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Introducción
El cáncer gástrico (CG) es la cuarta neoplasia más frecuente a nivel mundial1. La enfermedad es el resultado de la interacción de factores ambientales, genéticos y la infección por H. pylori, considerado el principal factor de riesgo de CG2, sin embargo, menos del 3% de sujetos infectados progresan a enfermedades gástricas graves y menos del 1% desarrollan CG3.
En Colombia el CG constituye la principal causa de mortalidad por cáncer, no obstante, el riesgo y la incidencia de la patología en diferentes regiones del país es contrastante en relación con la altitud3. En la zona andina del departamento de Nariño la incidencia de CG es una de las más altas del mundo (150/100.000 habitantes), contrario en la costa pacífica la incidencia de CG es baja (6/100.000 habitantes); pese a que la prevalencia de la infección por H. pylori es alta y similar en ambas poblaciones, (>80%)4
La incidencia en regiones de alto riesgo para CG ha sido ampliamente explicada, pero, en la población costera de Nariño, no se ha encontrado una respuesta suficiente al fenómeno de su bajo riesgo a CG, pese a que la infección de la población con cepas africanas de H. pylori de baja virulencia (posiblemente por un mayor tiempo de coevolución con su hospedero)4 y la alta infección parasitaria con helmintos modifica posiblemente el tipo de respuesta inmune contra H. pylori a Th-2 (antiinflamatoria)5.
Por lo anterior, otros factores como la susceptibilidad genética al CG propia del hospedero podrían incidir en la patogénesis de la enfermedad. La susceptibilidad genética representada en los polimorfismos de citoquinas proinflamatorias, como la interleuquina (IL)-1-β-511 y el factor de necrosis tumoral (TNF)-α-308, se sobre-expresan en pacientes infectados por H. pylori y generan un mayor riesgo de desarrollar hipoclorhidria, procesos inflamatorios más severos y lesiones precursoras de CG6. Por consiguiente, el objetivo fue estudiar los polimorfismos IL1B-511 y TNF-A-308 y su posible asociación con lesiones precursoras de CG en pacientes infectados con H. pylori provenientes de Tumaco, población de bajo riesgo de CG.
Material y Método
Tipo de estudio
Cuantitativo, transversal observacional, con elección de pacientes por conveniencia.
Pacientes
De una base de 203 individuos provenientes de una zona de bajo riesgo (Tumaco-Nariño) se reclutaron 105 pacientes con síntomas de dispepsia, de los cuales 81 estaban infectados por H. pylori, (n=63) con gastritis crónica no atrófica (GCNA) y (n=18) con lesiones precursoras de CG, grupo conformado por individuos con gastritis crónica atrófica (GCA) y sin metaplasia intestinal (MI). Los criterios de inclusión fueron, pacientes mayores de 40 años con síntomas de dispepsia, sujetos sin cáncer, sin enfermedades crónicas y sin terapia específica contra H. pylori en el último mes.
Procedimientos histopatológicos y microbiológicos
Se determinó el tipo de lesión gástrica o precursora de cáncer gástrico de acuerdo a la escala análoga visual de Dixon. El diagnóstico de la infección por H. pylori se realizó mediante la tinción de Giemsa y cultivo microaerofílico en agar sangre de cordero.
Muestra de sangre
Tres tubos con 5 ml de sangre total fueron extraídos por personal de enfermería del Hospital San Andrés de Tumaco, por punción de la vena media cubital en condiciones asépticas, basales y en ayunas.
Extracción de ADN genómico
El ADN fue obtenido a partir de sangre mediante el kit de extracción DNA isolation Kit Ultra Clean Blood Spin (MOBIO, Mobio Technologies Inc, San Diego, EU). Para visualizar el ADN se corrió un gel de agarosa al 1 % a 100 V durante 40 min.
Determinación de los polimorfismos IL-1B-511 y TNF-A-308
Para el estudio de los polimorfismos IL-1B-511 y TNF-A -308, se empleó la técnica de PCR-RFLP. La amplificación del gen IL-1B se realizó empleando los iniciadores: F: 5′-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3′ y R: 5′-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3′, que amplificaron una secuencia de 305 pb. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μl, que contenía 1x de buffer de PCR, 0,5 mM de MgCl2, 0,1 mM de desoxinucleótido trifosfato (dNTPs), 0,25 μM de cada iniciador, 0,1 U de Taq polimerasa (Bioline) y 50 ng/μL de ADN. El perfil térmico consistió en una desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, seguida de 34 ciclos de 45 seg a 94 °C, 45 seg a 57 °C y 45 seg a 72 °C, y finalmente, un ciclo de extensión a 72 °C por 7 min. La secuencia amplificada fue sometida a digestión con la enzima de restricción AvaI (Thermo Scientific, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US), la reacción se llevó a cabo durante 16 h a 37 ºC, en un volumen final de 30,2 μl, que contenía: 1X de Buffer Tango, 10 U/μL AvaI, 18 μL de agua grado molecular y 1 μg/μL de ADN amplificado6.
