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INTRODUCCIÓN
La poliploidía es un fenómeno natural que ocurre con más frecuencia en las plantas que en los animales y se le considera un mecanismo fundamental en la evolu ción de las especies nuevas. Alrededor del 40% de es pecies de plantas florales y entre el 70 y 80% de las hierbas son poliploides. Muchas plantas que actualmen te se cultivan y explotan para la alimentación mundial también son poliploides (Pierce, 2009). La poliploidía ha contribuido a la aparición de novedades evolutivas tanto morfológicas, genéticas y fisiológicas, lo que ha permitido aumentar la capacidad competitiva, el éxito reproductivo y/o la tolerancia ecológica de los poliploi des respecto a sus progenitores.
La poliploidía inducida es un procedimiento que le brin da al fitomejorador la oportunidad de modificar una planta alterando el número de cromosomas y en conse cuencia, la proporción de genes alélicos que contribu yen al aparecimiento de caracteres particulares. Sin embargo, los efectos de este tratamiento son diversos e impredecibles, algunos favorables y otros desfavorables, lo que requiere un trabajo arduo y minucioso para estu diar la consecuencia de la duplicación cromosómica en cada especie (Cubero, 2003).
A partir de la década de los 1940, los fitomejoradores emplearon la inducción artificial de poliploides experi mentales como método de mejoramiento genético. Desde esta fecha y hasta los actuales momentos se han obtenidos poliploides de diferentes especies que inclu yen gramíneas, monocotiledóneas y dicotiledóneas, en las cuales se ha logrado el aumento en su rendimiento, calidad nutritiva y tamaño de los órganos, retención de mayor cantidad de agua, retraso en la floración, entre otros (De Jesús y Weathers, 2003).
Con los avances científicos en las áreas de citogenética, biología celular y molecular, los investigadores han ajus tado esta técnica a protocolos de laboratorios novedo sos para el mejoramiento genético de plantas en condi ciones in vitro. Ejemplo de ello son los trabajos realiza dos por Li et al. (2010), en Saintpaulia ionantha, quienes lograron mejorar las características ornamentales de la especie al obtener un tetraploide con 56 cromosomas. Otros ejemplos son Gerbera jamesonii Bolus cv. Sciella (Gantait et al., 2011), Dioscorea zingiberensis (Huang et al., 2010), Eucalyptus globulus (Lin et al., 2010) y espe cies del género Rhododendron (Hebert et al., 2010).
Las plantas medicinales han tenido especial atención en los estudios de inducción de poliploidía. Gao et al. (2002), lograron obtener tetraploides de Scutellaria spp. aumentando las cantidades de baicalina que su metabolito secundario. La inducción de poliploidía en Bacopa monnieri o Centella asiática, dio un doble beneficio; por un lado, mejoró su utilidad como planta medicinal y por otro aumentó su uso como planta ornamental (Escandón et al., 2006). En Valeriana wallichii D.C, la obtención de tetraploides permitió incrementar seis veces la producción de valepotriatos y además generó la producción de nuevos compuestos no presentes en los parentales (Becker y Chavadej, 1985). Tetraploides de Artemisia annua (2n=36) fueron obtenidas con esta misma técnica de poliploidización por De Jesús y Weathers (2003) quienes lograron mejorar la produc ción de artemisina en cantidades de 3 a 6 veces mayor en comparación con las plantas diploides.
A pesar de las aplicaciones que ha tenido la técnica de inducción de la poliploidía en la mejora de plantas de interés agrícola y medicinal, pocas especies del género Aloe han sido sometidas a la acción de estos químicos para mejorarlas genéticamente. En los últimos años, el interés por las plantas de este género ha ido en aumen to debido al uso, mecanismo de acción y aplicaciones terapéuticas de sus compuestos activos, especialmente sus metabolitos secundarios, en el mantenimiento de la salud y su utilidad en la industria farmacéutica, cosméti ca y alimentaria (Haque y Ghosh, 201 3; Rahmani et al., 2015; Mahor y Ali, 2016).
