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Revista Colombiana de Biotecnología

versão impressa ISSN 0123-3475

Rev. colomb. biotecnol vol.18 no.2 Bogotá jul./dez. 2016

https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61523 

DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61523

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Infección de callo embriogénico friable de yuca con Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam)

Cassava friable embryogenic calli infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam)

Paula Díaz Tatis*, Carlos Andrés Zárate**, Adriana Bernal Giraldo***, Camilo López Carrascal****

* Manihot biotec, Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, Colombia
padiazta@unal.edu.co
** Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
ca.zarate10@uniandes.edu.co
*** Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
abernal@uniandes.edu.co
**** Manihot biotec, Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, Colombia
celopezc@unal.edu.co

Recibido: agosto 3 de 2016 Aprobado: noviembre 8 de 2016


Resumen

Las nuevas tecnologías para la edición de genomas, como los TALEN y el sistema CRISPR/Cas9, representan una gran oportunidad para mejorar características deseables en diferentes organismos. Los TALEN son el resultado del acoplamiento de nucleasas a los TALE (Transcription Activator-Like Effectors), los cuales son efectores naturales de gran importancia en la patogénesis de las especies de Xanthomonas. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) es el agente causal del añublo bacteriano de la yuca, quien durante el proceso patogénico es capaz de translocar sus efectores a la célula vegetal mediante el sistema de secreción tipo tres (SSTT). Actualmente no hay protocolos estándar para la edición de genomas en yuca. En este estudio se exploró la posibilidad de translocar efectores sobre callo embriogénico friable (CEF) a través de la inoculación con Xam, con el fin de determinar el potencial de este patógeno como sistema de entrega de TALEN. El CEF de dos variedades de yuca susceptibles (COL2215 y cv. 60444) se cocultivaron con la cepa Xam668 a diferentes tiempos. Posteriormente, se evaluó la expresión de marcadores correspondientes a los genes blanco conocidos para los TALE presentes en esta cepa bacteriana. Aunque no se logró demostrar la translocación de los mismos en el tejido embriogénico, sí se lograron establecer condiciones adecuadas de cocultivo con Xam y el efecto que la infección bacteriana tiene sobre la regeneración de embriones a partir de este tejido.

Palabras clave: Cultivo de tejidos vegetales, edición de genomas, sistema de secreción tipo tres, efectores TALE, transformación.


Abstract

New technologies for genome edition, such as TALENs and CRISPR/Cas9 system, are a great opportunity to improve desirable features in different organisms. TALENs are the result from coupling nucleases and TALEs (Transcription Activator-Like Effectors), which are natural effectors with an important role in pathogenicity for the Xanthomonas species. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is the cassava bacterial blight causal agent, and this pathogen is able to translocate its effectors to the plant cell during pathogenesis by using the type-three secretion system (TTSS). Currently, there are no standard protocols for genome edition in cassava. In this study, we explored the possibility to translocate effectors to friable embryogenic calli (FEC) through Xam inoculation, in order to establish the potential of this pathogen as a TALEN delivery system. Friable embryogenic calli derived from two different susceptible varieties (COL2215 and cv. 60444) were co-cultured with the strain Xam668 using different culture times. Subsequently, we evaluated the expression of makers corresponding to reported target genes for TALEs present in this bacterial strain. Although we were not able to demonstrate effector translocation, we established the conditions for co-culturing cassava calli and Xam and determined the effects derived from bacterial infection on embryo regeneration from FECs.

Key words: Genome edition, plant tissue culture, TALEs, transformation, type-three secretion system.