Para la genotipificación del polimorfismo TNF-A-308, se amplificó del gen TNF-A usando los iniciadores: F: 5′AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′ y R: 5′ TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3′, que amplifican una secuencia de 107 pb. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μl, que contenía 1X de buffer de PCR, 0,5 mM de MgCl2, 0,1 mM de desoxinucleótido trifosfato (dNTPs), 0,25 μM de cada iniciador, 0,1 U de Taq polimerasa (Bioline) y 50 ng/μL de ADN. El perfil térmico consistió en una desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, seguida de 30 ciclos por 1 min a 94 °C, 52 °C por 1 min y 72 °C por 1 min, y finalmente, un ciclo de extensión a 72 °C por 5 min. La digestión fue llevada a cabo con la enzima de restricción NcoI (Thermo Scientific, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US), la reacción de restricción se llevó a cabo durante 16 h a 37 ºC, en un volumen final de 30,3 μl, que contenía: 10X de Buffer Tango, 0,3 μL NcoI, 18 μL de agua grado molecular y 1 μg/μL de ADN amplificado7.
Se visualizó el polimorfismo de IL-B-511 en geles de agarosa al 3% a 80 V durante 70 min y el polimorfismo TNF-A-308 en geles de agarosa al 4% a 80 V por 90 min.
Validación del método PCR-RFLP’s
Se estandarizó y validó la metodología de PCR-RFLP´s evaluando la concordancia (Coeficiente de Kappa) de los resultados de determinación de variantes alélicas y genotípicas de IL-B-511 y TNF-A-308 con el método directo de secuenciación e identificación de mutaciones. Para tal efecto fragmentos amplificados fueron secuenciados en dos direcciones en Vanderbilt Genetic Institute Core Facilities, Estados Unidos. La edición y alineación de las secuencias se llevó a cabo utilizando el software BioEdit V 7.2.6.1®. Los cambios en las secuencias se detectaron por alineación local con las secuencias de referencia de los dos genes de citoquinas del GenBank. Los resultados de las variantes alélicas y genotípicas identificadas por PCR-RFLP para los dos genes de citoquinas en el ensayo de validación, mostraron un buen nivel de concordancia con los encontrados por el método de secuenciación e identificación de mutaciones en los genes IL-1B 511 y TNF-A-308, (Kappa, κ=0,83 y κ=0,81) respectivamente.
Análisis genético y estadístico
Se estimaron las frecuencias alélicas, genotípicas y el equilibrio de Hardy-Weinberg (EH-W) con el software Arlequín versión 3.01. Usando el software el SPSS Statistics versión 22, se aplicó el modelo de regresión logística binomial (Odds Ratio (OR), intervalo de confianza = 95%), para conocer la posible asociación entre los polimorfismos y las lesiones precursoras de CG en presencia de H. pylori. Para este modelo se establecieron variables significativas que podrían estar relacionadas con las lesiones precursoras de malignidad, por lo cual se realizó un análisis estadístico bivariado y una tabla de contingencia que se contrastó mediante un test de chi cuadrado (X 2) (p≤0,05).
Este estudio contó con el aval del Comité de Ética Humana de la Universidad de Nariño, según acta de aprobación No. 04 del 6 de Junio de 2014. Todos los nombres de los participantes se mantuvieron en confidencialidad y firmaron su consentimiento informado.
Resultados
La prevalencia de la infección por H. pylori en la población de Tumaco (n=105) fue de 77,1%. La mayoría de los individuos evaluados presentaron diagnóstico histológico de GCNA (77,78%), mientras que 18 (22,22%) presentaron GCA, de los cuales 13 con metaplasia intestinal (MI) y 5 sin MI. Se encontró asociación significativa entre GCNA, las lesiones precursoras de CG y el género y entre las enfermedades analizadas y el tipo de seguridad social de los pacientes (p≤0,05), (Tabla 1).
Tabla 1 Características sociodemográficas según lesiones precursoras de cáncer gástrico
GCNA: gastritis crónica no atrófica; GCA: gastritis crónica atrófica; MI: metaplasia intestinal.
En total se analizaron 78 perfiles polimórficos de IL-1B-511 y 79 de TNF-A-308 (fig. 1 , fig. 2). Se evidenció EH-W para el polimorfismo IL-1B-511 en el grupo con lesiones precursoras de malignidad, sin embargo, existieron diferencias significativas con el grupo de pacientes que presentaron enfermedad benigna (GCNA), (p=0,001) (Tabla 1). Se encontró EH-W para el polimorfismo TNF-A-308 en el grupo de pacientes con GCNA. En el grupo de pacientes con GCA, para el mismo polimorfismo, se evidenció fijación del alelo G, (Tabla 2).
