Microorganismo y conservación

Se utilizó el aislamiento de P. fluorescens Ps006, obtenido a partir de la rizosfera de fique Furcraea andina (Trelease 1808) en el municipio de Totoró (2° 38' N y 2°15' W, a 2,750 m.s.n.m, y 14 °C), en el departamento del Cauca, Colombia (^{Sastoque, 2010}). El microorganismo fue conservado en solución salina (0,85% de NaCl) con glicerol al 10% y peptona al 0,10%, a -70 ± 2 °C.

Producción y caracterización del principio activo de P. fluorescens Ps006

P. fluorescens Ps006 se sembró en medio agar Luria Bertani - LB (Oxoid CM1021) y se incubó por 48 horas a 28 ± 2 °C. A partir de este cultivo se preparó una suspensión celular en Tween 80 al 0,5% y se inoculó en un erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio LB. La concentración de la suspensión se estimó leyendo la absorbancia a una longitud de onda de 300 nm y dicho valor se extrapoló en una curva patrón estandarizada previamente. La fermentación se realizó utilizando una agitación constante de 175 rpm a 28 ± 2 °C por 48 horas.

Se realizaron 3 lotes de fermentación que se caracterizaron determinando la concentración celular en unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL), el pH y la actividad biológica in vitro, por triplicado para cada lote.

La concentración bacteriana se determinó mediante recuento en placa, sembrando tres diluciones decimales del caldo de fermentación por triplicado, en cajas Petri con medio LB e incubando durante 24 horas a 28 ± 2 °C, momento en el cual se realizó el recuento de UFC/ mL. Una vez se verificó la normalidad (Shapiro Wilk 95%) y la homogeneidad de varianza (Prueba de Barlett 95%) de los datos, se realizó un análisis de varianza ANOVA y una comparación de medias de Tukey con un nivel de confianza del 95%. Se empleó el programa estadístico Statistix 8.0.

El pH de los tres lotes de fermentación se midió con un potenciómetro marca Hanna® Instruments previamente calibrado. Se determinó la desviación estándar y el coeficiente de variación de los datos.

La actividad biológica in vitro se estimó como la inhibición del crecimiento de cuatro reconocidos fitopatógenos (^{Raut et al., 2012}) mediante la técnica de cultivo dual (^{Shi et al., 2014}). Para ello se utilizaron las cepas F. oxysporum MAP5 aislado de uchuva (Physalis peruviana L.), R. solani Rh200 aislada de papa (Solanum tuberosum), B. cinerea Bc008 aislada de mora (Rubus sp. L.), y Sclerotinia sclerotiorum Sc021 aislada de papa (Solanum tuberosum). Para esta determinación se sembraron en superficie en medio agar PDA muestras de 100 μL de los tres lotes de fermentación y se colocó sobre el punto central del medio inoculado un disco de 5 mm de diámetro de medio de cultivo crecido con los hongos fitopatógenos de 8 días de edad. Se utilizaron tres unidades experimentales (cajas de Petri) para cada tratamiento. El tratamiento control consistió en medio agar PDA sin inóculo bacteriano, pero inoculado con los hongos fitopatógenos de la forma descrita previamente. Las cajas de Petri se incubaron 8 días a 25 ± 2 °C y transcurrido dicho tiempo, el valor de crecimiento diametral medio de cada colonia fue determinado calculando la longitud promedio de 4 líneas rectas que trazadas de un extremo a otro de la colonia, pasan por su centro y la dividen en octantes (^{Pradeep et al., 2013}).