Los primeros trabajos de inducción de poliploidía en A. vera L. (Aloe barbadensis M. = sábila) fueron realizados en Venezuela por Imery y Cequea en el año 2001, quienes aplicaron diversos tratamientos de colchicina en sábila con el objeto de inducir tetraploidía en condi ciones ex vitro a partir de plantas diploides, consideran do las variables de concentración y tiempo de exposi ción. Los tratamientos causaron diferentes efectos en el tiempo de aparición de los brotes y en el número de hijuelos por rizoma. La duplicación cromosómica se logró con la inmersión de los rizomas en solución de colchicina al 0,15% por 24 horas. Sólo el 5,9% el total de los rizomas tratados, originaron yemas totalmente tetraploides (2n = 4x = 28).
Wang et al. (2001), también indujeron tetraploidía en plántulas de A. vera y reportaron que la tasa más alta de inducción fue de un 50% a una concentración de col chicina de 0,06% con 12 horas de exposición. Al com parar las plantas poliploides con las diploides se encon traron que las hojas de las primeras fueron más gruesas, grandes, de color más oscuro, estomas de mayor tama ño pero en menor número.
Ren et al. (2007), indujeron tetraploides de Aloe vera L. en condiciones in vitro probando dos tratamientos: a) sumergiendo los segmentos nodales en solución de colchicina y b) añadiendo colchicina a los medios de cultivos. Los mejores efectos se obtuvieron cuando se añadió la solución de colchicina al medio de cultivo que contenía los explantes, durante 3 a 4 días, a una concentración de 2000 mg/L. La tasa de inducción de tetraploidía fue del 41,5%. El estudio de las caracterís ticas morfológicas reveló que las plantas mostraron ho jas con mayor grosor en comparación con las plantas diploides y con mayor cantidad de cloroplastos en las células guarda de los estomas.
En el año 2008, Molero y Matos determinaron que además de la concentración de la colchicina y el tiem po de exposición al químico, la temperatura también influye en la inducción de la poliploidía en A. vera. Se aplicaron tratamientos a distintas concentraciones de colchicina, diferentes tiempos de exposición y a tempe raturas diferentes en condiciones ex vitro y se observó que el 25% de las plántulas tratadas con 0,15% de colchicina por 24 horas a 35°C mantuvieron su condición de tetraploidía. La duplicación cromosómica causó un incremento en la altura de las plantas y en la longitud, ancho, espesor y volumen foliar con respecto a las plan tas diploides y quimeras.
Considerando los beneficios de la inducción artificial de la poliploidía en plantas de interés agrícola y la intensa actividad económica que ha generado el cultivo de A. vera durante los últimos quince años por su demanda en la industria cosmetológica, farmacéutica y alimenta ria, el objetivo de trabajo de investigación fue estandari zar la técnica de inducción de poliploidía en vitroplan-tas de Aloe vera (L.).
METODOLOGÍA
Obtención del material biológico
Las vitroplantas empleadas para realizar esta investiga ción fueron obtenidas del Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Agronomía de la Universidad del Zulia, Venezuela. Dichas vitroplantas fueron previamente establecidas y multiplicadas en condiciones de labora torio a partir de plantas procedentes de la población de los Mayales, municipio Guajira del estado Zulia, Vene zuela. Se seleccionaron aleatoriamente 80 vitroplantas que presentaban buen vigor y completamente sanas para la aplicación de los tratamientos de inducción de poliploidía, distribuidas en 8 grupos de 10 vitroplantas para cada tratamiento.
Estudio citogenético pre-tratamiento
El estudio citogenético pre-tratamiento de las vitroplantas se realizó según lo descrito por Molero y Matos (2008). La preparación de las láminas microscópicas se llevó a cabo con la técnica del aplastado tisular o "squash" del meristemo radical, analizadas en un foto-microscopio Marca Olympus CX31 con cámara digital Olympus DP12. Se analizaron dos raíces por cada vitro-planta y de cada raíz se determinó el número cromosómico de 10 células.
Aplicación de los tratamientos con colchicina
Para realizar la aplicación de los tratamientos con col-chicina, se indujo la producción de raíces en las vitro-plantas, transfiriéndolas a medios de cultivo Murashige y Skoog (MS) (1962) de consistencia líquida sin hormo nas. Una vez que se observó la emergencia de raíces, al menos 3 por planta, se procedió a la aplicación de los tratamientos.
