica a los 21 dias, se observaron los mejores resultados promedios para el T3 mostrando diferencias significativas (P<0,05); estos datos pueden atribuirse a una mayor disponibilidad de nutrientes proporcionada por la fertilización química. A los 35 dias no se presentó diferencias significativas entre los resultados promedios de los tratamientos lo que concuerda con estudios realizados por ^{Pastor y Lara (2013)} quienes, para la variable número de hojas en pasto Angleton no encontraron diferencias significativas en ninguna de las mediciones realizadas.

Área Foliar (cm²). Se evidenció mayor área foliar en los tratamientos T3 y T2 en comparación con el tratamiento T1, obteniéndose una diferencia altamente significativa (P<0.01) a los 35 días; ésta característica incide en una mejor capacidad fotosintética de las plantas, que redunda en un mayor crecimiento y mayor desarrollo de su parte aérea (^{Mayak et al., 2004}; ^{Santillana, 2006}). Investigaciones realizadas por ^{Ahmad et al. (2013)} han encontrado correlación entre el incremento del área foliar por la co-inoculación de rizobacterias de los géneros Rhizobium y Pseudomonas y el aumento del contenido de clorofila en plantas de fríjol chino (Vigna radiata L.).

Es importante resaltar que el efecto del tratamiento inoculado (T2) sobre el área foliar fue similar al tratamiento con fertilizante químico (T3), demostrándose los beneficios del consorcio nativo.

Longitud de la raíz (cm): Los resultados para este parámetro a los 21 días, evidencian una diferencia significativa (P<0.05) en la longitud de la raíz debido a que mostró diferencia entre los tratamiento T2 (semillas inoculadas) al compararse con T1 (testigo, semillas sin ningún tipo de tratamiento); el tratamiento T3 (semillas tratadas con fertilizantes comercial) fue similar a dos tratamientos. A los 35 días, el tratamiento T2 logró una mayor longitud de raíz, con un valor superior a 6 cm, mientras que el tratamiento T1y T3 mostró una longitud alrededor 5,27 cm; no se presentó diferencia significativa. El consorcio demostró efectos positivos sobre la longitud de la raíz que pueden ser atribuidos a la disponibilidad de Fósforo y también a la posible presencia de fitohormonas producidas por una o las dos cepas que forman el consorcio; la promoción del crecimiento ha sido atribuida a factores tales como la síntesis de ciertas hormonas vegetales que estimula la densidad y longitud de los pelos radicales aumentando así la cantidad de raíces en las plantas; se incrementa la capacidad de absorción de agua y nutrientes, y permite que las plantas sean más vigorosas, productivas y tolerantes a condiciones climáticas adversas ( ^{Lara et al, 2011}b; ^{Kloepper et al., 1991}).

Peso seco (g): Los pesos secos más altos se evidenciaron en los tratamientos T3 y T2, alcanzando un peso máximo de 0,179 g, un valor inferior se mostró en el tratamiento T1 con un peso entre 0,09 g. A los 35 días se observó diferencia altamente significativa (P<0.01) entre los tratamientos T2 y T3 frente al tratamiento testigo (T1) que presentó bajo peso seco. La asimilación de fosfatos por parte de los vegetales contribuye al aumento de su metabolismo, lo cual se refleja en mayor contenido de materia orgánica, crecimiento de las raíces en estado de plántula, acelera la maduración, estimula la coloración de los frutos, ayuda a la formación de semillas y de las moléculas de transferencia de energía como el ATP (^{Madigan et al., 2003}; Iañez, 2010).

La presencia de órganos de la planta con una demanda neta por asimilados, puede influenciar fuertemente los patrones de producción y distribución de materia seca (^{Tekalign y Hammes, 2005}). La acumulación de materia seca, comúnmente se utiliza como parámetro para caracterizar el crecimiento, porque usualmente tiene un gran significado económico.