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Revista Colombiana de Biotecnología

versão impressa ISSN 0123-3475

Rev. colomb. biotecnol vol.18 no.2 Bogotá jul./dez. 2016

https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61529 

DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61529

ARTÍCULO DE REVISIÓN

Principales promotores utilizados en la transformación genética de plantas

Main promoters used in plant genetic transformation

Zoraya M De Guglielmo C*, Rafael Fernandez Da Silva**

* PhD. Ciencias. Lab. Genética Molecular-Instituto de Oncología y Hematología-MPPS, Caracas, Venezuela.
zdegugli@gmail.com
** PhD. Ciencias. Centro de Biotecnología Aplicada (CBA), Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología-Universidad de Carabobo, Carabobo, Venezuela
rafaelfer2103@hotmail.com

Recibido: febrero 10 de 2016 Aprobado: octubre 3 de 2016


Resumen

El conocimiento pleno de los promotores determina el éxito en la obtención de nuevos cultivares de plantas a través de técnicas biotecnológicas, ya que dicha secuencia del ADN regula la transcripción de otras regiones adyacentes o cercanas, encontrándose los siguientes promotores: constitutivos, tejido-específicos o estadio-específicos, inducibles y sintéticos. En esta revisión se resume de manera precisa los conceptos, ventajas y limitaciones de los distintos tipos de promotores, con ejemplos claros de ello.

Palabras clave: Promotor, biotecnología vegetal, transcripción genética.


Abstract

Full knowledge of promoters determines success in obtaining new plant cultivars through biotechnology techniques. This DNA sequence regulates the transcription of adjacent or nearby regions, which are mainly constitutive, tissue-specific or stage-specific, inducible and synthetic. This review summarizes the precise concepts, advantages and limitations of different types of promoters, including clear examples of them.

Key words: Promoter, plant biotechnology, gene transcription.


Introducción

El desarrollo de nuevos cultivares que satisfagan las crecientes y diversas necesidades agroalimentarias y médico-farmacéuticas e industriales se fundamenta en la aplicación de técnicas biotecnológicas de avanzada, en particular la optimización de sistemas eficientes de transformación genética, donde la inserción de diferentes secuencias génicas de interés juega un papel preponderante. La expresión estable de dichos noveles genes en las plantas está determinado esencialmente por las secuencias promotoras (Porto et al., 2014). En este sentido, en la regulación de la expresión genética intervienen "señales" que actúan sobre genes que codifican proteínas. Dentro de estas señales reguladoras, las llamadas moléculas cis-acting controlan la expresión de secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) físicamente adyacentes y funcionales, mientras que las trans-acting influyen en la expresión de genes distantes, incluso ubicados en cromosomas diferentes. Dicha regulación depende en gran medida de elementos reguladores conocidos como promotores (Potenza et al., 2004).En los procedimientos de transformación genética vegetal es fundamental todo lo relacionado al control de expresión de transgenes en cultivos de importancia económica como el café (Fernández & Menéndez, 2002; Fernández et al., 2010), de allí la importancia de estudiar y conocer la disponibilidad y funcionamiento de los distintos tipos de promotores genéticos vegetales, incluyendo ventajas, desventajas y limitaciones, el cual es el objetivo de la presente revisión.