Introducción

La modificación de la información genómica representa una posibilidad con grandes implicaciones ya que permitiría borrar, incorporar o potenciar características deseadas en los diferentes organismos. Clásicamente, la edición de genomas se ha realizado mediante el uso de ADN nucleasas como FokI, cuyo dominio endonucleasa inespecífico corta la doble cadena del ADN cuando se dimeriza (Durai et al., 2005; Carroll, 2008; Carroll, 2011). Tales rupturas en la doble cadena (Double Strand Broken, DSB) son luego reparadas por el sistema de reparación de la célula de tipo unión de extremos no homólogos (Non Homologous End Joining, NHEJ) (Lieber et al., 2009). Para lograr la especificidad en la edición de una región particular de ADN se debe fusionar FokI con una proteína que sea capaz de reconocer una secuencia de ADN específica (Bibikova et al., 2002; Bibikova, 2003). Clásicamente, esto se ha logrado empleando las proteínas que poseen dominios dedos de cinc (Carroll, 2008; Carroll, 2011). Aunque útil, este sistema ha mostrado adolecer de problemas como la baja especificidad e ineficiencia (Park et al., 2016).

Las bacterias Gram negativas fitopatógenas han evolucionado un sistema especializado de inyección de proteínas conocido como sistema de secreción tipo tres (SSTT) que permite el envío de proteínas efectoras al interior de la célula vegetal (Block et al., 2008; Tampakaki et al., 2010). Entre las proteínas efectoras se destacan los TALE, los cuales están presentes en las fitobacterias del género Xanthomonas. Estos efectores modifican la expresión de genes del hospedero a través de la represión de la respuesta de defensa y/o la activación de genes en beneficio de las bacterias (Boch et al., 2014). Su topología típica consta de una región N-terminal, la cual posee una señal responsable de la translocación de la proteína a través del SSTT, una región C-terminal, donde se encuentran dos señales de localización nuclear (SLN) y un dominio de activación transcripcional acídico, y una región central, la cual está compuesta por una serie de repeticiones casi idénticas de 33 a 35 aminoácidos (Bogdanove et al., 2010; Scholze y Boch, 2011). Dentro de cada una de estas repeticiones, las posiciones de los aminoácidos 12 y 13 presentan la mayor variabilidad. Recientemente se estableció que estos dos aminoácidos determinan la especificidad por la secuencia de ADN a la cual se une el efector, a manera de un código. Estas dos posiciones se denominan RVD (Repeat Variabe Diresidue) (Boch et al., 2009). El número de repeticiones determina el largo de la secuencia de nucleótidos a la que se une la proteína sobre el ADN. De esta forma, conociendo el número de repeticiones y los aminoácidos de las posiciones 12 y 13 de cada bloque es posible determinar la secuencia de nucleótidos a la cual se unirá el efector.

Recientemente, con el descubrimiento del código de los TALE, ha sido posible construir módulos de repeticiones, cuyas secuencias confieran especificidad de unión al efector hacia una secuencia de ADN en particular (Geiβler et al., 2011). Estos efectores han sido fusionados al dominio endonucleasa inespecífico de FokI produciendo las así llamadas proteínas TALEN (TALE nucleasas) (Li et al., 2010; Miller et al., 2010). Este sistema ha mostrado ser altamente eficiente y específico para la edición de genomas de un amplio grupo de organismos, el cual incluye plantas (Sander et al., 2011; Tesson et al., 2011; Lei et al., 2012; Li et al., 2012; Cheng et al., 2013). Sin embargo, la edición con TALEN en plantas solo se logra mediante transformación genética utilizando Agrobacterium, pasando por un proceso de generación de organismos genéticamente modificados (OGM), lo que conlleva un problema de aceptación pública.