Figura 1 Patrón electroforético de productos de digestión por PCR-RFLP del gen IL-1B en gel de agarosa al 3%. MP: Marcador de tamaño molecular de 50 pb (Fermentas, Life Technologies, Inc, Carlsbad, US). Carril 1: banda de 305 pb genotipo homocigoto TT. Carril 2: bandas de 190 y 115 pb genotipo homocigoto CC y carril 3 y 4: bandas de 305, 190 y 115 pb genotipo heterocigoto CT.
Figura 2 Patrón electroforético de productos de digestión por PCR-RFLP del gen TNF-A en gel de agarosa al 4%. MP: Marcador de tamaño molecular de 50 pb (Fermentas, Life Technologies, Inc, Carlsbad, US). A. Carril 1 y 3: bandas de 107, 87 y 20 pb genotipo heterocigoto AG. Carril 2 y 4: bandas de 20 y 87 pb genotipo homocigoto GG. MP: 100 pb (Bioline, Meridian Life Science, Inc, Memphis, US). B. Carril 1, 2, 3, 4, 5 y 6: se observan bandas de 20 y 87 pb genotipo homocigoto GG y en el carril 7 genotipo homocigoto AA.
Tabla 2 Frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos IL-1B-511 y TNF-A-308 según gastritis no atrófica y gastritis crónica atrófica
CG: Cáncer gástrico; GCNA: gastritis crónica no atrófica; GCA: gastritis crónica atrófica con y sin metaplasia intestinal (Lesiones precursoras de CG). SNP’s: Polimorfismo de nucleótido único. Fa: Frecuencia alélica, FHe: Frecuencia de heterocigotos, Fg: frecuencia genotípica, Obs: Frecuencias observadas, Esp: Frecuencias esperadas.
El análisis bivariado mostró que los polimorfismos IL-1B-511 y TNF-A-308 presentaron un valor significante de X 2 igual a 0,033 y 0,028 respectivamente, sugiriendo posibles diferencias entre los genotipos de los polimorfismos y los grupos con las enfermedades gástricas evaluadas. Los OR’s para los genotipos CT y TT en IL-1B-511 fueron de 0,068 (IC=0,0063- 0,744) y 0,095 (IC=0,0083-1,091) respectivamente, evidenciando que no hay riesgo relativo significativo entre los genotipos y las lesiones precursoras de malignidad de CG. El alelo T (CT+TT) presentó un aumento de riesgo no significativo de atrofia gástrica (OR=0,7) (Tabla 3). Por otro lado, en TNF-A-308 no se determinaron OR’s por la ausencia de los genotipos AG y AA.
Tabla 3 Genotipos de IL-1B-511 y TNF-A-308 y variables sociodemográficas según riesgo a gastritis atrófica y no atrófica en pacientes de Tumaco
GCA: Gastritis crónica atrófica; GCNA: gastritis crónica no atrófica
Al considerar las variables sociodemográficas, se encontró que los hombres presentaron 4 veces más riesgo de presentar lesiones precursoras de malignidad (p=0,05), en tanto que los pacientes no asegurados presentaron un riesgo 6 veces mayor de padecer estas lesiones frente al régimen vinculado, con una diferencia relativamente moderada (p=0,06) (Tabla 2).
Validación del método PCR-RFLP’S
Los resultados de las variantes alélicas y genotípicas identificadas por PCR-RFLP’s para los dos genes de citoquinas en el ensayo de validación, fueron concordantes con los encontrados por el método de secuenciación e identificación de mutaciones. El coeficiente de Kappa, κ=0,83 y κ=0,81 muestra que hubo un buen nivel de concordancia entre los resultados de las variantes alélicas y genotípicas evaluadas por PCR-RFLP’s y los detectados por el método de secuenciación de la IL-1B 511 y TNF-A-308, respectivamente.
