Aislamiento y purificación

A partir de granos de suelo de la zona (Guarne, Antioquia), técnica usada por ^{Jiménez et al., (2011)} y raíces (^{Osorio y Habte, 2013}) de frijol cargamanto blanco, maíz criollo regional amarillo (Zea mays), lechuga y tomate sembrados en recipientes de 24 onzas; se aislaron microorganismos en medios de cultivo libres de nitrógeno como el Ashby y el medio para Fijadores Biológicos de Nitrógeno (FBN Sobiotech). Las cajas de Petri se incubaron a 34°C durante 24 - 48 horas. Pasado este tiempo se observaron y describieron morfologías de las colonias, y aquellas que fueron representativas se re-aislaron mediante siembra por agotamiento en los mismos medios para buscar un mejor desarrollo de estas.

Caracterización de aislados

Después de 4 días de incubación se volvió a observar crecimiento de colonias y aquellas que eran demasiado pequeñas o cuya línea de siembra no permitía diferenciarlas se descartaron y las que presentaron morfologías similares en forma, borde, elevación, superficie, consistencia, aspecto, color y tamaño a los microorganismos del género Azotobacter y Azospirillum se preservaron a 4°C. Se realizó siembra por agotamiento de aquellos aislados que fueran compatibles con fijadores libres de nitrógeno a los que además se les hizo la tinción de Gram estándar, la prueba de la catalasa, oxidasa, hidrólisis de almidón, SIM (Sulfuro Indol Motilidad) y oxidación/fermentación (O/F). Adicional a esto se aplicaron las galerías de identificación automática Api 20 NE (bioMérieux SA®) a colonias de los aislados sembrados en Agar Tripticasa Soya (TSA) siguiendo la metodología de inoculación e interpretación según el manual de dichas pruebas (^{Moreno, 2010}).

Conservación

Los aislados purificados se transfirieron a tubos eppendorf con un contenido de medio líquido (Ashby y FBN) con Glicerol (85%) a un 30% de la solución total. Se llevaron a un refrigerador (<0°C) (^{Flores-Gallegos et al., 2012}).

Muestreo y caracterización del suelo degradado

El lugar del muestreo se realizó en un terreno del predio La Ortega en la Universidad de Medellín, con coordenadas 6°13'51,96"N, 75°36'41,1"W; altitud de 1574 m.s.n.m. En forma de zigzag se tomaron 8 submuestras hasta tener un total de 40 kg de suelo homogéneo. En campo se determinó densidad aparente del suelo por el método del cilindro y se midió la pendiente. En laboratorio se halló el porcentaje de humedad y máxima capacidad de retención de humedad (MCRH). Además, se realizaron diluciones seriadas (10^-5 y 10^-7) de 10 gramos de suelo en agua peptonada bufferada para observar posibles microorganismos en desarrollo en agar Ashby. Se preparó 1 kg de suelo tamizado para analizar propiedades fisicoquímicas en el laboratorio de la Universidad de Nacional de Colombia. Las características del suelo se muestran en la tabla 1.

Tabla 1 Mediciones preliminares del terreno y suelo muestreado 

Los datos de la Tabla 1 indican condiciones iniciales del suelo que fueron necesarias para determinar la cantidad de agua que se adicionó para controlar la MCRH, dosis de inóculo y determinar que no se presentarán microorganismos diferentes al estudiado. La pendiente del 50%, se clasifica como escarpada, la cual se encuentra entre los valores de 30% y 60% definidos por la ^{FAO (2009)}; la densidad aparente es alta al encontrarse por encima de 1,3 g/cm³, lo que indica un ambiente pobre para el crecimiento de raíces, aireación reducida y cambios indeseables en la función hidrológica como la reducción de la infiltración del agua (^{FAO, 2009}). El conteo en placa reveló una baja población de UFC lo que indicaría una débil afectación de los tratamientos a utilizar.