Dentro de los cultivos que pueden ser objeto de la tecnología de edición de genomas se destaca la yuca, la cual es uno de los principales productos para la seguridad alimentaria mundial. La yuca representa una de las mayores fuentes de calorías para más de 1000 millones de personas en el mundo, principalmente de las regiones tropicales (Taylor et al., 2012). El mejoramiento tradicional de yuca si bien ha logrado generar variedades con características deseadas, es un proceso largo. El desarrollo de estrategias biotecnológicas alternativas, tales como la edición del genoma, permitiría desarrollar variedades mejoradas para rasgos de interés de manera más rápida. La producción de yuca puede verse afectada por varias enfermedades, dentro de las cuales la bacteriosis vascular o añublo bacteriano, ocasionado por Xam, es una de las más limitantes. La bacteriosis se presenta en todas las regiones donde se cultiva la yuca (López & Bernal, 2012; FAO, 2013). Los estudios sobre el genoma de diferentes cepas de Xam (Bart et al., 2012; Arrieta-Ortiz et al., 2013) han permitido identificar la presencia de un TALE, denominado TALE1Xam, el cual es responsable en gran medida de la virulencia de Xam (Castiblanco et al., 2012). Mediante análisis de transcriptoma se pudo demostrar que el TAL20Xam668 es capaz de activar la transcripción de un transportador de sacarosa en las células de yuca (MeSweet10a), cuya sobreexpresión es crítica para la formación de lesiones durante el proceso patogénico (Cohn et al., 2014).

La presencia de los TALE en Xam plantea la posibilidad de que esta bacteria sea capaz de liberar al interior de las células de yuca TALEN dirigidos a secuencias de ADN genómico de manera específica para su posible edición. Esta estrategia aliviaría las controversias sobre el empleo de plantas transgénicas y su aceptación social. En este estudio se evaluó a manera de prueba de concepto la posibilidad de que Xam pueda liberar naturalmente TALE a células de yuca de CEF, tejido que se utiliza normalmente para la regeneración de plantas. Para ello, en primera medida se evaluó la capacidad de infección de CEF por parte de Xanthomonas y posteriormente se evaluó la expresión de genes blanco de TALEs como una medida de la liberación de TALEs dentro de las células de CEF.

Materiales y métodos

Material vegetal

Plantas de yuca in vitro de las variedades COL2215 y cv. 60444 fueron obtenidas del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia. Las plantas se multiplicaron en medio basal Murashige y Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962) como ha sido descrito previamente (Bull et al., 2009; Taylor et al., 2012). El CEF se generó mediante la metodología previamente descrita (Taylor et al., 1996; Bull et al., 2009). Brevemente, se tomaron plantas in vitro de cuatro semanas, se indujo el desarrollo de yemas axilares para la obtención de estructuras embriogénicas organizadas (EEO). Estas estructuras se cultivaron en medio MS suplementado con picloram 50 µM durante tres semanas, posteriormente se realizaron cortes sobre las mismas con un bisturí y se transfirieron a medio basal Greshoff y Doy (GD) (Gresshoff & Doy, 1972) suplementado con picloram 50 µM para inducir la formación de CEF. El tejido se subcultivó en el mismo medio cada tres semanas hasta su inoculación.

Inoculación del CEF y regeneración

La evaluación del efecto de carbenicilina y cefotaxima sobre el crecimiento de Xam se realizó en medio LPGA (5 g/L extracto de levadura, 5 g/L glucosa, 5 g/L peptona y 15 g/L agar) suplementado con cada uno de los antibióticos a las siguientes concentraciones: carbenicilina 100 mg/L (car100) y 200 mg/L (car200), cefotaxima 500 mg/L (cefo500) y 1000 mg/L (cefo1000). Se emplearon tres réplicas por tratamiento con el respectivo antibiótico. Posteriormente se incubaron las respectivas cajas de Petri a 28 °C durante 48 h.