Concepto de promotor

Se considera que los promotores son regiones reguladoras cis-acting que dirigen la transcripción de otras regiones adyacentes o cercanas al ácido ribonucleico mensajero (ARNm), el cual es traducido en proteínas. Funcionalmente, un promotor es una secuencia de ADN localizada "upstream" o "aguas arriba" (hacia el extremo 5' de la región codificante de un gen) que incluye las regiones de enlazamiento para factores de transcripción (Potenza et al., 2004). Generalmente se asume que las secuencias promotoras se enlazan a la enzima ARN Polimerasa II, encargada de la producción del ARN. Sin embargo, existen secuencias de ADN dentro de una región promotora que actúan como sitios de unión para factores de transcripción trans-acting que pueden activar o inhibir la transcripción de un gen. Así, un promotor incluye distintos elementos estructurales que pueden tener interacciones funcionales complejas (Rodríguez & Chamberlin, 1982; NEPAD, 2010). Los promotores en general se dividen en dos regiones: una región central o núcleo del promotor y regiones de regulación aguas arriba. El núcleo del promotor consiste en una secuencia de 50-100 pb adyacente al sitio de iniciación que interactúa con la maquinaria de transcripción y asegura su inicio por la ARN polimerasa II; posee una caja TATA o caja de "Hogness" (secuencia consenso de ADN, rica en adenina y timina) y/o un elemento iniciador que se enlaza a elementos "tras-acting" y también puede mediar el inicio de la transcripción en algunos promotores que no tienen caja TATA (Dutt et al., 2014).

Así, las partes de un promotor son las siguientes (Dutt et al., 2014):

  1. Promotor mínimo o núcleo del promotor: se localiza hasta 100 pares de bases "aguas arriba" y está constituido por la caja TATA(sitio de ensamblaje del complejo de iniciación por la ARN polimerasa II),

  2. Secuencias reguladoras proximales(constituidas por las cajas CAAT y GC a las que se unen proteínas y factores de transcripción que facilitan el ensamblaje del complejo de iniciación) y

  3. Secuencias reguladoras distales(se localizan a más de 100 pb "aguas arriba" del sitio de iniciación de la transcripción y regulan la actividad del núcleo del promotor) que son de dos tipos:

    1. Intensificadores o "enhancer", secuencias de acción cis que potencian la tasa de transcripción de los promotores que se encuentran en la misma molécula, a los que se unen factores de transcripción activadores;

    2. Silenciadores, inhibidores o "silencers", secuencias de acción cis a las que se unen represores, inhibiendo a los activadores y reduciendo el nivel de transcripción (Rodríguez & Chamberlin, 1982).

Importancia del estudio de los promotores

El interés en los promotores radica en el potencial que ofrecen para regular y controlar la expresión de genes de interés en organismos silvestres y en aquellos modificados genéticamente. Actualmente son muy estudiados en procesos biotecnológicos, ya que no solo pueden incrementar la actividad transcripcional sino también proporcionar niveles adicionales de control, por ej., a nivel de la expresión tejido o estadio-específica de un gen (CAMBIA, 2003).Distintos investigadores profundizan en el estudio de las regiones promotoras, sus componentes e interacciones, así como en la búsqueda de nuevos promotores vegetales que dirijan altos niveles de expresión transgénica estable y hagan posible la introducción de múltiples transgenes en células vegetales eliminando, al mismo tiempo, el riesgo de silenciamiento genético dependiente de homología (Xiao et al., 2005; Park et al., 2012). Este fenómeno se ha observado en numerosas plantas transgénicas y puede involucrar interacciones entre elementos repetitivos próximos ubicados en una molécula de ADN o secuencias homólogas en moléculas separadas, en posiciones alélicas o no alélicas (Jakowitsch et al., 1999).

Tipos de promotores

Con base en el funcionamiento, tipo y nivel de expresión genética observado, los promotores usados en la Ingeniería Genética Vegetal se han clasificado en: constitutivos, tejido-específicos o estadio-específicos, inducibles y sintéticos. La escogencia del promotor usado en una construcción transgénica depende fundamentalmente de los objetivos del proyecto de ingeniería (Potenza et al., 2004; Porto et al., 2014).

