a) Obtención de callos embriogénicos

Se emplearon tallos jóvenes de plantas de 25 a 30 días de edad, provenientes del vivero, a las cuales se les eliminaron las hojas externas y maduras hasta quedar una sección de aproximadamente 5 cm de largo a partir del último nudo, envuelta con las hojas más jóvenes. Este material se lavó con solución jabonosa al 20 %, y se sometió a desinfección con hipoclorito de sodio al 1 % durante 20 minutos (^{Marcano et al., 2002}). En cámara de flujo laminar, se realizaron dos lavados de 10 minutos cada uno con agua destilada estéril, luego se retiró una última capa de hojas hasta obtener un tallo de aproximadamente 1 cm de diámetro y se seccionaron los explantes a una distancia del ápice caulinar entre 2 cm hasta 5 cm en forma de discos con 2 mm de grosor, para un total de 30 discos por variedad que se sembraron a razón de 6 explantes por frasco con medio de inducción , compuesto por: sales Murashige y Skoog (1962) completas, inositol 100 mg. l^-1, tiamina 1 mg.l^-1 piridoxina 0,5 mg.l^-1, ácido nicotínico 0,5 mg.l^-1, glicina 2 mg.l^-1, arginina 50 mg.l^-1, cisteína 50 mg.l^-1, ácido cítrico 0,15 mg.l^-1, sacarosa 30 g.l^-1, agua de coco 50 ml.l^-1 y agar 8 g.l^-1, suplementado con ácido 3,6 dicloro-2-metoxibenzoico (Dicamba) 6,63 mg.l^-1 ó ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4D) 3 mg.l^-1, con ajuste a pH 5,7 con soluciones de NaOH 0,1 N y HCl 1 N, y se cultivaron en una habitación bajo condiciones de completa oscuridad a 25°C durante 1 mes (^{Marcano et al., 2002}).

b) Regeneración de vitroplántulas

Para el desarrollo de plántulas, los callos embriogéni-cos fueron subcultivados en medio de regeneración, cuya composición es la siguiente: sales Murashige y Skoog (1962) a la mitad, inositol 100 mg.l^-1, tiamina 1 mg.l^-1, sacarosa 60 g.l^-1, agua de coco 200 ml.l^-1, agar 8 g.l^-1y ajustándose el pH a 5,7 con soluciones de NaOH 0,1 N y HCl 1 N, y se incubaron bajo condiciones de luz continua en una habitación a 25 °C durante 2 meses (^{Marcano et al., 2002}). Se sembraron 5 frascos con 6 callos cada uno, para un total de 30 callos para cada variedad.

c) Análisis estadístico

Se realizó el análisis de varianza multifactorial de la interacción entre las variedades de caña de azúcar y las hormonas aplicadas con el programa estadístico Statgraphics Centurion 12®. con variables dependientes (% de formación de callo y % de formación de vitroplántulas) e independientes (hormonas, variedades y réplicas), a fin de evaluar si existen diferencias significativas entre los porcentajes de formación de callos embriogénicos y entre los porcentajes de desarrollo de vitroplántulas a partir de los embriones somáticos obtenidos. Para identificar cuáles de las variedades de caña de azúcar y cuál de los tratamientos hormonales muestran diferencias significativas, se procedió a aplicar la comparación de medias con el procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, con un 95 % de confianza.

a) Obtención de callos embriogénicos

Distintos factores genéticos y fisiológicos influyen en la inducción de la embriogénesis somática,, desencadenando la sustitución del patrón de expresión génica existente en el tejido del explante, con una nueva expresión de genes embriogénicos. Este proceso sólo es posible si las células son competentes y reciben los estímulos inductores apropiados. Entre los factores que intervienen, las hormonas vegetales, especialmente las auxinas, son componentes clave, ya que su aplicación exógena recapitula el potencial embriogénico de las células somáticas mitóticamente inactivas. Varios estudios han indicado que la señalización por auxinas, así como el estrés pueden ser eventos clave en la reprogramación genética de células somáticas durante la embriogénesis temprana, lo cual es necesario para la indiferenciación y para adquirir la condición embriogénica (^{Silveira et al., 2013}).