Las vitroplantas fueron transferidas a soluciones de colchicina con diferentes concentraciones y a diferentes tiempos de exposición, sumergiendo tanto las raíces como el bulbo de la plántula (tabla 1).
Tabla 1 Vitroplantas de Aloe vera tratadas con diferentes concentraciones de colchicina y tiempo de exposición.
Se empleó vitroplantas controles como testigos absolu tos, las cuales fueron colocadas en agua destilada, sin colchicina, por 48 y 72 horas.
Estudios citogenéticos post-tratamiento
Luego de aplicados los tratamientos se realizó el estu dio citogenético en el tejido radical con el objeto de cuantificar en número de cromosoma en cada célula y la cantidad de células diploides y poliploides. Se evalua ron dos raíces por cada vitroplanta y de cada raíz se analizaron 30 células para un total de 600 células por tratamiento.
Estas plantas fueron transferidas a medios de cultivo MS de textura semi-sólida para su multiplicación, suplemen tado con 1 mg/L de tiamina-HCl, 100 mg/L de mioinositol, 25 mg/L de cisteina, 100 mg/L de ácido ascór bico, 30 g/L de sacarosa, 1 mg/L de 6- benzylaminopurina (BAP) y gelificado con 5 g/L de agar ajustando el pH a 5,8. Posteriormente fueron colocados en una cá mara de incubación a temperatura de 27°C±2°C bajo luz blanca fluorescente continua de 150 mmol.
Transcurridos 45 días después de aplicados los trata mientos, se realizó nuevamente el estudio citogenético en los brotes derivados de las plantas tratadas. Este procedimiento se hizo durante tres ciclos de propaga ción. En cada ciclo se seleccionaron las plántulas que presentaron más de un 50% de sus células en condi ción poliploide, las cuales fueron sembradas en nuevos medios de cultivo.
Análisis estadísticos
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 20 bajo sistema operati vo Windows. Los resultados se evaluaron aplicando las técnicas de la estadística inferencial mediante análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de medias de Tukey.
Resultados y Discusión
El estudio citogenético pre-tratamiento realizado en las vitroplantas de sábila indicó que todas las células fue ron diploides (2n = 14), sin encontrar ninguna anormali dad genética. Este hecho se corresponde con lo afirma do por Brandham y Johnson (1982) y Nejatzadeh-Barandozi y Akbari (2013) quienes indicaron que las plantas de este género se caracterizan por poseer una gran estabilidad cromosómica en condiciones in vivo e in vitro. En este sentido, Haque y Ghosh (2013) realiza ron estudios mitóticos, meióticos, cromosómicos y mo leculares en plantas de A. vera con dos años de antigüe dad en campo obtenidas por micropropagación, con el objeto de verificar la fidelidad clonal y observaron que el desarrollo morfológico fue normal, así como los feno tipos cromosómicos (n = 7; 2n = 14) y el comporta miento meiótico de sus células germinales. Los análisis de ADN por AFLP revelaron que no había variaciones somaclonales entre los regenerantes. Similares resulta dos fueron obtenidos por Singh et al. (201 7), al investi gar sobre un método de proliferación rápida in vitro y caracterización morfológica de Aloe vera L.
De forma distinta, los tratamientos con colchicina pro dujeron variaciones en la estructura cromosómica de las células de acuerdo a la concentración y tiempo de exposición, de tal manera que algunos tratamientos fueron más eficientes que otros en lograr la duplicación cromosómica. En la figura 1 se muestra las microfotografías de células de vitroplantas de A. vera en condi ción diploides (2n=14) y tetraploide (4n=28).
Figura 1 Microfotograffa de células diploides (2n) de Aloe vera (A) y tetraploides (4n) (B) de Aloe vera.
El análisis de la varianza (ANOVA) a través de la prueba de Tukey arrojó que hay diferencias significativas entre los tratamientos (p<0,05) y se puede apreciar en la pre sencia de seis grupos definidos en función de la signifi cancia de las medias entre los tratamientos en cuanto al número de células tetraploides por raíz de acuerdo a la concentración de la colchicina y el tiempo de exposi ción al agente antimitótico (tabla 2, figura 2).