1. Promotores constitutivos

Inducen la expresión de genes ubicados "downstream" o "aguas abajo" en todos o, al menos, en la mayoría de los tejidos del organismo, independientemente de factores ambientales o del estadio de desarrollo. Justamente, la principal ventaja de estos promotores es que generalmente promueven altos niveles de expresión transgénica independiente del tejido o estadio, por lo que han sido ampliamente utilizados en la transformación de mono y dicotiledóneas, especialmente para la detección y/o selección de células o plantas transformadas (Park et al., 2010). Los primeros promotores constitutivos usados para regular la expresión transgénica en plantas fueron aislados de patógenos vegetales, como los promotores de Opinas y el promotor CaMV35S aislado a comienzo de los años 80 del virus del mosaico del coliflor y usado ampliamente en sistemas transgénicos. Uno de sus derivados, el promotor CaMV19S, ha sido usado con menos frecuencia a pesar de tener una alta funcionalidad (CAMBIA, 2003). Otros promotores de origen viral con actividad similar o mejor al CaMV35S incluyen el promotor del virus del mosaico de la yuca CsVMV, el del virus de la hoja del cestrum amarillo, el del virus rayado de banana BSV y el promotor FMV-35S ("Figwort Mosaic Virus") de un virus de coliflor relacionado con el CaMV35S; cabe mencionar que estos dos promotores son ampliamente utilizados en pruebas para la detección molecular de organismos modificados genéticamente (Sangers et al., 1990; Schenk et al., 2001; Li et al., 2001; Dorries et al., 2010; Dutt et al., 2014).

Aunque estos promotores dirigen altos niveles de expresión transgénica en dicotiledóneas, su efectividad en monocotiledóneas, especialmente en cereales, es considerablemente menor, particularmente a largo plazo (Dahleen et al., 2001; Dutt et al., 2014). Al respecto, en algunas monocotiledóneas, como cereales, se ha encontrado que secuencias presentes en el extremo 5' de regiones transcritas no traducidas (intrones) de ciertos genes estructurales son esenciales para la eficiencia de la expresión genética. De esta manera, los promotores que funcionan bien en dicotiledóneas que carecen de tales intrones, generalmente no funcionan bien en monocotiledóneas (CAMBIA, 2003). Otras de las limitaciones de estos promotores es justamente el origen viral y la percepción del posible efecto negativo que pudiera implicar su uso en la transformación vegetal para la salud humana (Hull et al., 2000); algunos investigadores han señalado que el silenciamiento de los transgenes pudiera ser menor al usar promotores constitutivos de origen vegetal (Potenza et al., 2004).Así, la actividad de promotores derivados de monocotiledóneas es generalmente mayor o más eficiente en este grupo de plantas que en dicotiledóneas. Los más conocidos son los promotores de la Ubiquitina, proteína involucrada en diversos procesos celulares como la reparación del ADN y la estructura de la cromatina, y los promotores de actinas, componente fundamental del citoesqueleto vegetal. Destacan los promotores de Ubiquitina de maíz (Ubi 1 y Ubi 2), identificados por A. Christensen, R Sahrrock y P Quail en 1992 y de Nicotiana sylvestris (Ubi U4) donde se han identificado dos elementos de acción cis que parecen ser críticos para la expresión genética (Plesse et al., 2001).

El promotor de la actina de arroz (Act 1) fue identificado por Mc Elroy y colaboradores (1990) y es frecuentemente usado en sistemas de cereales; también se ha descrito el promotor Act 2 de Arabidopsis. Existen elementos de choque térmico de la región reguladora del promotor Ubi que incrementan la expresión de la proteína ubiquitina en respuesta a estrés térmico, lo que le da carácter inducible, mientras que Act 1, a pesar de tener expresión constitutiva, tiene mayor actividad en la raíz, lo que le confiere cierto carácter tejido-específico (Dahleen et al., 2001; Gupta et al., 2001; CAMBIA, 2003; Potenza et al., 2004). Sin embargo, para monocotiledóneas no cereales la efectividad del promotor CaMV35S incrementa considerablemente cuando se le emplea duplicado (Kanno et al., 2000). En este sentido, la duplicación de dicho promotor parece tener un efecto "enhancer" en la regulación de la expresión transgénica. A pesar de que el promotor CaMV35S es, al parecer, más fuerte que otros promotores constitutivos, los promotores Act 1 y Ubi 1 tienen la ventaja, desde el punto de vista de la bioseguridad, de ser de origen vegetal; algunos investigadores también han informadoque, si bien el número de transformantes iniciales obtenidos con el promotor CaMV35S es más elevado que con el Ubi 1 o el Act 1, con el primero pudiera ser igualmente mayor el eventual silenciamiento observado (Dahleen et al., 2001).