En la figura 1, se observan las diferentes etapas del proceso de embriogénesis somática en la variedad de caña de azúcar V99245, en representación de todas las estudiadas en este trabajo. En la parte A de la figura, se observan los discos foliares inoculados en el medio de inducción de callos. Una vez transcurridos 25 días, se puede observar en la parte B de la figura, la formación de callo de aspecto compacto con una coloración blanquecina, características típicas del callo embriogénico de caña de azúcar (^{Oropeza et al., 2001}). ^{Taylor et al., (1992)} proveen una descripción precisa de los diferentes tipos de callo que se originan a partir de segmentos de hojas jóvenes de caña de azúcar: El Tipo I, aparece primero, luego de 5 días de cultivo en los extremos de corte y se caracteriza por ser semi-traslúcido y consistente de células grandes y alargadas; el Tipo II se desarrolla dentro del tejido del Tipo I luego de 13 días de cultivo y es suave, mucilaginoso, amarillento y contiene células redondeadas, vacuoladas altamente disociadas. El Tipo III aparece después de los 13 a 21 días en los extremos de los explantes y alrededor del tejido vascular, consistiendo de un callo compacto, duro, con nódulos globulares superficiales, amarillento al principio pero después se torna blanquecino y está compuesto de células pequeñas, redondeadas y de citoplasma denso. El Tipo IV es amarillo, friable, presenta aglomerados de estructuras semi-organizadas y consiste de células pequeñas, redondeadas, de citoplasma denso. Los callos del Tipo I y Tipo II son no-morfogénicos mientras que los callos Tipo III y IV pueden regenerar plantas con una alta frecuencia a través de la embriogénesis somática y con una baja frecuencia a través de la organogénesis, respectivamente. El callo Tipo III es el referido como callo embriogénico y la heterogeneidad se debe a que el explante proviene de la sección transversal de varias hojas con diferentes grados de madurez. ^{Guiderdoni y Demarly (1988)} describieron sólo dos tipos de callo: el callo friable y el callo compacto, los cuales aparentemente concuerdan con los Tipos I y III de Taylor et al., (1992). Resultados similares fueron obtenidos por Oropeza et al., (2001) y por ^{Marcano et al., (2002)}; observando únicamente los callos compacto y friable, de acuerdo a lo descrito por Guiderdoni y Demarly (1988). ^{Silveira et al. (2013)} estudiaron las diferencias en la adquisición de competencias y la posterior maduración del embrión somático en callos em-briogénicos y no embriogénicos de caña de azúcar de la variedad SP791011; mediante análisis histológico, curvas de crecimiento, número de embriones somáticos y contenido de poliaminas. Los callos embriogéni-cos fueron distinguibles de los no embriogénicos por presentar tejidos con forma redondeada, aspecto seco y compacto, de color blanquecino opaco con menor oxidación, además de la aparición de puntos verdes luego de varios días; mientras que los callos no em-briogénicos presentaban células alargadas, aspecto suave y friable, mucilaginosos, de color pardo traslúcido por la oxidación en presencia de luz.

Figura 1 Inducción de la embriogénesis sometica de la variedad de caña de azúcar V99245 con Dicamba. A) Discos de hojas envolventes al inicio de la inducción. B) Callo generado luego de 25 días de cultivo en medio de inducción. C) Callos mostrando agregados embriogénicos a los 32 días de incubación en medio de inducción (110X). 

En la figura 1C se observan los agregados de embriones formados a partir de los callos embriogénicos, a los 32 días después de la siembra, mostrando el color blanquecino característico. La poca cantidad de callo no embriogénico obtenida presentaba aspecto suave y friable, evidenciando oxidación celular debido a la coloración marrón traslúcida , mientras que los callos embriogénicos mostraban un aspecto más compacto, una coloración opaca y blanquecina, con numerosos embriones somáticos en su periferia, que al transcurrir cinco días comenzaron a germinar observándose gran cantidad de vástagos y raíces. El resto de las variedades presentó el mismo tipo de crecimiento. Aunque no se realizó un estudio histológico para determinar el origen embriogénico de las vitroplántulas, las condiciones de cultivo y la morfología del callo obtenido, fueron similares a las reportadas por ^{Oropeza et al., (2001)} y por ^{Marcano et al., (2002)} donde corroboraron mediante el estudio anatómico lo observado a nivel morfológico en los callos embriogénicos. Así, dadas las características morfológicas de los callos obtenidos en este trabajo y la alta frecuencia de regeneración de plántulas a partir de estos callos, es muy probable que el principal proceso de regeneración in vitro que está ocurriendo sea el embriogénico.