Tabla 2 Promedio de células poliploides en vitroplantas de Aloe vera (L.) con diferentes tratamientos de colchicina. Va lores con distintas letras indican diferencias significativas se gún prueba de Tukey (p<0,05).
Figura 2 Número de células poliploides en las vitroplantas de Aloe vera (L.) de acuerdo a la concentración y tiempo de exposición a la colchicina.
Los resultados muestran que a medida que aumentó la concentración de colchicina y los tiempos de exposi ción también aumentó el número de células poliploides. Este resultado puede explicarse debido a que la acción del agente mutagénico sobre las capas de célu las meristemáticas de ápice radicular y sobre las células epidérmicas del bulbo fue más eficiente al aumentar su concentración inhibiendo la formación del huso mitótico e impidiendo la migración de los cromosomas indivi duales, lo que trajo como consecuencia la duplicación cromosómica, quedando las células en condición de poliploidía. Una vez que cesó la acción del antimitótico y establecida esta nueva configuración genética en las células de las plantas, las células hijas derivadas de és tas por mitosis, tendrán la nueva estructura cromosómica. La acción del veneno antimitótico se vio favorecida con la duración del tratamiento, ya que las plantas que estuvieron expuestas por 72 horas, el porcentaje de células poliploides fue mayor, debido probablemente, a que el químico tuvo mayor tiempo para actuar y pene trar en las capas más profundas del tejido.
Los resultados de esta investigación demostraron que las vitroplantas controles (T1 y T2) y las plantas tratadas con solución de colchicina al 0,05% por 48 horas (T3), presentaron pocos cambios citogenéticos en compara ción con la totalidad de células estudiadas en el tejido, siendo la mayoría de sus células diploides (2n=14). Las plantas tratadas con una concentración de 0,05% por 72 horas presentaron mayor cantidad de células poliploides en comparación con los tratamientos anterio res, pero los porcentajes seguían siendo bajos, menores del 12%. Los tratamientos T1, T2, T3 y T4, fueron des cartados ya que las plantas tratadas presentaron un porcentaje muy bajo de células poliploides. La aparien cia de las plantas diploides obtenidas con los tratamien tos T1, T2, T3 y T4 en cultivo in vitro se indican en la figura 3.
Cuando se empleó la solución de colchicina a una con centración de 0,10% por 48 y 72 horas, se logró la duplicación cromosómica en más del 50% del tejido de la planta (T5 = 69,4% y T6 = 78,7%) y exhibieron tanto células diploides (2n=14) como poliploides, es decir fue tejido quimérico. Sin embargo, la cantidad de células poliploides con el T6 fue mayor que con el T5. Las plan tas con tejido quimérico en condiciones in vitro, presen taron hojas más anchas y engrosadas y un color más intenso con respecto a las plantas controles (figura 4).
En el tratamiento de colchicina al 0,1 5% por 48 horas (T7) se observó que las células del tejido radical fueron quimeras con un alto predominio de células poliploides (91,7%) sobre células diploides y al aumentar el tiempo de exposición a 72 horas (T8), el estudio microscópico reveló que todas las células fueron poliploides. Al eva luar el desarrollo de estas plantas en cultivo in vitro, se notó que la emisión de brotes fue anormal y presenta ron tallos y hojas muy engrosadas y en forma de rose tas apiñadas, además de presentar tejido necrótico (figura 5). Evidentemente todo el tejido que provino de estos tratamientos presentó problemas para desarrollar se, lo que conllevó a pensar que la duplicación cromosómica afectó el desarrollo normal de la planta o que la dosis de colchicina al 0,15% por 3 días resultó nociva o tóxica para la planta. Por estas razones, el crecimiento in vitro de éstas plantas resultó difícil y aún más la multi plicación y separación de los brotes ya que la mayoría de las yemas no sobrevivieron, por lo tanto estos trata mientos fueron descartados. Similares resultados fueron obtenidos por Borini et al. (2010) trabajando con espe cies del género Cattleya (Orchidaceae), los cuales en contraron que la colchicina en altas concentraciones o tratamientos muy largos, se convirtieron en tóxicos para los tejidos vegetales.