Discusión
En Colombia, el polimorfismo IL-1B-511 evidencia niveles diferentes de asociación con el desarrollo de CG. Estudiando el gen IL-1B, Arango et al 6. analizaron la presencia de polimorfismos en sitios -511(T/C), -31(C/T) y +3954(C/T) empleando como método de determinación la PCR-RFLP y enzimas de restricción: Aval, Alul y Taql. Este análisis fue llevado a cabo en pacientes diagnosticados con GCNA y úlcera gástrica, catalogadas como enfermedades gástricas no avanzadas, asociadas con niveles de secreción normal o elevada de ácido en el estómago, y pacientes con GCA, MI, displasia y CG, catalogadas como enfermedades premalignas y malignas, asociadas con baja secreción de ácido en la mucosa. En los casos de enfermedades gástricas no avanzadas se encontró que hay una diferencia significativa en la frecuencia del genotipo CC en la posición -31 entre pacientes infectados con H. pylori (28,57%) e individuos no infectados (8,33%), lo que sugiere que el genotipo podría estar relacionado con una predisposición a la infección por H. pylori. Sin embargo, los autores resaltan que estos resultados no apoyan ni contradicen la hipótesis de que este genotipo esté relacionado con el desarrollo de CG después de haberse presentado una infección previa por H. pylori6. Al respecto, un estudio en poblaciones mexicanas indicó que portar el alelo proinflamatorio IL-1B-31*C confiere un aumento del riesgo al desarrollo de CG o lesiones precancerosas8. Los pacientes portadores del genotipo TT para el gen IL-1B-511 en Colombia presentaron una asociación positiva con el CG, en concordancia con lo evidenciado por un metanálisis realizado en poblaciones caucásicas9, mientras que esta asociación en otros países de Latinoamérica, como Honduras, Costa Rica y Venezuela, no ha sido reportada10,11,12.
En este estudio, para la población de Tumaco, la frecuencia del alelo T>C se comportó igual que en otras poblaciones americanas (55%), africanas (57%) y asiáticas (47%) y no se encontró asociación significativa entre el genotipo TT y la gastritis atrófica13.
Otro grupo de citocinas proinflamatorias y de defensa del organismo son las del TNF, que son de dos tipos: el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y el factor de necrosis tumoral beta (TNF-β). El TNF-α es una citocina fundamental en los mecanismos normales de la inmunidad innata y adquirida, con actividad antitumoral, antiviral y antimicrobiana, que induce el crecimiento tisular, la diferenciación de tejidos y la inmunorregulación. La sobreexpresión de TNF-α con el consiguiente desarrollo de enfermedades crónicas inflamatorias y autoinmunes puede explicarse por la presencia TNF-A-308 GA de determinados polimorfismos en su gen14. Una de las variantes alélicas más estudiadas para este gen es la transición de G por A encontrada en la posición -308 del promotor del gen. Este polimorfismo en algunos casos genera una expresión aumentada, que hace que exista mayor daño en el tejido gástrico15. En Latinoamérica, estudios con PCR-RFLP (NcoI), muestran una ausencia de relación entre el polimorfismo -308 del promotor (G/A) y el desarrollo de CG11,15,16, incluso, en poblaciones del África el polimorfismo -308 no se encontró asociación a pacientes con GCA y CG17. En contraste con estos resultados, en poblaciones caucásicas hay una asociación significativa del alelo A y el genotipo AA con CG, resultado que demuestra que los portadores de este alelo tienen un aumento en la producción de TNF-α y su exceso causa una severa inflamación gástrica que incrementa el riesgo de cáncer18,19. En poblaciones asiáticas este polimorfismo se asocia con lesiones precursoras de CG, no obstante en poblaciones occidentales las frecuencias de estos marcadores genéticos muestran variaciones entre los diversos grupos étnicos y raciales en su distribución19.
En este estudio, para la población de Tumaco, la frecuencia del alelo G>A se comportó igual que las frecuencias de estos alelos en otras poblaciones americanas (93%), africanas (88%), europeas (87 %) y asiáticas (94%) y no se encontró asociación significativa entre el genotipo AA y GCNA13. Los contrastantes resultados encontrados con la asociación de los polimorfismos evaluados y el CG con respecto a otras regiones del mundo, podrían deberse al resultado de la contribución genética parental, la confluencia de migraciones europeas, amerindias y africanas en el proceso de colonización, el estilo de vida y la susceptibilidad a la enfermedad20.
Por otra parte, el riesgo de los hombres de contraer CG es mayor que el de las mujeres, reflejando la tendencia mundial que sigue la proporción 2:113. En cuanto a seguridad social, las personas no vinculadas al régimen de salud presentarían en su gran mayoría un nivel socioeconómico bajo lo cual tendría un impacto en la salud, ya que posiblemente se asocia con algunos factores de riesgo, como la infeccion por H. pylori y directamente asociada con patologías gástricas21.
Las limitaciones de esta investigación se relacionan con la necesidad de realizar estudios confirmativos que evalúen la influencia de la coevolución o disrupción Huesped-H. pylori en la expresión de los polimorfismos de citoquinas estudiados y en las lesiones precursoras de CG, ya que la ancestría de las cepas bacterianas y el origen étnico africano de la población Tumaco podrían incidir en la distribución de las frecuencias de los polimorfismos y en la susceptibilidad genética propia del hospedero generando una baja predisposición de los pobladores del municipio de Tumaco a desarrollar lesiones precursoras de malignidad y CG.