A pesar de que los promotores constitutivos actúan en todos los tejidos, cada vez que se insertan genes regulados por este tipo de promotores se observan diferencias en cuanto a la especificidad para el tejido o el grado de expresión de los genes bajo su control. En consecuencia, aun cuando se activan los genes, no siempre se activan en el mismo grado en todos los tejidos en los distintos estadios de desarrollo (Rodríguez & Chamberlin, 1982). Por ej., el promotor ZmUbi 1 es ampliamente usado en cultivos de monocotiledóneas debido a que dirige altos niveles de expresión en la mayoría de los tejidos de plantas jóvenes, pero estos niveles disminuyen marcadamente a medida que los tejidos maduran (Cornejo et al., 1993). Así, el promotor se selecciona sobre la base de la especie vegetal, del gen que se quiere insertar y el tejido o la etapa del desarrollo en los cuales se va a expresar el gen, lo que a su vez se determina realizando pruebas donde varíen cada uno de los parámetros involucrados.

Los promotores CaMV35S, Ubi y Act, han sido utilizados en distintos protocolos:

Steinitz et al. (2002), transformaron algodón con el gen cryIA(c) (correspondiente a proteínas insecticidas de Bacillus Thuringiensis) bajo el control del promotor CaMV35S, al igual que Ahmad et al. (2002), en arroz.

Leroy et al. (2000), trabajando en transformación de café utilizaron este mismo promotor duplicado, con lo cual demostraron un efecto "enhancer" o intensificador en la regulación de la expresión del gen csr1-1 aislado de Arabidopsis thaliana, el cual confiere resistencia al herbicida clorosulfurón, usado como marcador de selección. También usaron el promotor EF1α de A. thaliana, cuya eficiencia ya había sido probada por van Boxtel et al. (1995), junto con la secuencia "enhancer" o intensificadora Ω (secuencia líder no traducida en el extremo 5'del ARNm), derivada del virus del mosaico del tabaco. Sin embargo, la eficiencia de transformación fue mayor con el promotor CaMV35S. Este promotor también controló la expresión del gen reportero gus en la estandarización de los parámetros de transformación de café mediante biobalística (De Guglielmo et al., 2010).

Sági et al. (1995), al transformar banano y plátano, estudiaron la regulación de varios promotores en la expresión del gen reportero gus, mediante ensayo histoquímico y fluorométrico. Los promotores utilizados fueron el CaMV35S duplicado, el Emu y el Ubi, de los cuales el último resultó ser más eficiente. Este promotor también ha sido asociado a altos niveles de expresión en otras monocotiledóneas tales como maíz, avena y caña de azúcar y, como ya se mencionó, tiene la ventaja sobre el CaMV35S de ser un promotor de origen vegetal.

Sardana et al. (1996), usaron de manera efectiva el promotor Ubi 1 para lograr la expresión de toxinas cryIA en endospermo de maíz, como modelo de monocotiledóneas. Estos autores realizaron pruebas usando el promotor CaMV35S y obtuvieron mayor expresión con el primero que con el segundo, lo cual era de esperarse considerando que dicho promotor actuaba en su tejido materno. La expresión también fue mayor al utilizar toxinas sintéticas con mayor porcentaje G+C y de esta manera evidenciaron que la regulación de la expresión no sólo depende del promotor sino también de la especie vegetal y del contenido de pares de base de la secuencia de interés, lo que puede interferir en los fenómenos de homología. Esto también pudiera afectar la estabilidad de la secuencia de un ADN foráneo dado.

Cheng et al. (1998), lograron la expresión de las mismas toxinas en arroz, usando tres promotores: CaMV35S (constitutivo), Ubi1 de maíz (constitutivo) y Bp10 de Brassica, específico para polen. Con el último la expresión fue tejido específica e inducible y en el caso de los dos primeros fue mayor con el CaMV35S, probablemente debido a la fuerza de este promotor. Chen et al. (1998), usaron con éxito este mismo promotor en arroz para regular la expresión de los genes hpt (de resistencia a la higromicina) y gus.