En la tabla 1 se observan los porcentajes de formación de callo embriogénico, para cada variedad, con ambos tratamientos hormonales, los cuales evidencian diferencias significativas entre 2,4D y Dicamba. En cuanto a la respuesta por variedad, se observa una respuesta particularmente baja para la variedad RB855546, con ambos tratamientos, lo cual corrobora el hecho de que toda respuesta embriogénica depende del genotipo. En general, para la variedad V0050 la formación de callo embriogénico es mayor con 2,4D; se observó una respuesta muy similar entre las variedades CC8475, V756 y V781, pero la respuesta oscila entre 40 y 90 %, todas con mayor respuesta con Dicamba; al igual que entre las variedades CC8592 y V99245, estas últimas con la respuesta más alta para formación de callo embriogénico con ambos tratamientos.

Tabla 1 Porcentajes de formación de callos embriogénicos de cada variedad de caña de azúcar. 

Comparación de medias con el procedimiento de diferencia significativa (HSD) de Tukey con un nivel de confianza de 95%. Las letras a y b denotan diferencias altamente significativas entre los tratamientos hormonales. Las letras c, d, e, f, representan diferencias altamente significativas entre la respuesta de las variedades ante la formación de callo. Variedades con la misma letra no presentan diferencias significativas entre ellas.

El inicio y el mantenimiento de callo embriogénico es un paso importante para el desarrollo de embriones somáticos y la regeneración de plántulas (^{Silveira et al., 2013}). Tradicionalmente y en la actualidad, la embriogénesis somática en muchas especies de gramíneas, es inducida con 2,4D. ^{Ho y Vasil (1983)}, reportaron por primera vez que en los extremos cortados de explantes de monocotiledóneas cultivados en medio Murashige y Skoog (1962) suplementado con 2,4D, se formaban callos (^{Guiderdoni y Demarli, 1988}; Guiderdoni et al., 1995; ^{Suprasanna et al., 2005}; ^{Lakshmanan et al., 2005}; ^{Raza et al., 2012}; ^{Taparia et al., 2012}; ^{Kaur y Kapoor, 2015}). En nuestra investigación, la inducción del callo embriogénico y de embriones somáticos fue ligeramente mayor en los explantes cultivados en medios suplementados con Dicamba (70,83 % de callo embriogénico por variedad), aunque la mayoría de las variedades respondieron al 2,4D (62,08 % de callo embriogénico por variedad), el porcentaje de formación de callo embriogénico de cada variedad para cada tratamiento se observa detalladamente en la tabla 1. Se observó un rápido desarrollo de callo embriogénico durante la fase de inducción, bajo las condiciones del ensayo, en medios de cultivo suplementados con Dicamba, compuesto que es empleado en condiciones de campo como un herbicida selectivo, su modo de acción es modificar el transporte del ácido indolacético, destruyendo el cámbium y el parénquima a nivel de los nudos o por encima de ellos; pero su estructura química es la de una auxina artificial, la cual empleada en cultivos in vitro de caña de azúcar, permite laanaplasia del tejido de discos de hojas envolventes.

