Cepas empleadas

Se emplearon las siguientes cepas bacterianas: Gluconacetobacter diazotrophicus cepa PAl5 (ATCC 49037) aislada a partir de raíces de caña de azúcar en Brasil (Cavalcante y Dobereiner, 1988), G. diazotrophicus cepas 1-05 y 4-02 aisladas de tallos de los cultivares de caña de azúcar Jaronú 60-5 y Media Luna 318, respectivamente (^{Rojas, 2005}), Bacillus licheniformis aislada de tallos de la variedad de caña de azúcar Cuba 323-68 (^{Rojas et al., 2001}) y Enterobacter agglomerans aislada de tallos de la variedad de caña de azúcar Media Luna 318 (^{Rojas et al., 2001}).

Influencia de la fuente de carbono y nitrógeno en el crecimiento

Las cepas se cultivaron en medio LGI líquido (en g L^-1 K₂HPO₄ 0,2; KH₂PO₄ 0,6; MgSO₄ 7H₂O 0,2; CACL₂ 2H₂O 0,02; NaMoO₄ 2H₂O 0,02; FeCL₃ 6H₂O 0,01; Bromotimol azul (solución al 0.05% en KOH 0,2N) 5 mL) con 10g L^-1 de sacarosa como fuente de carbono (Cavalcante y Dobereiner, 1988) durante 48 horas, a 30 °C y a 150 rpm, y los inóculos se ajustaron a 10⁸ UFC.mL^-1, según la escala de Mc Farland (NCCLS, 2005) con solución salina al 0.8 % (NaCl 0,8 g en 100 mL de H₂O). Se preparó medio LGI semisólido (2 g.L^-1 de agar) con las siguientes fuentes de carbono en una concentración final del 1 %: xilosa, sacarosa, inositol, glucosa, fructosa, jugo de caña de azúcar.

Por otra parte, se prepararon medios de cultivo con sacarosa al 1% como fuente de carbono y las siguientes fuentes de nitrógeno en una concentración final de 5 mM: sulfato de amonio, nitrato de potasio, asparagina, triptófano, treonina, arginina y un control sin la adición de nitrógeno.

Se sembraron 100 μL de cada inóculo en 5 mL de medio y se incubaron por 72 horas a 30 °C. Se midió la absorbancia a 600 nm. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Influencia de jugos de diferentes variedades de caña de azúcar sobre el crecimiento

Se preparó un inóculo similar al descrito en el epígrafe anterior e igualmente se ajustó a 10⁸ UFC. mL^-1. De esta preparación se tomaron 100 |jL para inocular tubos de cultivo que contenían 5 mL de medio LGI líquido y jugo de caña de diferentes cultivares de caña de azúcar para una concentración final de 20 y 30 %, así como un control con azúcar comercial como fuente de carbono. Se utilizaron jugo de caña de cinco cultivares diferentes. Se incubaron las muestras a 150 rpm, 30 °C y se midió la absorbancia a 600 nm a las 24, 48 y 72 horas. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Influencia del ácido indolacético y el ácido giberélico en el crecimiento

Se procedió de forma similar a lo descrito en el epígrafe anterior, utilizando medio SYP: (en g L^-1 sacarosa 10, extracto de levadura 3, K₂HPO₄ 1, KH₂PO₄ 3, pH=6,2) (^{Caballero-Mellado y Martínez-Romero, 1994}) líquido con diferentes concentraciones finales de ácido 3 indolacético (AIA) y ácido giberélico (GA) de 0,025, 0,25 y 2,5 mg.L^-1 y como control el medio sin hormonas. Se incubaron las muestras a 150 rpm, 30 °C y se midió la absorbancia a 600 nm a las 24, 48 y 72 horas. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Análisis biométricos

Los resultados de los estudios fisiológicos descritos se analizaron utilizando el paquete estadístico Tonystat (9). Se emplearon pruebas paramétricas y no paramétricas: análisis de varianza, prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación de medias de Duncan y prueba de comparaciones múltiples no paramétricas.

Inluencia de la fuente de carbono y nitrógeno en el crecimiento

En las cepas estudiadas se pueden observar diferencias significativas en el crecimiento entre los medios con diferentes fuentes de nitrógeno (tabla 1). Para las cepas de G. diazotrophicus se destacan los medios con sulfato de amonio y asparagina como fuentes de nitrógeno. Para B. licheniformis los medios con sulfato de amonio, nitrato de potasio, asparagina y arginina muestran los mayores valores de crecimiento. Se repiten las dos últimas fuentes de nitrógeno para E. agglomerans.

Tabla 1 Crecimiento de cepas de endófitos de caña de azúcar en medio LGI con diferentes fuentes de nitrógeno medida en cultivos de 5 mL a través de la absorbancia a 600 nm. 