Para la infección del CEF se empleó la cepa Xam668, para la cual se han descrito y validado experimentalmente genes blanco de TAL20Xam668 y TAL14Xam668 (Cohn et al., 2014; Cohn et al., 2016). Inicialmente, la bacteria se aisló en medio LPGA a partir del banco de conservación. La bacteria se incubó durante dos días a 28 °C y, posteriormente, a partir de una colonia aislada, se inoculó caldo LPG (5 g/L extracto de levadura, 5 g/L glucosa y 5 g/L peptona). El cultivo se incubó durante 24 h a 28 °C y 250 rpm, posteriormente se centrifugó durante 15 min a 4000 rpm y se realizaron dos lavados sucesivos del pellet con MgCl2 10 mM. La concentración de la suspensión bacteriana se ajustó a una DO600nm= 0,7. Se inocularon 4 clústeres de CEF por tratamiento (cada clúster con un área aproximada de 30 mm2). Cada clúster se inoculó con 80 µL de la suspensión bacteriana y se realizó un cocultivo con Xam durante 12, 24, 36, 48 y 72 h en medio básico de sales GD suplementado con picloram 50 µM. El cocultivo se mantuvo a 28 °C con fotoperiodo (12 h/12 h luz/oscuridad). Como control se empleó MgCl2 10 mM. Después de cada cocultivo, se colocaron tres clústeres de CEF en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para la posterior extracción de ARN. Con el fin de evaluar la regeneración de embriones, el clúster restante se cultivó en medio de organogénesis de yuca (COM) (sales MS, 20 g/L sacarosa, 1 mg/L BAP, 0,5 mg/L IBA, 2 μM CuS04) (Li et al., 1996) suplementado con cefotaxima 500 mg/L.

Extracción de ARN y síntesis de ADNc

El tejido proveniente de los tres clústeres de CEF se maceró en nitrógeno líquido y se realizó la extracción de ARN con 100 mg de tejido. Para esto se empleó el kit Invitrap ® Spin plant RNA (STRATEC, Berlín, GER). El tratamiento con DNasaI (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) se realizó sobre 1 µg de ARN total. La ausencia de contaminación con ADN genómico se verificó mediante PCR con iniciadores de β-tubulina (tabla 1). La síntesis de ADNc se llevó a cabo empleando el First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA).

PCR sobre ADNc y ADN genómico

Para la reacción de amplificación se utilizó la DreamTaqTM DNA polymerase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). El volumen final de cada reacción fue de 10 µL (20 nM de iniciadores, 40 nM de mezcla de dNTPs, 0,25 U de DreamTaqTM DNA polymerase, 1X DreamTaqTM buffer con MgCl2). Se agregaron 2 µL del ADNc (obtenido como se describió previamente), 50 ng de ADN genómico para el control positivo o agua ultrapura para el control negativo. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: denaturación inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 30 ciclos de amplificación (denaturación a 95 °C durante 30 segundos, anillamiento a 52 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 30 segundos), seguidos de una extensión final a 72 °C durante 10 min y una incubación final a 20 °C durante 10 min. Los sets de primes empleados se muestran en la tabla 1. Los resultados de las reacciones de PCR se evidenciaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.2%.

Resultados

Infección de CEF con Xam y cocultivo

Con el fin de evaluar la capacidad de Xam para infectar e inyectar TALE en tejido embriogénico de yuca, se inocularon CEF obtenidos de las variedades susceptibles cv. 60444 y COL2215 con Xam668. Se empleó esta cepa de Xam ya que los blancos de dos de sus efectores, TAL20Xam668 y TAL14Xam668, han sido reportados y validados experimentalmente (Cohn et al., 2014; Cohn et al., 2016).

Dado que no se cuenta con información previa sobre la cinética de infección de Xam en el CEF de yuca, se decidió evaluar distintos tiempos de cocultivo entre 12 y 72 h. En el CEF cocultivado durante 48 y 72 h con Xam668 se observó un ligero crecimiento bacteriano a manera de corona alrededor del CEF. Esto no se observó para el CEF cocultivado durante 12, 24 y 36 h (tabla 2).