Recientemente, el gen Ubi 1 fue usado exitosamente en la transformación de trigo mediante biobalística para liberar (E)-β -farnesene synthase (Eβ fS), la feromona de alarma para muchas plagas de áfidos, convirtiéndose en el primer cultivo vegetal manipulado genéticamente para expresar este tipo de enzimas como un mecanismo de defensa (Bruce et al., 2015).

Al-Kaff et al. (2000), colocaron el gen de la resistencia al herbicida bialaphos (bar) bajo el control del promotor CaMV35S. Los autores reportan que debido al origen viral del promotor, la infección por CaMV puede desestabilizar características genéticas comercialmente importantes en semillas de oleaginosas, a partir de la observación del silenciamiento del transgen bar, cambiando el fenotipo de la planta de resistente a susceptible al herbicida.

Cho et al. (2001), utilizaron el promotor CaMV35S para transformar repollo chino con el gen cry1ac unido a la secuencia "enhancer" o intensificadora delta omega ΔΩ (secuencia omega modificada por ingeniería genética) del virus del mosaico del tabaco, con lo cual incrementaron la eficiencia de la transformación en comparación a lo reportado para el promotor sin "enhancer" o intensificador.

Los vectores binarios pCAMBIA1301 y pCAMBIA2301 conteniendo los genes reporteros gus y gfp (proteína verde fluorescente), respectivamente, bajo el control del promotor constitutivo de la Nopalina Sintetasa (NOS) y del terminador 35S del virus del mosaico del coliflor, fueron usados para la transformación de ñame amarillo Dioscorea rotundata, un importante cultivo en países tropicales que en los últimos años se ha visto afectado por niveles crecientes de plagas y enfermedades y que además carece de un sistema eficiente de transformación y regeneración. Nyaboga et al. (2014), reportaron la regeneración completa 3 a 4 meses después de la transformación, con una eficiencia de 9,4 a 18,2 %, señalando a este sistema de transformación mediado por A. tumefaciens como una plataforma útil para futuros estudios de ingeniería genética en esta especie agronómica y económicamente importante.

Htwe et al. (2014) trabajando con explantes de arroz, utilizaron el plásmido pCAMBIA1304 portador del gen marcador de selección hpt (de resistencia a la higromicina) y de los genes reporteros gus y gfp bajo el control del promotor CaMV35S, para optimizar el nivel de toxicidad del antibiótico empleado frecuentemente en protocolos de transformación genética. Obtuvieron una alta frecuencia de transformación con la expresión estable de los genes reporteros y de selección, señalando que la resistencia a higromicina puede ser utilizada eficientemente como marcador de selección en la transformación de arroz.

También se han utilizado de manera eficiente, aunque con menor frecuencia, los promotores de badnavirus, los cuales infectan tanto mono como dicotiledóneas (Moore et al., 1998; Tzafrir et al., 1998; Shenk et al., 1999).

En los últimos años se han descrito nuevos promotores constitutivos cuya eficiencia es comparable a la del CaMV35S, con la ventaja al nivel de bioseguridad de ser de origen vegetal:

Xiao et al. (2005), aislaron y caracterizaron el promotor MtHP de Medicago trunculata y evaluaron su actividad (a partir de la expresión del gen reportero gus) en varias especies de leguminosas, observando similares patrones de expresión genética respecto al promotor CaMV35S, pero con niveles considerablemente más altos. Esto convierte al promotor MtHP en una herramienta con gran potencial en la Ingeniería Genética Vegetal.

Park et al. (2010; 2012), analizaron la actividad de los promotores vegetales APX, SCP1, PGD1, R161B y EIF5 en base a la expresión del gen gfp en plantas transgénicas de arroz, en comparación a promotores constitutivos caracterizados previamente (OsCc1, Act1, ZmUbi1), mostrando patrones similares de expresión transgénica, pero con menor silenciamiento dependiente de homología en tres generaciones homocigóticas sucesivas, lo que resalta su potencial como promotores alternativos en aplicaciones biotecnológicas. Es necesario mencionar que los patrones de expresión variaron de acuerdo al órgano y al estadio de desarrollo.