Las letras no comunes indican diferencias significativas (p≤0,05) para la Prueba de comparación de medias de Duncan. Media de 3 repeticiones.

^{Stephan et al. (1991)} probaron la acción de varios aminoácidos sobre la actividad nitrogenasa de G. diazotrophicus,^{Rodríguez et al. (2005)} demostraron que con treonina, triptófano, arginina y asparagina como fuentes de nitrógeno, se evidencia inhibición parcial de esta actividad, quizás consecuencia de mecanismos similares de desactivación de la fijación biológica del nitrógeno, posiblemente no tan eficientes, lo que concuerda con los resultados obtenidos en este trabajo en la inhibición del crecimiento.

Esta bacteria ha mostrado su efecto promotor del crecimiento en diferentes cultivos de importancia económica como malanga, yuca y papaya, estudios que se han realizado a nivel de campo y han permitido demostrar su efecto en el incremento de los rendimientos y calidad de los frutos o tubérculos (^{Dibut et al., 2009}).

A las 24 horas de incubación en medios con diferentes fuentes de carbono, no existen diferencias significativas en el crecimiento de las cepas de G. diazotrophicus (tabla 2). Sin embargo, para B. licheniformis y E. agglomerans, se aprecian diferencias en el crecimiento desde las 24 horas, esto era de esperar ya que estas bacterias tienen una tasa de crecimiento mayor que G. diazotrophicus.

Tabla 2 Crecimiento de endófitos de caña de azúcar en medio LGI con diferentes fuentes de carbono medida en cultivos de 5 mL a través de la absorbancia a 600 nm. 

Media de 3 repeticiones. Las letras no comunes indican diferencias significativas (p≤0,05) para la prueba de comparación de medias de Duncan.

Los resultados obtenidos con las cepas de G. diazotrophicus concuerdan con los presentados por ^{Ureta et al. (1995)}. Estos autores observaron que existen diferencias entre cepas de la misma especie en cuanto a la utilización de fuentes de carbono. En este trabajo se observan diferencias en el crecimiento en los medios con xilosa, fructosa, inositol, glucosa y pectina. ^{Rojas et al. (2012)} al identificar 46 aislados de esta especie a partir de varios cultivares de caña de azúcar, demostraron que hay cepas que no crecen en medio con glicerol, manitol, xilosa e inositol como fuentes de carbono, lo que se corresponde con nuestros resultados. En este trabajo se demuestra que existen comportamientos diferentes en el crecimiento para las cepas estudiadas si se analiza cuantitativamente, aún cuando las cepas crezcan en los medios analizados, lo que resulta importante para la futura utilización agrobiotecnológica de estas bacterias. Según han demostrado ^{Dibut et al. (2011)} se obtienen mejores resultados al asperjar el cultivo de G. diazotrophicus a las hojas y el suelo, por lo que la utilización de una amplia gama de fuentes de carbono podría sustentar la sobrevivencia de la bacteria.

^{Lery et al. (2008)} mediante estudios de proteómica, identificaron numerosas proteínas involucradas en el metabolismo de aminoácidos, carbohidratos, y otras, en la cepa Pal5, lo que sustenta la utilización de los compuestos analizados en el presente trabajo, incluso ^{Luna y Boiardi (2007)} demostraron que la utilización de la glucosa depende del pH del medio.

Por otra parte, ^{Galisa et al. (2012)} empleando RT-qPCR demostraron la expresión diferenciada de genes de mantenimiento y otros relacionados con a biosíntesis y el catabolismo, en medio LGI suplementado con diferentes fuentes de carbono, lo que corrobora las diferencias en el crecimiento encontradas en este trabajo.

A las 48 horas de crecimiento para G. diazotrophicus y desde las 24 horas para B. licheniformis y E. agglomerans se aprecia la diferencia existente entre el medio que tiene jugo de caña como fuente de carbono y las otras fuentes de carbono utilizadas. El elevado crecimiento en medio LGI con jugo de caña pudiera deberse a la presencia de vitaminas, proteínas y otros compuestos que favorezcan el crecimiento de los microorganismos. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el medio LGI con jugo de caña y que existen diferencias en la composición del jugo de los cultivares de caña, se decidió comprobar si la procedencia varietal del jugo ejerce influencia sobre el crecimiento de estas especies por la importancia que esto podría representar al formular un medio de cultivo para la aplicación biotecnológica de estas bacterias en la agricultura.

Influencia de jugos de diferentes cultivares de caña de azúcar sobre el crecimiento

A las 24 y 48 horas de cultivo en el medio LGI suplementado con jugo de caña de diferentes variedades a concentraciones de 20 y 30%, no hay diferencias en el crecimiento de las cepas analizadas.