Selección de soportes sólidos compatibles

Se evaluaron tres soportes sólidos en polvo denominados S1 (arcilla), S2 (silicato) y S3 (estearato), cada uno a dos condiciones de humedad diferentes (10% y 20%) e inoculados con el principio activo a una concentración de 1x10⁹ UFC/mL. La humedad de los soportes al 10% fue aportada por el principio activo mezclado, mientras que para ajustar el 20% y mantener la misma concentración celular se adicionó una solución tampón pH 7,5. Posteriormente se dispensaron muestras de 1 g de soporte inoculado con el principio activo en viales de vidrio previamente esterilizados, los cuales se sellaron con tapones de caucho y agrafes metálicos y se almacenaron a diferentes temperaturas (8 ± 2 °C, 18 ± 2 °C y 28 ± 2 °C). Antes de iniciar el almacenamiento y pasados uno, dos y tres meses, se evaluó la viabilidad de P. fluorescens Ps006 por el método de recuento en placa descrito previamente (resultados expresados en UFC/g). La muestra contenida en cada vial se mezcló con 9 mL de Tween 80 al 0,5 % y se agitó para su posterior siembra en medio de cultivo LB. Se siguió un diseño completamente al azar con medidas repetidas en el tiempo. En cada tiempo de medición se evaluaron dos muestras de cada tratamiento por triplicado. Se seleccionaron los tratamientos en los cuales se obtuvo una mayor viabilidad y estabilidad del principio activo en los tres meses de almacenamiento.

Evaluación de coadyuvantes y atmósfera de empaque

Una vez seleccionados los soportes compatibles con el principio activo, se evaluó el efecto de la presencia o ausencia de aire dentro del empaque y el efecto de la leche descremada y el glicerol (coadyuvantes), utilizados comúnmente como estabilizadores de la viabilidad de los microorganismos durante su conservación (^{Burges, 1998}). Los soportes seleccionados se mezclaron con los coadyuvantes al 5% y se inocularon con el cultivo bacteriano ajustándolo a la humedad seleccionada. Los soportes inoculados sin adición de coadyuvantes se utilizaron como control. Las muestras se almacenaron bajo condiciones atmosféricas diferentes: al vacío y con presencia de oxígeno y a temperaturas de 8 ± 2 °C, 18 ± 2 °C y 28 ± 2 °C. El efecto de estas condiciones climáticas fue evaluado durante seis meses. Para los tratamientos almacenados con oxígeno se dispensaron muestras de 1g del soporte inoculado con el principio activo en viales de vidrio previamente esterilizados, los cuales se sellaron con tapones de caucho y agrafes metálicos. Para el almacenamiento al vacío se depositaron muestras de 1g del soporte inoculado con el principio activo en bolsas PET (Tereftalato de Polietileno) y se sellaron al vacío con una Selladora Van der stahl®. La viabilidad de la bacteria se determinó mediante recuento en placa sembrando en superficie tres diluciones decimales por triplicado en cajas de Petri con medio agar LB.

Se siguió un diseño completamente al azar con medidas repetidas en el tiempo, y en cada tiempo de evaluación se determinó la viabilidad de dos muestras de cada tratamiento por triplicado.

Análisis estadísticos

Se determinó la normalidad y homogenidad de varianza mediante las pruebas de Shapiro Wilks (95%) y Bartlett (95%), respectivamente. Una vez demostrados estos principios, se aplicó a un análisis de varianza ANOVA y una prueba de comparación de medias de Tukey (95%). Se utilizó el programa Statistix versión 8.1 (Analitycal Software, Florida, USA).

Producción y caracterización del principio activo P. fluorescens Ps006

Para los tres lotes de principio activo se obtuvo un pH promedio de 8,63, con un coeficiente de variación de 0,2%. Las concentraciones celulares para cada uno de los lotes evaluados fueron 6.73x10⁹, 8.07x10⁹ y 8.93x10⁹ UFC/mL. El coeficiente de variación de los resultados de evaluación fue del 0.6%, y no se evidenciaron diferencias significativas entre los resultados de los lotes (F=2,06; gl=2; p=0,2081), lo que indica baja variabilidad y alta repetibilidad en la producción del principio activo (^{Villamizar et al., 2005}). En cuanto al pH, éste osciló entre 8,60 y 8,65 encontrándose que no hay diferencias significativas entre los resultados de los lotes evaluados (F=3,74; gl=2; p=0,0882).

