Introducción
La listeriosis es una enfermedad adquirida en el 99% de los casos por el consumo de alimentos contaminados por Listeria monocytogenes y se asocia principalmente al consumo de quesos blandos y productos lácteos (Vasquez et al., 2001). Una de las alternativas para enfrentar este tipo de microorganismos patógenos podría ser el uso de formulaciones con cepas mixtas, los cuales combinan el resultado de su actividad metabólica para ejercer actividad sinérgica (Bader et al., 2010). La prueba de enfrentamiento dual, es el resultado de la presencia de más de un microorganismo en una misma formulación, en dicha condición es posible obtener metabolitos de interés de microorganismos seleccionados y observar la capacidad biocontroladora tanto de la cepa patógena como de la antagonista. Las bacteriocinas, compuestos de naturaleza proteica, son producidas por muchas bacterias, entre ellas las bacterias ácido lácticas (BAL), como Lactobacillus brevis y Weissella cibaria (Gautam & Sharma, 2009; Srionnual et al., 2007). De estas bacterias se han producido y purificado metabolitos de carácter proteico. La actividad antimicrobiana de las BAL puede ser potencializada con la mezcla de varias cepas de BAL (Chapman et al., 2011), es por esto que se ha estudiado el efecto de cepas mixtas para la producción de metabolitos de interés. En investigaciones realizadas por Calderón et al., (2007), se comprobó el efecto antagónico de los probióticos sobre L. monocytogenes, E. coli y Salmonella spp, y se destacó su uso para la conservación de productos lácteos. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antimicrobiana de una formulación mixta de Lactobacillus brevis y Weisella cibaria frente a Listeria monocytogenes.
Materiales y métodos
Cultivo de microorganismos. Se utilizaron 2 bacterias lácticas, Weissella cibaria aislada del líquido ruminal bovino en trabajos anteriores (Serna et al., 2010) y Lactobacillus brevis, aislados de cultivos de pitahaya amarilla en estudios previos de Valencia, 2015. Como microorganismo patógeno, se utilizó una cepa de L. monocytogenes ATCC 13932. Se realizaron fermentaciones en discontinuo de Lactobacillus brevis y Weisella cibaria por triplicado. Estas fermentaciones se realizaron en Erlenmeyer de 500 mL (300 mL de volumen efectivo) y en sustrato MRS. Los tratamientos empleados fueron las fermentaciones con L. brevis se designaron como LB, con W. cibaria se designaron con WC, y la formulación mixta de L. brevis y W. cibaria, se designó como (LB+WC). Las fermentaciones LB y WC se hicieron de acuerdo a la metodología de Serna et al., 2010. LB y WC se reprodujeron por separado, mediante fermentaciones independientes, a 37°C durante 48 horas. En todas las fermentaciones se tomaron muestras de 5 ml de fermentado, en los tiempos 0 (momento de inoculación), 1, 2, 6, 12, 24 y 48 horas, y se realizaron pruebas de actividad antimicrobiana contra L. monocytogenes.
Para obtener (LB+WC) se siguió la metodología de Serna et al., (2010) y Kawarai et al., (2007), con modificaciones, se mezclaron fermentados provenientes de LB y WC, en proporción 1:1, y con la mezcla se realizaron las pruebas de actividad antimicrobiana.
Medición de la actividad antimicrobiana. Las pruebas de actividad antimicrobiana se realizaron en cada tiempo de muestreo y para cada tratamiento. Se utilizó una modificación de la técnica de difusión en superficie de agar usada por Ryan et al., (1996), así: se utilizaron placas de agar tripticasa de soya (TSA) de 5 mm de espesor, las cuales contenían nutrientes específicos para el crecimiento del patógeno L. monocytogenes. A estas placas se les realizaron orificios de 12 mm de diámetro, utilizando un sacabocado estéril. Se tomaron en forma aséptica, círculos de agar MRS estéril de 5 mm de espesor y de 12 mm de diámetro, los cuales se inocularon, por separado, con 60 µl de fermentado proveniente de las fermentaciones LB, WC y (LB+WC). Los círculos de agar inoculados se introdujeron en los orificios realizados en las cajas con agar TSA. Las cajas se incubaron a 36 °C por 24 horas, transcurrido este tiempo se midieron los halos de inhibición, los cuales se determinaron por la medición del diámetro de Feret, estableciendo como parámetro de medición el diámetro del orificio inoculado (12 mm), para analizar estos valores fue utilizando el software de evaluación de imágenes (Imagen j 1,40 g, Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, EE.UU).