A las 72 h, en el caso de la cepa 4-02 de G. diazotrophicus el crecimiento es significativamente mayor en el medio sin jugo utilizando azúcar comercial al 20 y al 30% (figura 1), lo cual pudiera sugerir que los compuestos presentes en el jugo de la caña de azúcar a determinadas concentraciones estimulan el crecimiento microbiano, pero a partir de una concentración determinada se pudieran producir sustancias que resultan tóxicas e inhiben el crecimiento de algunas cepas.

Figura 1 Crecimiento de cepas endófitas de caña de azúcar, en jugos de diferentes cultivares (C1051-73, C323-68, C86-12 y Ja605) añadidos al 20 y 30% al medio LGI, a las 72 horas de cultivo agitado a 150 rpm a 30⁰C. Letras diferentes indican diferencias significativas dentro de una misma cepa bacteriana para la prueba de comparación de medias de Duncan (p≤0,05). 

Enterobacter agglomerans y B. subtilis a las 72 horas de crecimiento en todos los medios con jugo, superaron en crecimiento al medio LGI con azúcar comercial. En este caso se pudiera pensar en que el jugo de caña ejerce una influencia positiva sobre el crecimiento de las bacterias ya que el jugo de caña contiene cantidades de glucosa y fructosa (0.2-0.6%), nitrógeno orgánico (0.020.04%) y vitaminas (^{Reis et al., 1994}). Además, el pobre crecimiento de estos microorganismos en el medio con azúcar comercial, comparado con el crecimiento en el jugo de caña, pudiera indicar la presencia de residuos de la industria de la caña de azúcar que perjudiquen el crecimiento de las bacterias.

Es notable la diferencia del crecimiento en los medios con jugo de los cultivares C1051-73 y Ja605 al 30% para la cepa de E. agglomerans, las cuales tienen en común el indicador de sólidos solubles (Brix) y el Porcentaje de Pol (Pol: que está constituido fundamentalmente por sacarosa) (Naranjo, S.).

La presencia de grandes cantidades de iones como el K+ y ácidos orgánicos (^{Wealbun et al., 1990}) entre los sólidos solubles pudieran estimular el crecimiento de E. agglomerans, pero es más lógico pensar que influya el porcentaje de Pol, donde fundamentalmente se tiene en cuenta el porcentaje de sacarosa pero también puede estar presentes carbohidratos de mediano peso molecular, que son sustancias ópticamente activas y se ha demostrado que desvían el plano de luz polarizada y pueden influir en las mediciones de sacarosa por polarimetría (^{De Armas et al., 1999}). A su vez, estos carbohidratos pueden ser utilizados por el microorganismo porque son polímeros de fructosa y galactitol (^{Legaz et al., 1992}). Resulta válido aclarar que no se han encontrado en la literatura trabajos que comparen el crecimiento de bacterias en diferentes jugos de caña de azúcar y estos estudios podrían sentar las bases para la formulación de medios de cultivo con fuentes económicas para la aplicación agrobiotecnológica de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal.

Influencia del ácido indolacético y el ácido giberélico en el crecimiento

Son muy pocos los estudios realizados donde se analice la interrelación endófito-planta respecto a la influencia de las fitohormonas en la fisiología de las bacterias.

Para E. agglomerans se observa que las concentraciones de 0,025 y 0,25 mg.L¹ de ambas fitohormonas estimulan el crecimiento comparando con el medio SYP sin hormonas a las 72 horas (figura 2). Esto permite inferir que a estas concentraciones de AIA y GA se produce una inducción del crecimiento igual que ocurre con Azospirillum brasilense en presencia de AIA, lo cual se explica por una regulación estimuladora de los genes que codifican para le enzima indol-3 piruvato descarboxilasa, que está involucrada en la vía de síntesis de AIA por el microorganismo (^{Vande Broek et al., 1999}).

Figura 2 Influencia del ácido indolacético (AIA) y el ácido giberélico (GA) en el crecimiento de endófitos de caña de azúcar a las 72 horas de cultivo en medio SYP suplementado con diferentes concentraciones de hormonas (mg.L^-1). Letras diferentes indican diferencias significativas dentro de una misma cepa bacteriana para la prueba de comparación de medias de Duncan (p≤0,05). 

Por otra parte, el AIA en la planta estimula la síntesis de proteínas debido a que estabiliza el ARN mensajero, lo cual incrementa la tasa de transcripción y el GA3 potencia la presencia de polirribosomas y aumenta el número de ribosomas por célula (^{De Armas et al., 1988}) y pudiera ejercer una acción similar sobre la célula microbiana.