Basado en los resultados obtenidos para cada parámetro, en este estudio se propusieron rangos o límites de aceptación para las características del principio activo a base de Ps006, los cuales serán utilizados como referencia para su control de calidad (tabla 1).

Tabla 1 Límites de aceptación establecidos para las características del principio activo. 

En la figura 1 se observa el efecto in vitro del principio activo sobre los cuatro patógenos evaluados, con inhibiciones del crecimiento diametral de R. solani Rh200, B. cinerea Bc008, S. sclerotiorum Sc021 y F. oxysporum MAP5 de entre el 93,64% y 36,80%. La actividad antagónica de P. fluorescens ante patógenos que afectan a cultivos de importancia económica ha sido demostrada por varios autores. Por ejemplo, para F. oxysporum se obtuvo un control del 81,21% en condiciones de campo (^{Manikandan et al., 2010}), para R. solani se observaron disminuciones de la intensidad de la enfermedad del 42% (^{Rabrindran & Vidhyasekaran, 1996}) y del 47,89% (^{Commare et al., 2002}) en condiciones de invernadero. Asimismo, se obtuvo una disminución del crecimiento in vitro del 67,7% para Botrytis sp. (^{Mikani et al., 2008}) y una reducción de la incidencia de la enfermedad del 26,3% para S. sclerotiorum en condiciones de campo (^{Fernando et al., 2007}). Estos resultados confirman el potencial que tiene P. fluorescens como agente de control biológico y demuestran las potencialidades de uso de su principio activo como bioplaguicidas para el control de plagas que afectan a cultivos de importancia económica. Sin embargo, investigaciones a escala de macetas y campo son necesarias para demostrar esta hipótesis.

Figura 1 Actividad antagónica in vitro del principio activo a base de P. fluorecens Ps006, determinada como la inhibición del crecimiento diametral de cuatro hongos fitopatógenos. Tratamientos con letras comunes no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%). 

El patógeno más resistente a la actividad antagónica de P. fluorescens Ps006 fue F. oxysporum MAP5 con una inhibición del crecimiento diametral de tan solo el 36,80%, valor significativamente menor (F=14,9; gl=3; p=0,0000) a los obtenidos con los otros patógenos evaluados, que presentaron porcentajes de inhibición superiores al 87%. Esto podría deberse a una mayor resistencia en la pared celular del micelio de F. oxysporum, microorganismo que posee polímeros de heteroglucuranos que no se encuentran en los demás patógenos evaluados y que han sido relacionados con la resistencia y el mantenimiento de la integridad celular (^{Nuero, 1995}). Además es posible que el aislamiento de F. oxysporum MAP5 posea la capacidad para inhibir la biosíntesis del 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG), un antibiótico de amplio espectro reconocido como uno de los principales mecanismos de acción en un amplio rango de aislamientos de P. fluorescens (^{Showkat et al., 2012}) . Este comportamiento fue demostrado por ^{Schouten et al. (2004)}, quienes evaluaron la sensibilidad de 41 aislamientos de F. oxysporum frente a dicho antibiótico y encontraron un 17% de aislamientos resistentes, lo que atribuyeron a la capacidad de este patógeno de producir ácido fusárico, un potente inhibidor de la biosíntesis del 2,4-DAPG.

El modo de acción de P. fluorescens como antagonista de fitopatógenos se ha relacionado con la competencia por espacio y nutrientes. Este fenómeno fue observado por ^{Commare et al. (2002)} que determinaron la actividad antagónica de formulaciones de P. fluorescens en talco, evidenciándose un control de R. solani del 47,89% en condiciones de invernadero, resultados atribuidos a la competencia por espacio. En el estudio realizado por ^{Valencia et al. (2005}), se concluyó que la actividad de P. fluorescens ZUM80 sobre F. oxysporum se debió a la competencia por nutrientes, privando al hongo del hierro disponible en el medio mediante la producción de sideróforos, capacidad antagónica que se vio favorecida cuando la bacteria tuvo un tiempo de pre-exposición en el medio (^{Valencia et al., 2005}). Además de estos mecanismos de competencia, en estudios realizados por ^{Khanam, Ueno, Kihara, Honda, & Arase (2005)} se encontró que el ácido salicílico que produce P. fluorescens inhibe la formación de estructuras de infección, tales como el tubo germinal y los apresorios en B. cinerea, lo que sugiere que esta bacteria también tiene la capacidad de producir otros metabolitos con actividad antagónica efectiva.