Ron et al. (2014), utilizaron el promotor constitutivo de una subclase de actina de Arabidopsis thaliana ACT2/ACT8 para regular la expresión del gen reportero gus y evaluar, mediante distintos métodos moleculares, los patrones de expresión en tomate transformado por Agrobacterium rhizogenes. Obtuvieron niveles considerables de expresión genética que variaron dependiendo del tejido y que fueron comparables a los de otros promotores constitutivos de origen vegetal.

En cuanto a las desventajas de la expresión constitutiva, se ha señalado que pudiera implicar la sobreexpresión de un transgen específico en una etapa inadecuada del desarrollo o en tejidos donde no es expresado normalmente, acarreando consecuencias desfavorables en el crecimiento y desarrollo de la planta e, incluso, en el medio ambiente (Bowling et al., 1997; Berroca et al., 2002) (tabla 1).

2. Promotores inducibles

Pueden ser activados en respuesta a diferentes estímulos, incluyendo señales endógenas y factores físicos y químicos externos, bajo condiciones experimentales controladas (CAMBIA, 2003; Iáñez, 2005). La ventaja de este tipo de promotores radica en que permite un control espacial y temporal más preciso de la expresión transgénica y permite analizar la función de nuevos genes. Además, los sistemas inducibles facilitan promover cambios locales en los niveles de expresión sin causar alteraciones marcadas en el desarrollo de la planta completa (Borghi, 2010). Al igual que con promotores tejido o estadio-específicos, el principio de la estrategia reside en un transgen latente que es activado subsecuentemente de manera controlada (Moore et al., 2006) (tabla 2). Las señales endógenas corresponden a hormonas (especialmente auxinas, giberelinas y ácido abscísico). Los factores físicos corresponden a estrés biótico, como heridas y ataques por patógenos, usados en el estudio de sistemas de defensa de la planta inducidos por sustancias liberadas por o en respuesta al patógeno llamadas elicitores. Algunos de los promotores activados por estrés físico son NOS (del gen nopalina sintetasa) de Agrobacterium, el de peroxidasa de arroz y el inhibidor de la peroxidasa II de arroz (An et al., 1990; Xu et al., 1993; Sasaki et al., 2007). Otros factores físicos inductores de promotores corresponden a estrés abiótico incluyendo luz, niveles de oxígeno, frío, calor y humedad. Resaltan los promotores activados por temperatura como el promotor del gen hsp17.3 de soya, que induce la expresión del gen gus a temperaturas superiores a 25 °C, y el ftsH6 de tomate, asociado a factores de transcripción de choque térmico. También se ha descrito el promotor de la enzima RuBISCO, inducible por luz, y de alcohol deshidrogenasa 1, inducible por anaerobiosis (Iáñez, 2005; Saidi et al., 2005).

Los promotores inducibles por estímulo químico son activados por compuestos químicos que no se encuentran naturalmente en el organismo de interés, incluyendo antibióticos, alcoholes, esteroides, herbicidas y metales como el cobre, entre otros. Estos promotores han sido adaptados y refinados para inducir la actividad de un gen independientemente de otros factores bióticos o abióticos (CAMBIA, 2003). Su efecto es reversible (pierden actividad en ausencia del estímulo) y son muy útiles cuando se requiere expresión temporal (Gatz & Lenk, 1998).