Figura 5 Apariencia de las vitroplantas de Aloe vera tratadas con colchicina a una concentración de 0,15%.
La relación inversa entre la concentración de colchicina y la supervivencia del explante ha sido reportada por otros autores (Huang et al., 2010) y está de acuerdo con los estudios ex vitro para A. vera (Molero y Matos, 2008).
La variación en el efecto de la colchicina a diferentes concentraciones en el desarrollo de plantas cultivadas in vitro ha sido investigada previamente. Henny et al. (2009), trataron híbridos del género Dieffenbachia con diferentes concentraciones de colchicina y encontraron que la sobrevivencia de las yemas tratadas in vitro de creció a medida que aumentaba la concentración del químico. De igual manera, Zhang et al. (2007) encon traron que durante el proceso de inducción de tetra-ploides en Phlox subulata L., la supervivencia de las ye mas tratadas con colchicina fue afectada por la concen tración y el tiempo del tratamiento, de tal manera que a mayor concentración y tiempo de exposición, la super vivencia de las yemas fue menor. Cavalcanti (2011) trabajando con la inducción de poliploidia en Heliconia bihai, observó alteraciones en la forma de las hojas, intolerancia de los explantes o un retraso en su creci miento cuando se emplearon dosis mayores a 0,1% de colchicina. Este autor indica que la mortalidad y el desa rrollo lento de materiales vegetales sometidos a la poli-ploidización están relacionados con la toxicidad de la colchicina, que bloquea la formación de las fibras del huso acromático, alterando el ciclo mitótico y pudiendo interrumpirlo por completo, produciendo perturbacio nes fisiológicas en la célula, lo que resulta en una tasa reducida de la división celular.
Estos datos son muy similares con los resultados encon trados en el presente trabajo ya que la más alta concen tración de colchicina de 0,1 5% produjo alteraciones en las plantas que las hicieron inviables y disminuyó la efi ciencia de convertir plantas diploides en poliploides.
Algunos procedimientos de laboratorio para la induc ción de poliploidía in vitro comprenden la incorpora ción de la colchicina en el medio de cultivo sólido (Zhang et al., 2007; Ren et al., 2007) o en el medio de cultivo líquido (Henny et al., 2009; Konzen et al., 2000; Escandón et al., 2006). En este trabajo de investigación se registraron buenos resultados cuando las yemas fue ron colocadas directamente en las soluciones de colchicina en sus diversas concentraciones y luego transferi das a medios semisólidos de multiplicación. Similares protocolos fueron empleados por Stanys et al. (2004) en plantas del género Ribes y por Omidbaigi et al. (2010a; 2010b), en Ocimum basilicum L. y en Draco-cephalum moldavica L.
El resultado del estudio citogenético realizado a los clones obtenidos en la primera, segunda y tercera gene ración a partir de las vitroplantas seleccionadas después de aplicar los tratamientos 5 y 6 de cada una de las poblaciones en estudio se indica en la tabla 3. En cada generación brotaron vitroplantas con tejido quimérico, algunos con predominio de células diploides y otras con células poliploides. Estas últimas fueron selecciona das para ser empleadas como explantes para el siguien te ciclo de replicación. Como puede observarse, en todos los ciclos de replicación el número de plantas poliploides fue mayor con el T6 que con el T5 probable mente porque el tiempo a la exposición a la colchicina fue mayor; sin embargo el desarrollo de las plantas fue mejor con el T5 que con el T6.
Tabla 3 Número de plantas quimeras y tetraploides con los T5 y T6 en cada ciclo de replicación. Valores con distintas letras indi can diferencias altamente significativas según prueba de Tukey (p<0,01).