Selección de soportes sólidos compatibles

En la figura 2 se presenta la pérdida total de viabilidad del principio activo después de tres meses de almacenamiento a las tres temperaturas evaluadas. Se observó para el soporte S1 al 10% de humedad (S1-10%), porcentajes de pérdida entre el 14% y el 31,9% y para S1 al 20% de humedad (S1-20%) entre el 9,6% y el 33,2%. Para el soporte S2 al 10% de humedad (S2-10%) a las tres temperaturas se obtuvo una pérdida de viabilidad del 67,7% y para S2 al 20% de humedad (S2-20%), la reducción de la viabilidad osciló entre el 2,3% y el 9,4%. Finalmente, para el soporte S3 al 10% de humedad (S3-10%) en las tres temperaturas se obtuvo una pérdida del 78,1% y para dicho soporte al 20% de humedad la pérdida de viabilidad osciló entre el 25,7% y el 69,6%.

Figura 2 Pérdida total de viabilidad del principio activo de P. fluorescens Ps006 mezclado con los soportes sólidos, después de tres meses de almacenamiento a tres temperaturas. 51- 10%: Soporte 1 al 10% de humedad, S1-20%: Soporte 1 al 20% de humedad, S2-10%: Soporte 2 al 10% de humedad, 52- 20%: Soporte 2 al 20% de humedad, S3-10%: Soporte 3 al 10% de humedad, S3-20%: Soporte 3 al 20% de humedad. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%). 

Se evidenció que las humedades del 10% y del 20% a las cuales se ajustaron los sistemas para su almacenamiento, tuvieron un efecto en la estabilidad de la viabilidad de la bacteria Ps006, siendo la pérdida de viabilidad con los soportes S2 y S3 al 10%, significativamente mayor que para los sistemas con el 20% de humedad (F=402; gl=17; p=0,0000) (Fig. 2). Esto puede deberse a que los tratamientos con el 20% de humedad requirieron la adición de un volumen de solución tampón pH 7,5 para el ajuste de la humedad, el cual posiblemente ejerció un control en el estado iónico de la formulación, haciéndola menos susceptible a cambios bruscos de pH que pueden afectar la estabilidad e integridad de la membrana citoplasmática, causar la denaturalización de enzimas y alterar las interacciones iónicas que les permiten reconocer y unirse al sustrato (Calvo et al., 2004; ^{Nelson & Cox, 2005}).

Las mayores pérdidas de viabilidad obtenidas con los soportes S2 y S3 cuando la humedad se ajustó al 10%, podrían deberse a que con dicha humedad la concentración de solutos en el sistema es mayor en relación con el tratamiento al 20% de humedad. Esta atmósfera hipertónica en el medio al 10% de humedad pudo ocasionar fenómenos de plasmólisis obligando a la célula a perder agua, lo que aumenta la viscosidad del ambiente intracelular disminuyendo su volumen, llevando a una retracción de la membrana citoplasmática y posteriormente a la muerte celular (^{Rodríguez et al., 2005}; ^{Tortora et al., 2007}).