Selección de antibiótico para CEF inoculado con Xam

Una vez el CEF se infecta con Xam, es necesario eliminar la bacteria antes de continuar con el proceso de regeneración de las plantas. Con el fin de evaluar el efecto de dos antibióticos sobre el crecimiento de Xam, la cepa Xam668 se cultivó en medio suplementado con carbenicilina y se evaluaron dos concentraciones: 100 mg/L (Car100) y 200 mg/L (Car200). De la misma manera, se evaluó el crecimiento de Xam668 en medio suplementado con dos concentraciones de cefotaxima, 500 mg/L (Cefo500) y 1000 mg/L (Cefo1000). Estos antibióticos y sus respectivas concentraciones se seleccionaron teniendo en cuenta reportes previos del control bacteriano sobre Agrobacterium tumefaciens luego del cocultivo y la regeneración de embriones en yuca (Hankoua et al., 2006; Taylor et al., 2012). Después de 48 h de incubación, se observó crecimiento de Xam668 en el medio suplementado con Car100, pero no en Car200. Por otro lado, las dos concentraciones de cefotaxima evaluadas (Cefo500 y Cefo1000) inhibieron el crecimiento de Xam. Dado que en nuestro laboratorio se ha empleado de manera exitosa cefotaxima para restringir el crecimiento de A. tumefaciens después del cocultivo del CEF, se decidió emplear este mismo antibiótico para controlar el crecimiento de Xam en el tejido embriogénico durante la regeneración.

Regeneración de embriones infectados con Xam

Con el objeto de examinar la regeneración de embriones a partir de CEF inoculado con Xam, se transfirió el CEF a medio de organogénesis de yuca (COM) y se mantuvo en observación continua para evaluar la proliferación de embriones. Después de un mes se observó la regeneración de embriones en el tejido embriogénico proveniente de COL2215 cocultivado con Xam durante 24 h. En los demás tratamientos no se logró detectar el desarrollo de embriones, incluyendo el CEF tratado con la solución del control con MgCl2 (tabla 2). El hecho de no haber observado desarrollo de embriones en los otros tratamientos, incluyendo los controles, está relacionado con la baja eficiencia del mismo para producir embriones luego de varios pases de cultivo en medio GD.

Por otro lado, se observó una reactivación del crecimiento de Xam para el material cocultivado durante 24, 48 y 72 h con Xam668 (tabla 2). Es posible que después de cuatro semanas de cultivo en medio de regeneración, el antibiótico pierda su estabilidad en el medio, explicando así la reactivación de Xam para ambos genotipos. La reactivación del crecimiento de Xam fue más notoria en el cocultivo de 24 h con el CEF del cultivar COL2215. De manera interesante, la reactivación de Xam en este tratamiento no afectó negativamente la producción de embriones (tabla 2, cocultivo de 24 h del cultivar COL2215). Estos resultados sugieren que la activación del crecimiento de Xam podría ser dependiente del cultivar, ya que en el tejido embriogénico de cv.60444 cocultivado con Xam durante 72 h, el crecimiento de Xam fue mucho menor comparado con el tejido embriogénico de COL2215.

Expresión de genes inducidos por dos TALE de Xam668 en CEF

Estudios previos han mostrado que la cepa Xam668 es capaz de inducir la expresión de genes en yuca con el fin de promover su patogenicidad. Dentro de estos genes blanco se destacan cassava4.1_013474 (MeSweet10a) inducido por el TAL20Xam668 y cassava4.1_007568 (pectato liasa) inducido por el TAL14Xam668 (Cohn et al., 2014), los cuales han sido validados experimentalmente. Con el fin de evaluar la capacidad de Xam668 para inyectar sus TALE a CEF de yuca e inducir la expresión de los genes blanco, se evaluó la expresión de los genes MeSweet10a y pectato liasa.

A partir del CEF de yuca infectado con Xam668 (tabla 2), se realizó la extracción de ARN y síntesis de ADNc. En la figura 1 se muestran los resultados de la extracción, en donde se observa la presencia de un ARN total de buena calidad en la mayoría de las muestras. Como control de la extracción se empleó tejido vegetal de tallos de yuca, procedimiento que está estandarizado en nuestros laboratorios. Se encontró que el ARN obtenido a partir del tejido embriogénico cocultivado con Xam durante 48 y 72 h es de menor calidad y concentración en comparación con el tejido embriogénico tratado con MgCl2 (control). Esto sugiere que el crecimiento de Xam en el CEF interfiere de alguna forma con la obtención de ARN total.