Diseño experimental. Se utilizó un diseño de 2 factores: factor microorganismo con tres niveles (L. brevis, W. cibaria, y formulación mixta L. brevis + W. cibaria) y factor tiempo con 7 niveles (0, 1, 2, 6, 12, 24, 48 horas). La variable de respuesta fue el diámetro de inhibición del patógeno L. monocytogenes. Para el análisis estadístico se empleó el software R (Bell Laboratories, EEUU).
Resultados
En la figura 1 se presenta la cinética de la actividad antimicrobiana de LB, WC y (LB+WC) de fermentado obtenido durante 24 horas de fermentación. Los datos de la hora 48 fueron iguales a los obtenidos en 24 horas, por lo cual no se muestran en la figura 1. No hay diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (LB, WC y LB+WC) (p < 0.05), sin embargo, se presenta diferencias estadísticamente significativas en el tiempo (p >0.05).
De la figura se destaca que en la formulación mixta la actividad antimicrobiana permanece aproximadamente constante durante todo el tiempo de fermentación, mientras que en los tratamientos con LB y WC la actividad antimicrobiana contra L. monocytogenes decrece. En la formulación mixta se encontró que a partir de la hora 18 de fermentación la actividad antimicrobiana contra L. monocytogenes fue mayor que la obtenida en LB y en WC. Entre los tratamientos, la mayor actividad antimicrobiana se obtuvo a la hora 6 de fermentación, con el tratamiento WC presentando diámetro de inhibición de 2,55 ± 0,07 cm, valor que descendió hasta 1.56 ± 0.20 cm en la hora 48. Por otro lado, en la formulación mixta el diámetro mayor fue 2,16 ± 0,22 cm en la hora 2, con valores de 1,80 ± 0.16 cm en la hora 48.
Discusión
En estudios realizados por Gervasio (2012) se observó que desde la hora 2 hubo mayor presencia de bacteriocinas en el inicio de la fase logarítmica para dos cepas de W. cibaria, resultado similar al obtenido en el tratamiento de la formulación mixta (LB+WC), en donde a la hora 2 se presentó mayor diámetro confirmando la actividad inhibitoria contra L. monocytogenes, sin embargo, son varios los productos de la fermentación que podrían generar un efecto inhibitorio frente a L. monocytogenes, debido a que además de la producción de bacteriocinas de las BAL, L. brevis y W. cibaria son bacterias heterofermetativas, produciendo ácido láctico, etanol, diacetilo, formiato, ácido acético (Abdel-rahman, et al., 2013). La disminución de la actividad antimicrobiana de las BAL frente a L. monocytogenes a partir de la hora 6 de fermentación (figura 1), se puede explicar por el mecanismo de expresión llamado “quorum sensing”, el cual denota un proceso que implica moléculas específicas que actúan como señales para la inducción de la expresión génica de diversos procesos (positivos o negativos), sólo cuando se ha alcanzado determinada concentración de estas moléculas (Kuipers et al., 1998). Investigaciones realizadas por Lim & Im, (2012) en donde se reportan diámetros de inhibición de 1,4 cm de L. brevis MLK27 frente a L. monocytogenes KCTC3569 en agar BHI empleando 50µl como inóculo de BAL, concuerdan con lo encontrado en este estudio, ya que en la hora 12 del tratamiento LB se presentaron diámetros de 1,82 ± 0,17 cm. Asurmendi et al., (2015) observaron en veintiún cepas BAL un efecto inhibitorio en el crecimiento de ocho cepas de L. monocytogenes con halos de inhibición entre 1,75±4,4cm - 2,37±1,2cm para L. brevis los cuales se asemejan a los resultados obtenidos en este estudio.
Conclusión
La formulación mixta de L. brevis y W. cibaria podría ser una opción biotecnológica para el desarrollo de antimicrobianos naturales para el control y/o prevención de listeriosis, no obstante, se requiere de investigación adicional para entender el mecanismo por medio del cual las dos bacterias ácido lácticas potencializan en el tiempo, la estabilización de la actividad antimicrobiana. L. brevis y W. cibaria son bacterias con potencial biotecnológico, ya que tienen actividad contra L. monocytogenes.