Con el soporte S1 a las dos humedades y con los soportes S2 y S3 al 20% de humedad se observó que la pérdida de la viabilidad aumentó a medida que aumentó la temperatura de almacenamiento, efecto negativo que ha sido evidenciado por diferentes autores para diversos microorganismos (^{Chen et al., 2008}; Costa et al., 2008; ^{Guijarro et al., 2007}; ^{Santos et al., 2012}). Este efecto podría deberse a que a mayor temperatura el metabolismo celular se mantiene activo, lo que causa que se almacenen metabolitos tóxicos que reducen drásticamente la viabilidad (^{Santos et al., 2012}; ^{Costa et al., 2002}). Por ejemplo ^{Kinay & Yildiz, (2008)}, evaluaron formulaciones de Pichia guilliermondii y observaron que las almacenadas a 4 °C fueron más estables que las almacenadas a 24 °C. Resultados similares a los del presente estudio fueron obtenidos por ^{Santos et al. (2012)} que evaluaron la estabilidad de la germinación de los conidios de los aislamientos colombianos Trichoderma koningiopsis Th003 y Trichoderma asperellum Th034 formulados como polvos secos para espolvoreo y granulados dispersables almacenados a temperaturas de 8, 18 y 28 °C. Dichos autores obtuvieron mayores vidas útiles cuando el almacenamiento fue a 8 y 18°C, concluyendo que las temperaturas más bajas redujeron la actividad metabólica de los conidios, evitando la producción de metabolitos tóxicos y el agotamiento de nutrientes, aspectos relacionados con la fisiología microbiana.

El principio activo mezclado con los soportes S1 y S2 al 20% de humedad se seleccionaron como los sistemas de entrega base para el desarrollo de un bioplaguicida, ya que fueron los sistemas más compatibles con el principio activo de P. fluorescens Ps006, manteniendo estable su viabilidad y actividad biocontroladora durante tres meses de almacenamiento a 8± 2 °C, 18± 2 °C y 28 ± 2 °C.

Evaluación de coadyuvantes y atmósfera de empaque

Una vez seleccionados los soportes más compatibles con el principio activo se procedió a evaluar el efecto de la presencia y ausencia de oxígeno en el empaque y de dos coadyuvantes protectores de la membrana celular (leche descremada y glicerol), sobre la viabilidad de P. fluorescens Ps006 bajo condiciones de al macenamiento. Los resultados de dichos ensayos se presentan en la figura 3.

Figura 3 Pérdida de viabilidad del principio activo de P. fluorescens Ps006 con los soportes A) S1-20% y B) S2-20% después de seis meses de almacenamiento. CV: almacenado al vacío, CO: almacenado con oxígeno, PPV: con protectores de membrana almacenado al vacío, PPO: con protectores de membrana almacenado con oxígeno. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%). 

Teniendo en cuenta la concentración de la suspensión celular utilizada como principio activo (1x10⁹ UFC/mL) y la proporción de mezcla con los soportes, la concentración teórica de la mezcla se estimó en 1,3x10⁸ UFC/ mL. Los datos experimentales mostraron que la viabilidad inicial del principio activo con el soporte S1 al 20% de humedad fue de 4,67x10⁷ UFC/g y cuando fue mezclado con los protectores de membrana fue de 1,45x10⁸ UFC/g. Esta disminución en la concentración celular cuando no se utilizó protector de membrana posiblemente se relaciona con un efecto tóxico ejercido por el soporte al entrar en contacto con las células de P. fluorescens Ps006, que redujo su viabilidad. Sin embargo, este efecto deletéreo se vio disminuido por los protectores de membrana.

Se observó que la pérdida de viabilidad después de seis meses de almacenamiento fue directamente proporcional a la temperatura, tendencia que se evidenció para las dos condiciones atmosféricas (con y sin O2). El tratamiento sin protector de membrana y almacenado con oxígeno fue el más estable para el soporte S1, ya que la pérdida de viabilidad máxima fue del 20% a 28 °C en comparación con los demás tratamientos con pérdidas significativamente mayores (F=1622,39; gl=10; p=0,0000), las cuales superaron el 70% bajo la misma condición de temperatura.