Con base en los resultados del análisis del suelo (Tabla 2) especialmente los valores de pH, M. O, Al, K, P, S y CICE, se clasifica a este suelo como degradado. La CICE es baja lo que se traduce en un suelo pobre que necesita aporte de materia orgánica (^{Garrido, 1994}). La clase textural corresponde a franco arcillosa, en donde no hay proporción dominante de algún separado sobre las propiedades del suelo pero en donde la arcilla puede ejercer una mayor retención de humedad e impartir cualidades plásticas al suelo (^{Jaramillo, 2002}). El valor de pH se clasifica como fuertemente ácido (^{USDA, 1993}). Se debe entonces hacer un proceso de restauración, propiciando el desarrollo vegetal mediante la acción de microorganismos benéficos como los FBNL.

(Laboratorio de suelos Universidad Nacional de Colombia)

Bioaumento

Para la multiplicación del aislado (AshAssm4) se utilizó caldo Ashby (200 ml) incluidos los 20 ml (10% de la solución total) de solución peptonada bufferada al 0,1% con una concentración igual al patrón de McFarland 0,5 que es aproximadamente igual a tener 1,5*10⁸ bacterias/ml. El medio se llevó a agitación durante 48 horas a 120 rpm y a 30°C modificado de (^{Brusamarello-Santos et al., 2017}; ^{Borda-Molina, Pardo-García, Martínez-Salgado, y Montaña-Lara 2009}).

Bioensayo

Con el suelo previamente tamizado se prepararon los recipientes de 24 oz, con 600 g de suelo cada uno. Se continuó con la desinfección de las semillas de Zea mays (maíz) y Brachiaria decumbens; sumergiéndolas por 30 segundos en solución de etanol al 70% v/v y luego por 2 minutos en hipoclorito de sodio al 2%. Se finalizó con 3 lavadas usando agua destilada estéril.

Fueron sembradas 15 semillas de Brachiaria decumbens y 3 de Zea mays (maíz) por recipiente. Se aplicaron 4 tratamientos con 5 repeticiones cada uno, los cuales fueron: control positivo (adición de fuente de Nitrógeno en forma de Urea, 0,8g/100ml) 5 ml por recipiente, control negativo (adición de caldo Ashby sin inóculo) 1 ml por recipiente, microorganismo FBNL 1 ml por recipiente y un tratamiento con FBNL + Urea, 1ml y 5 ml respectivamente. Todos estos recipientes fueron llevados al invernadero y se controló la MCRH (5060%) mediante la adición de agua destilada estéril.

Cuantificación de biomasa vegetal

Para determinar el efecto sobre la biomasa vegetal las variables controladas fueron la altura y el peso. Se midió la altura de brotes tanto del maíz como de la Brachiaria decumbens a los 20 y 36 días del ensayo en invernadero. También se obtuvo medición de longitud de raíces en el último día, cuando se desmontaron las unidades experimentales. Se pesó en balanza analítica el peso fresco de brotes y raíces de ambas especies vegetales estudiadas. Para el peso seco se llevó a estufa por 48 horas a 70°C.

Análisis de datos

Se realizó un análisis de varianza con un nivel de significancia de α 0,05 empleando el software SAS System 8e. Se verificó normalidad de los datos por medio de la distribución al azar de los tratamientos e igualmente se evaluó el supuesto de homogeneidad de varianzas y correlación de los datos.

Aislado y caracterización de posibles FBNL

En la tabla 3 se listan los aislados que por su crecimiento colonial fueron representativos y compatibles con los géneros Azotobacter y Azospirillum. Es válido mencionar que no todas las colonias en raíces y granos de suelo crecieron o fueron compatibles, tales como las de tomate en el medio FBN y las raíces de lechuga en medio Ashby.

Se encontró un total de 23 aislados compatibles con FBNL para continuar con su caracterización. La figura 1A muestra el crecimiento de colonias del aislado FBNAsrm2 en medio libre de nitrógeno mediante siembra por agotamiento. La figura 1B es el aislado AshAssm4 en agar Ashby luego de 4 días a 34°C en crecimiento. Ambos aislados son compatibles con fijadores libres de nitrógeno.