A partir del ARN obtenido se llevó a cabo la síntesis de ADNc de cada una de las muestras. Como control de gen de referencia se emplearon iniciadores que permiten amplificar un producto de 230 pb del último exón del gen que codifica para la β-tubulina (tabla 1). Una vez sintetizada la primera cadena de ADNc se procedió a realizar una PCR para corroborar la correcta síntesis, utilizando los iniciadores de β-tubulina. Debido a la baja calidad de los ARN obtenidos no se observó amplificación del gen de referencia en algunas muestras (cv. 60444 cocultivo de 36 h y 72 h). Teniendo en cuenta lo anterior, se decidió evaluar la expresión por RT-PCR de solo las muestras en las que se detectó el amplicón del gen de referencia (COL2215 control con MgCl2, cocultivo de 24 h y 72 h con Xam668). En la figura 2 se muestran los niveles de expresión para el gen de referencia (β-tubulina), MeSweet10a y pectato liasa a 25 ciclos de amplificación. Se observa que no hay expresión del gen MeSweet10a ni de la pectato liasa, en ninguna de las muestras evaluadas. Esto sugiere que la inoculación del CEF con Xam668 no indujo la expresión de genes blanco de TAL20Xam668. Con el fin de corroborar esto, se decidió repetir la PCR a 35 ciclos (figura 3). Estos resultados muestran que el gen MeSweet10a no se encuentra inducido en CEF de yuca, después de la inoculación con Xam668. De manera similar, el gen que codifica para una pectato liasa (Manes.03G152600) parece estar reprimido a 24 y 72 h después del cocultivo con Xam668 (figura 3).

Discusión

Recientemente, ha aumentado de manera exponencial el número de estudios encaminados hacia la edición genómica. Sin embargo, en yuca aún no existen reportes sobre edición genómica mediada por la tecnología de TALEN o CRISPR/Cas9. En este trabajo se realizó una primera aproximación para evaluar la capacidad de Xam668 para inyectar efectores que modulen la expresión de genes en el CEF, tejido embriogénico de yuca ampliamente usado en transformación genética. Para esto se cocultivaron CEF provenientes de dos variedades susceptibles de yuca (COL2215 y cv. 60444) con la cepa patogénica Xam668 y se evaluó la inducción de la expresión de los genes blanco de TAL20Xam668 y TAL14Xam668. Nuestros resultados muestran que la bacteria puede proliferar sobre el tejido embriogénico y que en algunos casos el tejido embrionario infectado con Xam permite la regeneración. Sin embargo, se determinó que Xam668 no es capaz de inyectar sus TALE al interior del CEF de yuca, ya que no se observó la inducción de MeSweet10a ni de pectato liasa, los cuales son los genes blanco de TAL20Xam668 y TAL14Xam668, respectivamente. El gen MeSweet10a codifica para un transportador se azúcar y se ha propuesto que la inducción de este gen conduce a la movilización de glucosa y sacarosa desde el interior de la célula vegetal al apoplasto, para así favorecer el crecimiento bacteriano. Sin embargo, en yuca la presencia de TAL20Xam668 no se relacionó con el crecimiento de Xam en la hoja (Chen et al., 2010; Cohn et al., 2014). Por otro lado, se cree que la pectato liasa podría estar involucrada en los procesos de colonización en tejidos vasculares y foliares, aunque esto no se ha comprobado experimentalmente.