Para el soporte S2 se obtuvieron viabilidades iniciales de 1,79 x 10⁷ UFC/g cuando no se utilizaron protectores de membrana y de 6,90 x 10⁷ UFC/g cuando éste fue adicionado, evidenciándose nuevamente un efecto tóxico inicial al contacto con el soporte sólido. Pasados seis meses, en general se observó que la pérdida de viabilidad aumentó a medida que se incrementó la temperatura de almacenamiento. Dicha pérdida fue significativamente menor (F=233; gl=9; p=0,0000) para los tratamientos almacenados con oxígeno en comparación con los tratamientos almacenados al vacío, es decir que la ausencia de oxígeno en el empaque no mejoró la estabilidad de las formulaciones. Este comportamiento podría deberse al estrés causado por la atmósfera al vacío, sobre una bacteria aerobia obligada como P. fluorescens, que genera energía por un proceso de fosforilación oxidativa cuyo último aceptor de electrones es el oxígeno (^{Adams & Moss, 2008}; ^{Vásquez et al., 2009}). El efecto negativo de la atmósfera de empaque al vacío sobre la viabilidad de Pseudomonas spp. evidenciado en el presente estudio, ha sido ampliamente estudiado en la industria alimenticia, donde el empaque al vacío es utilizado para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes (ICMSF, 2006). Evitar la implementación de sistemas de vacío es una ventaja evidente para la producción a nivel industrial, ya que se disminuyen los tiempos y costos en el proceso, aumentando así la rentabilidad del producto final.

En la mayoría de los casos la viabilidad fue significativamente mayor (F=233; gl=9; p=0,0000) para los tratamientos en los cuales se mezcló el principio activo unicamente con el soporte, en comparación con los tratamientos en los que además del soporte, el principio activo se mezcló con los potenciales protectores de membrana; a excepción del tratamiento S2-20% almacenado con oxígeno, el cual no evidenció diferencias significativas cuando se usaron o no los protectores. En este sentido, el glicerol es ampliamente usado como humectante y protector osmótico (^{Freitas et al., 2009}; ^{Rowe et al., 2009}), así como crioprotectante y protector de secado al igual que la leche descremada (^{Cody et al., 2008}; ^{Morgan et al., 2006}; ^{Barbaree et al., 1982}). Sin embargo, se ha encontrado que ciertas cepas de Pseudomonas spp. utilizan el glicerol como fuente de carbono para la producción de biosurfactantes (^{Freitas et al., 2009}; ^{Freitas et al., 2010}; ^{Silva et al., 2010}; ^{Stanghellini, & Miller, 1997}), razón por la que se podría sugerir un posible consumo del glicerol y de la leche descremada durante el almacenamiento de los prototipos de formulación evaluados en el presente estudio, lo que pudo haber favorecido el crecimiento del microorganismo, el mantenimiento del metabolismo celular y la producción de metabolitos tóxicos, ocasionado pérdidas de viabilidad (^{Santos et al., 2012}).

El desarrollo de formulación en polvo de bacterias antagonistas es especialmente importante para el tratamiento de semillas (^{Ramamoorthy et al., 2001}). En el presente trabajo se desarrolló un prototipo de formulación a base de la bacteria P. fluorescens Ps006, la cual sobrevivió durante seis meses de almacenamiento a 28°C con una mínima pérdida de viabilidad, cuando se formuló en el soporte S1 que corresponde a un arcilla ajustada a una humedad del 20% y se utilizó una atmósfera de empaque no controlada en presencia de aire. En otros trabajos se han desarrollado prototipos de formulación similares pero con menor estabilidad y en la mayoría de los casos requiriendo condiciones de refrigeración. Tal es el caso de poblaciones de P. fluorescens formuladas en talco con un 20% de las goma Xantan que mantuvieron su viabilidad durante 2 meses de almacenamiento a 4°C (^{Kloepper & Schroth, 1981}). Otra formulación que al igual que el presente trabajo utilizó como soporte una arcilla tipo vermiculita, obtuvo una viabilidad estable durante 6 meses a 4°C (^{Connick, 1988}) y en otro trabajo donde el soporte fue talco, se mantuvo la viabilidad por un período de 90 días a 26°C (^{Sadi & Masoud, 2012}).