Figura 1 Colonias de dos aislados sembrados en los medios FBN (1A) y Ashby (1B) 

En la tabla 4 se encuentran los resultados para aquellos aislados que crecieron en agar TSA, y a los cuales se les realizó pruebas complementarias (Gram, catalasa, oxidasa, SIM, hidrólisis de almidón y O/F) a las de la galería API 20NE (bioMérieux SA®). El aislado AshAssm4 fue compatible con la especie Azotobacter vinelandii presente en el biofertilizante (TerraVite-S21®) y por ser el único con ureasa positiva, resultado compatible para los géneros bacterianos utilizados como referentes con el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática (^{Garrity, 1984}).

Tabla 4 Caracterización bioquímica de aislados compatibles con FBNL 

En la figura 2 se aprecia la caracterización microscópica del aislado AshAssm4 proveniente de granos de suelo de maíz; el cual presenta forma de bacilo corto, gram negativo, agrupándose en pares y con la formación de quistes. Todas estas características propias del género Azotobacter (^{Garrity, 1984}).

Figura 2 Observación al microscopio de tincón de Gram ( 100X) 

Concentración final del bioaumento

Se realizó a partir de diluciones seriadas, inoculando la dilución de 10^-5 y 10^-7 por triplicado en agar Ashby; se llevó a incubación 34°C durante 5 días. El conteo final fue de 2,4*10⁸ UFC/ml para la dilución 10^-5 y 8*10⁸ UFC/ml para la dilución 10^-7.

Determinación de variables respuesta

Las figuras 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados estadísticamente significativos para las variables estudiadas que obtuvieron un valor p<0,05 y también los tratamientos que reflejan valores promedio de interés así no hayan tenido diferencias significativas entre sí. La prueba de Tukey (p<0,05) fue utilizada para saber cuáles fueron las medias con diferencias significativas entre tratamientos.

Figura 3 Efecto de la aplicación de FBNL sobre la altura en cm de brotes de Brachiaria decumbens a los 20 días (Fig 3A) y a los 36 días (Fig 3B). Medias con diferente letra son significativamente diferentes. 

Figura 4 Efecto de la aplicación de FBNL sobre la longitud en cm de raíces de maíz (Zea mays) (Fig 4A) y Brachiaria. decumbens (Fig 4B). Medias con diferente letra son significativamente diferentes. 

Figura 5 Efecto de la aplicación de FBNL sobre el peso fresco en gramos de los brotes de Brachiaria decumbens. Medias con diferente letra son significativamente diferentes. 

Figura 6 Efecto de la aplicación de FBNL sobre el peso seco en gramos de brotes (Fig 6A) y raíces (Fig 6B) de Brachiaria decumbens. Medias con diferente letra son significativamente diferentes. 

La figura 3 muestra los diferentes valores de altura que manifestaron las plantas de Brachiaria decumbens. Se hizo un seguimiento en dos momentos del ensayo, los cuales reflejan un aumento progresivo de la altura con el tiempo y consiguiéndose un valor numérico mayor para el tratamiento en el que se añadió el inóculo (microorganismo AshAssm4) y la dosis de urea.

Lo anterior indica una relación benéfica entre el FBNL y el nitrógeno inorgánico agregado, considerándose así la posibilidad de sustituir parcialmente las dosis aplicadas de fertilizante al suelo (^{Lara et al., 2007}). Cantidades que se pueden reducir entre un 20 a 50% (^{Méndez, Castro y García, 2015}). A pesar de que el valor p de 0,4524 y de 0,1076 para la figura 3A y 3B, respectivamente son mucho mayores al valor de significación α de 0,05; se presentó un aumento en la altura del 20,88% a los 20 días y del 11,2% a los 36 días gracias al uso de FBNL respecto al control positivo (adición de nitrógeno en forma de urea). Un resultado importante para el maíz se dio en la longitud que experimentaron las raíces en el tratamiento con el microorganismo FBNL mostrado en la figura 4A, seguido por el FBNL + urea. Aunque no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, el efecto que ejerció la aplicación del inóculo FBNL con respecto a la adición de urea se representó en un incremento del 13,75% en esta variable. Puede ser que el crecimiento se deba a fitohormonas que inducen el alargamiento de la raíz ya que el género Azotobacter pertenece a las PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) que estimula el desarrollo vegetal y unido a la fijación de nitrógeno incrementa el rendimiento de gramíneas (^{Díaz et al., 2001}).