Se han descrito varios sistemas bajo este tipo en Arabidopsis y Aspergillus nidulans, como: AlcR/AlcA inducible por etanol; fusiones GR, GVG y poP/LhGR inducibles por dexametasona; XVE/olex A inducible por β-estradiol y choque térmico (Baroux et al., 2005; Roslan et al., 2001; Samalova et al., 2005; Borghi, 2010). Destaca el caso del etileno, fitohormona involucrada en varios procesos de maduración del fruto y senescencia, que regula varios promotores fruto-específicos como el del gen ACC oxidasa y ACO sintetasa involucrados en su biosíntesis. Promotores de genes de respuesta al etileno, tales como E4 y E8, han sido utilizados para identificar elementos activadores y supresores implicados en la expresión genética espacial y temporal de las plantas (Hiwasa-Tanase et al., 2012).

A pesar de las ventajas que ofrecen, algunos investigadores han mencionado que este tipo de promotores generalmente implica el uso de sustancias tóxicas, sin embargo este inconveniente ha sido superado con los promotores inducibles por distintos tipos de estrés y factores físicos (Uno et al., 2000; Hoff et al., 2001).

3. Promotores tejido o estadio-específicos

Solo actúan en tejidos particulares o en ciertos estadios de desarrollo de la planta. Pueden ser inducidos por factores endógenos o exógenos, en cuyo caso también se les clasifica como inducibles. A pesar de que se han descrito sistemas heterólogos (entre especies o, incluso, reinos diferentes o no relacionados), con estos promotores la mayor especificidad es observada en sistemas homólogos (formados por elementos de la misma especie o de especies relacionadas); esto probablemente se deba a que la expresión coordinada de factores de transcripción es necesaria para la regulación de la actividad de los promotores (CAMBIA, 2003; NEPAD, 2010). El conocimiento de este tipo de promotores permite mejorar la expresión de cualidades o características vegetales de interés agronómico, farmacéutico y/o comercial, tener un mejor control temporal (en un momento específico del desarrollo de la planta) y conocer las rutas metabólicas de un órgano o tejido particular para la identificación de nuevos promotores y genes blanco (Potenza et al., 2004) (tabla 3). Los ensayos con este tipo de promotores no solo se han realizado en forma individual; Michniewicz et al. (2015), han desarrollado un sistema de vectores con promotores compatibles que regulan la expresión genética tejido-específica para facilitar el análisis espacial de la función de varios genes al mismo tiempo, superando así las limitaciones de la clonación de promotores individuales que puede llevar mucho tiempo y facilitando la evaluación y hallazgo de genes noveles involucrados en distintos procesos o etapas del desarrollo vegetal, que al mismo tiempo pudieran ser regulados o inducidos. Similarmente, Ron et al. (2014), utilizaron un set de promotores tejido-específicos de Arabidopsis thaliana incluyendo AtS32 (floema), AtS18 (xilema), AtPEP (corteza) y AtWER (raíz) para establecer un modelo de estudio de la expresión tejido-específica en tomate Solanum lycopersicum.

Entre los promotores órgano o tejido-específicos descritos se encuentran: hsp17 de cebada (activado por calor en pecíolo y xilema de tallo), TA29 del tapete de la antera de tabaco, Bp10 de Brassica específico para polen, faseolina de los cotiledones de poroto, TobRB7 de la raíz de tabaco, patatina del tubérculo de papa, glutenina del endospermo de trigo y de avena y fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPC) de maíz inducible por luz (solo en tejidos verdes) (Cheng et al., 1998; Lamacchia et al., 2001; Ghasimi et al., 2009; Peremarti et al., 2010). Para semilla también se conoce el promotor de α-globulina aislado de algodón, tabaco y Arabidopsis (Sunilkumar et al., 2002). Dentro de los promotores específicos para flores cuentan el UEP1 de Ubiquitina de crisantemo y el CER6 de Arabidopsis para mejorar la resistencia a insectos y retrasar la maduración de la flor (Annadana et al., 2002).