El uso de explantes de hojas jóvenes en nuestra investigación, ha sido validado en distintos protocolos establecidos para la morfogénesis in vitro de la caña de azúcar utilizando explantes de diferentes partes de la planta, como por ejemplo meristemas, verticilos de hojas internas, segmentos de inflorescencias, inflorescencias inmaduras, segmentos de hojas jóvenes, discos de hojas inmaduras, entre otros; sin embargo, el más empleado es el disco de hojas envolventes inmaduras cercanas al meristemo apical, inoculado en sentido horizontal, con sus extremos distales en contacto con el medio, ya que con el uso de este tipo de explante, se han obtenido los mejores resultados en la producción de embriones somáticos (^{Guiderdoni et al., 1995}; ^{Oropeza et al., 2001}; ^{Marcano et al., 2002}; ^{Suprasanna et al., 2011}; ^{Joshi et al., 2013}). ^{Kaur y Sandhu (2015)} establecieron un sistema eficiente de producción directa de yemas adventicias, también a partir de discos de hojas jóvenes; demostrando el potencial de este explante para la producción masiva a nivel industrial, de plantas de caña de azúcar.

^{Manchanda y Gosal (2012)}, estudiaron el efecto del carbón activado, las fuentes de carbono y los agentes gelificantes sobre la embriogénesis somática de caña de azúcar, y recomiendan ampliamente la adición de carbón activado al medio de cultivo, para disminuir el ennegrecimiento de los tejidos por la exudación de compuestos fenólicos y así incrementar el potencial embriogénico de los tejidos. Además, recomiendan suplementar el medio con maltosa, aunque el uso de sacarosa sigue rindiendo buenos resultados. Finalmente recomiendan gelificar los medios de cultivo con agar ya que observaron que con su uso aumentaba el porcentaje de formación de embriones somáticos, así como la frecuencia de regeneración de la caña de azúcar, en comparación con el gelrite. En nuestras manos, no se observó ennegrecimiento por lo que no hizo falta el uso de carbón activado. La poca oxidación observada fue controlada con la adición de cisteína al medio de cultivo.

^{Suprasanna et al. (2005)}, encontraron que la eficiencia de formación de callo embriogénico fue más alta con la combinación de 2,4D y zeatina en la variedad Co91010, mientras que para la variedad CoC671, esta combinación resultó eficiente añadiendo prolina al medio de cultivo. Analizando la respuesta particularmente baja de la variedad RB855546, obtenida en nuestra investigación, se podría recomendar suplementar el medio MS (1962) usado para la inducción de callos embriogénicos (que contiene los aminoácidos arginina y cisteína), con prolina a fin de mejorar la respuesta de esta variedad. Por otra parte, en nuestro trabajo no se utilizaron citoquininas sintéticas en combinación con las auxinas probadas para la inducción del proceso de embriogénesis somática; aparentemente, la cantidad de zeatina que contiene el agua de coco, es suficiente para inducir los procesos de división y alargamiento celular, que en combinación con las auxinas, propician las citoquininas durante este proceso.

^{Marcano et al. (2002)}, optimizaron el proceso de embriogénesis somática en variedades venezolanas de caña de azúcar, empleando las auxinas sintéticas 2,4D y Dicamba, ambas sustancias empleadas en campo como herbicidas, ya que afectan el transporte de auxinas naturales y el alargamiento celular. Demostraron que después de 45 días en el medio suplementado con Dicamba, se observó el mayor porcentaje de callo embriogénico para las variedades venezolanas ensayadas, V756 y V781.

Como mencionamos antes, numerosos autores han reportado que la embriogénesis somática en caña de azúcar es inducida por la auxina 2,4D (^{Ho y Vasil, 1983}; ^{Brisibe et al., 1994}; ^{Falco et al., 1996}; Oropeza y García, 1996; Oropeza et al., 2001; ^{Watt et al., 2009}; ^{Snyman et al., 2011}); sin embargo, en la mayoría de las variedades analizadas en esta investigación, el porcentaje de callo embriogénico obtenido es mayor cuando se emplea Dicamba, este hecho puede adjudicarse a la diferencia estructural de las moléculas de 2,4D y Dicamba siendo esta última la que puede ser absorbida y degradada por los tejidos vegetales más rápido.

Figura 2 Gráficos de análisis de homogeneidad de varianza con 95 % de confianza, mediante comparación de medias por diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, para la formación de callos embriogénicos de caña de azúcar. A. tratamientos hormonales; B. variedades de caña de azúcar.