Una posible explicación para la falta de activación de la expresión de genes blanco de TAL20Xam668 podría ser la falta de inducción del SSTT de Xam en el CEF de yuca. Se sabe que el envío de efectores está condicionado por varios factores ambientales en el apoplasto de la planta. Una vez que las bacterias fitopatógenas perciben las condiciones ambientales del apoplasto (pH bajo, baja presión osmótica, etc.) inducen la formación del pilus Hrp (Hypersensitive Response and Pathogenicity) (Wei et al., 1992; Tang et al., 2006) y es a través de este pilus que las proteínas efectoras viajan hacia el interior de la célula vegetal. Es posible que Xam, al no encontrarse en el apoplasto vegetal, no logre inducir la formación del pilus Hrp y, por lo tanto, no se trasfieran sus efectores al interior de las células vegetales. Se sabe que las células que conforman el CEF son células pequeñas, multivacuoladas y que presentan una pared celular muy delgada (Taylor et al., 1996). Además, este tejido carece de gránulos de almidón y la concentración de azúcares es distinta a la de otros tejidos (Ma et al., 2015). Esto indica que el tejido vegetal adulto que usualmente es infectado por Xam (hojas y tallo) difiere mucho del tejido no diferenciado que conforma el CEF. Adicionalmente, este tejido ha sido subcultivado repetidamente en medios con altas concentraciones de hormonas (auxinas principalmente), por lo tanto, el CEF infectado con Xam contiene una carga hormonal mucho más alta que afecta su fisiología (Ma et al., 2015).

Una posible alternativa podría ser cocultivar Xam con otros tejidos organogénicos o embriogénicos y evaluar la inducción de blancos de los TALE y la regeneración de las plantas. En yuca se han empleado cotiledones somáticos para transformación genética estable, pero con una muy baja eficiencia y un alto número de escapes, razón por la cual el CEF sigue siendo el tejido más exitoso para transformación genética (Li et al., 1996; Taylor et al., 2004; Liu et al., 2011; Taylor et al., 2012).

Otra estrategia, teniendo en cuenta la capacidad de regeneración del CEF, es el empleo de inductores del SSTT en Xanthomonas antes del cocultivo con el tejido embriogénico. Tanto en Pseudomonas syringae como en Xanthomonas spp., se han empleado medios mínimos para inducir la expresión de los genes del SSTT y la transferencia de proteínas efectoras (He et al., 1993; Jiang et al., 2013; Li et al., 2014).

Por otro lado, en este trabajo se evaluó la regeneración de embriones a partir de CEF cocultivado con Xam. Se detectó la regeneración de embriones únicamente a partir de CEF con sobrecrecimiento de Xam. Esto sugiere que la inoculación con Xam no afecta negativamente el desarrollo de embriones a partir de CEF provenientes de la variedad COL2215. En los otros tratamientos no se observó regeneración de embriones, lo cual puede estar relacionado con la edad del tejido empleado en el ensayo. Se ha reportado que el empleo de un CEF con varios pases de cultivo disminuye drásticamente la regeneración de embriones (Taylor et al., 2012).

Conclusiones

Si bien la estrategia de emplear Xam para introducir TALEN con el fin de editar regiones genómicas de yuca resulta atractiva, es un proceso que requiere el ajuste de varias etapas. Este estudio representa un primer esfuerzo por identificar los pasos críticos dentro del proceso. Aunque no se logró demostrar la liberación de los TALE en el CEF, sí se logró establecer las condiciones adecuadas de cocultivo con Xam y se determinó el efecto de la infección con esta bacteria sobre la regeneración de embriones a partir de CEF. También se logró establecer estrategias alternativas que permitirían ajustar la metodología con el fin de lograr la introducción de TALE al CEF de yuca. Una vez superadas estas etapas se abrirían importantes posibilidades en la edición genómica de yuca sin necesidad de generar plantas transgénicas.

Agradecimientos

A la Vicerrectoría Académica de la Universidad Nacional de Colombia, por la Beca de Estudiante Sobresaliente de Posgrado de PADT. A la Facultad de Ciencias de la Universidad de los Andes, por la financiación del proyecto de investigación titulado: Edición de genoma empleando TALEN mediado por Xanthomonas: prueba de concepto. A Paul Chavarriaga, del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), por el apoyo para la generación del callo embriogénico friable. A Ralf Koebnik por la asesoría en el desarrollo del proyecto.


Referencias bibliográficas

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