Investigaciones anteriores sobre la inducción de poli-ploidía en vitroplantas de A. vera, como la de Wang et al. (2001), y Ren et al. (2007), se obtuvo una tasa del 50% y 41,5% respectivamente. Comparando estos re sultados con los obtenidos en este trabajo de investiga ción, se observa que los porcentajes de poliploidización con los tratamientos 5 y 6 fueron más altos. Es impor tante acotar que la concentración de colchicina em pleada por Ren et al. (2007), de 2g/L (0,2%), es mayor al utilizado en este trabajo, por lo que se piensa que probablemente sea la razón de un porcentaje de éxito menor, ya que, como se describió anteriormente, la concentración de 0,15% produjo plantas inviables. Con los resultados obtenidos se puede evidenciar que la colchicina a una concentración de 0,10% por 48 y 72 horas (T5 y T6) fueron los tratamientos que lograron la mejor duplicación cromosómica en el tejido de la plan ta, ya que el porcentaje de células poliploides fue supe rior al 50%.
Al igual como ocurre en los vegetales que han sufrido cambios cromosómicos en condiciones naturales, la planta poliploide inducida se adaptará a esa nueva es tructura genética ya que la actividad antimitótica de la colchicina, de inhibir la interacción con los enlaces di sulfuro de la proteína del huso y la conversión de las proteínas globulares en las proteínas fibrosas, cesa al final del tratamiento, de tal manera que el huso se con figura de modo normal y las células pueden continuar con sus divisiones mitóticas, como lo revela las plantas regeneradas en el segundo y tercer ciclo de replicación de los T5 y T6.
Al comparar los resultados de esta investigación con los obtenidos previamente por Wang et al. (2001), se de tecta que ambas investigaciones la concentración del agente antimitótico es bajo, lo que favorece la duplica ción cromosómica en las células al mismo tiempo que la planta puede desarrollar sus nuevos caracteres fenotípicos.
Esta misma concentración del agente antimitótico fue empleada por Matos (2014), en la cual evaluando el potencial de la colchicina en la obtención de plantas poliploides in vivo, obtuvieron células en condición aneuploide, en vez de células euploides cuando em plearon concentraciones de 0,05 y 0,10% por 48 horas.
Esta discrepancia de resultados probablemente sea de bido a diferencias en el tiempo de exposición a la col-chicina o a otro factor propio de las condiciones de desarrollo de las plantas.
Al contrastar la tasa la inducción de la poliploidía logra da por Imery y Cequea (2001) y Molero y Matos (2008) en condiciones ex vitro de un 5,9% y 25% res pectivamente con relación a los obtenidos en esta in vestigación y por otras investigaciones (Wang et al., 2001; Ren et al., 2007) en condiciones in vitro, se dedu ce que la técnica de inducción de poliploidía en A. vera (L.) es más efectiva en condiciones in vitro que en con diciones ex vitro.
Por la multitud de propiedades que se le han atribuido al Aloe vera derivada de la cantidad de compuestos bioactivos que posee (Mahor y Ali, 2016; Pandey y Singh, 2016), esta especie disfruta actualmente de una gran demanda en el mercado mundial que la ubica en una de las mejores oportunidades comerciales entre las opciones del campo de las plantas medicinales. Este hecho la hace acreedora de ser investigada exhaustiva mente en su estructura genética y métodos de mejora miento, caracterización fisicoquímica, mecanismo de acción de sus fitoprincipios, resultados en ensayos clíni cos, entre otros, con miras a obtener material vegetal de alta calidad y explotar ampliamente sus usos tera péuticos en la industria farmacéutica, cosmética y agroalimentaria.
CONCLUSIÓN
En este trabajo de investigación se logró estandarizar la técnica de inducción de poliploidía más apropiada para vitroplantas de Aloe vera (L.) analizando el efecto de la concentración y el tiempo de exposición al agente anti-mitótico. El tratamiento con mejores resultados fue el empleo de la solución de colchicina al 0,10% por 48 horas en la cual el 52% del tejido fue poliploide y las plantas presentaron un desarrollo óptimo. Se recomien da el uso de esta nueva técnica en Aloe vera (L.) para emprender programas de mejoramiento genético que permita obtener cambios genotípicos y fenotípicos en corto tiempo y que favorezcan el desarrollo de caracte rísticas atractivas para el campo agrícola y el mercado farmacéutico y medicinal.