En contraste a esto la Brachiaria (figura 4B) sí mostró diferencias significativas entre el tratamiento FBNL y el control positivo con un valor p de 0,0047 el que es menor al nivel de significación α de 0,05 lo cual se considera estadísticamente significativo y con la posibilidad de aceptar que hay un efecto positivo del microorganismo sobre la longitud de las raíces.

La figura 5 indica que el tratamiento que mejor estimuló el peso fresco de la parte aérea del pasto (Brachiaria decumbens) fue el empleo de inóculo más adición de urea seguido de sólo el inóculo; el no tener diferencias significativas entre tratamientos (valor p de 0,1885 mayor a la significancia estadística α de 0,05) no elimina la posibilidad de considerar el efecto que manifestó el FBNL, ya que incrementó en un 43,2% el peso fresco con respecto al control positivo.

Tal como lo menciona ^{Guzmán et al. (2012)}, el crecimiento de la planta pudo haber dependido de la capacidad de Azotobacter en lograr un establecimiento alrededor de las raíces seguido de su capacidad para suministrar nutrientes. El notable desarrollo en el peso de los brotes coincide con los resultados que se obtuvieron con la aplicación de cepas nativas del género Azotobacter en semillas del pasto angleton (Dichanthium aristatum) donde se demostró que el 67,66% de material vegetal inoculado tuvo un mayor promedio de alturas de tallo, longitud de hojas y un notable desarrollo vegetativo de la planta (^{Lara et al., 2011}).

De manera similar, la figura 6 presenta el contraste en la evaluación del peso seco para brotes y raíces de Brachiaria decumbens, ya que para este (figura 6B) se presentaron diferencias significativas en comparación a los brotes. Con un valor p de 0,0438 hay significancia estadística entre los tratamientos. La mayor efectividad fue para FBNL lo que indica un mayor rendimiento en la producción de materia seca debida a la actividad que ejerció el microorganismo compatible con el género Azotobacter.

El peso seco de los brotes (figura 6A) mostró un comportamiento similar pues los tratamientos inoculados fueron los más efectivos, en especial el que se acompañó con urea. Aunque no se hayan presentado diferencias significativas (valor p de 0,2192), no se descarta el buen funcionamiento que el FBNL (sin acompañamiento de urea) presentó, porque incrementó en un 41,25% el peso con relación al control positivo. Valores indicativos de una mejor eficiencia del microorganismo y su relación suelo-planta.

En síntesis, hay relación de los resultados obtenidos en la altura de Brachiaria con el peso seco y fresco de sus brotes, ya que estas variables mostraron el mismo comportamiento alcanzando efectos deseables cuando se usó el tratamiento con los FBNL + urea seguido del que sólo contenía FBNL. El maíz por su parte mejoró la longitud de su raíz gracias al tratamiento con el FBNL.

La influencia de las características del suelo tales como el pH (fuertemente ácido), la baja cantidad de materia orgánica y la alta densidad aparente, pudieron afectar el crecimiento de las plantas de maíz debido a las malas condiciones que se tuvieron para que los microorganismos se hubieran logrado establecer. A diferencia de las plantas de Brachiaria decumbens, la cual gracias a su buena adaptabilidad a suelos ácidos de baja fertilidad como los que hay en el trópico (^{Rao et al., 1998}), al buen crecimiento radical y al poder adquirir el nitrógeno mediante fijación asociativa (^{Dalton y Kramer, 2007}), presentó resultados significativos.