En cuanto a promotores que intervienen en el desarrollo vegetal, resaltan los involucrados en la maduración de la semilla, la floración o que mantienen al tejido en cultivo en el estadio de producción de un metabolito secundario de interés comercial. Por ejemplo, el promotor bZIP53 de Arabidopsis promueve la maduración de la semilla y ha sido usado en otras plantas como estrategia de transformación para fines agronómicos (Alonso et al., 2009). Kolachevskaya et al. (2015), utilizaron el gen tms1 de Agrobacterium involucrado en la biosíntesis de auxinas, bajo el control del promotor de la papa B33, que a pesar de ser constitutivo posee mayor actividad en tubérculos, por lo que facilita el desarrollo reproductivo vegetativo por tuberización; observaron el incremento de auxinas órgano y tejido-específico en plantas de papa, evitando el uso de promotores heterólogos.

4. Promotores sintéticos o quiméricos

Los distintos elementos o motivos que constituyen un promotor presentan una organización en número y ubicación (incluyendo la distancia entre ellos) que afecta la interacción con factores de transcripción (TFs) y determina la fuerza, así como las características espaciales y temporales de la expresión genética. En consecuencia, estos patrones de expresión pueden ser modificados a conveniencia mediante la reorganización del tipo, número de copias y distancia entre los motivos de un promotor, lo cual es la base de la construcción de promotores sintéticos. Allí radica la potencialidad de los promotores y TFs sintéticos como herramientas para la regulación precisa de la expresión transgénica (Liu et al., 2013). Su uso combinado permite el control transcripcional coordinado de múltiples transgenes, deseado en distintas aplicaciones biotecnológicas que incluyen la ingeniería metabólica y bioenergía (Petolino & Davies, 2013; Liu & Stewart, 2015).

En la construcción de promotores quiméricos destaca el uso de secuencias virales derivadas del promotor CaMV35S (Dutt et al., 2014). Son llamados de "siguiente generación" y básicamente consisten en la combinación de elementos de regiones promotoras de distinto origen, bien sea de organismos distintos (relacionados o no) o elementos cis reguladores de promotores diferentes de un mismo organismo, incluyendo repeticiones en "tándem", eliminando fenómenos de homología (Marzabal et al., 1998; CAMBIA, 2003; Vogl et al., 2014). En este sentido, Rushton et al. (2002), concluyeron que la combinación, número y distribución de diferentes elementos cis reguladores (cajas W, GCC o S) determinan la respuesta del promotor frente a estrés biótico (infección con hongos y bacterias) y abiótico (heridas). Con esta estrategia, se incrementó la actividad del promotor CamV35S mediante la fusión de secuencias cis reguladoras de otros promotores (CoYMV y CsVMV) (Peremarti et al., 2010). Otros promotores sintéticos, llamados bidireccionales, son usados en procedimientos de transformación multigénica ya que el promotor mínimo ha sido duplicado por ingeniería genética en ambas direcciones, por lo que controlan la expresión simultánea de dos genes. Esta estrategia se ha descrito para mejorar la transcripción de genes que dirigen la oleosina metionina sulfoxidoreductasa (enzima implicada en el envejecimiento o senescencia) en canola, y de los genes Cab 1 y Cab 2 para la síntesis de proteínas de unión a la clorofila a/b en Arabidopsis (Peremarti et al., 2010).

Conclusiones

El éxito de la aplicación de la ingeniería genética en el mejoramiento vegetal, el estudio de los mecanismos subyacentes en la regulación genética y el desarrollo vegetal depende en gran parte de la capacidad de controlar la expresión transgénica. A su vez, en las estrategias para lograr tal control resaltan los promotores. Actualmente se dispone de un amplio rango de estos elementos reguladores, con distintas características y potencial para aplicaciones específicas. Así, el promotor se selecciona sobre la base de la especie vegetal, del gen que se quiere insertar y el tejido o la etapa del desarrollo en los cuales se va a expresar el gen, lo que a su vez se determina realizando pruebas donde varíen cada uno de los parámetros involucrados. A medida que se avanza en el estudio de promotores genéticos, se afinan los procedimientos para su uso y se avanza en la eliminación del silenciamiento genético, en el perfeccionamiento de los patrones de expresión transgénica (tanto en especificidad como a nivel espacial y temporal) y, muy importante, en la bioseguridad de las plantas modificadas genéticamente.


Referencias bibliográficas

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