Abstract

Objective: To compare the effect of all-trans retinoic acid in the production of cytokines by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) among children with moderate malnutrition (Dn-M), severe (Dn-G) and a control group of children eutrophic (Eu). Methodology: Quasi-experimental research in vitro, to assess the effect of different doses of atRA (0, 17, 30 and 50 nM) on the concentration of cytokines (L-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α and IL-12p70) in PBMC of 21 children, divided into three groups: seven with moderate malnutrition (Dn-M), 7 with severe malnutrition (Dn-G) and 7 healthy children (Eu). Results: Although 71% of malnourished children (Dn-G and Dn-M) showed signs of infection, had a population of leukocytes and lymphocytes lower than the Eu. Children Dn-G reported a concentration of C-reactive protein (CRP), significantly higher than the other two groups and simultaneously younger, shorter (T/E) and lower hemoglobin. The concentration of IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα and IL-10 in PBMC was higher in Dn-M than in Dn-G and Eu. Comparison between groups was found that 50 nM of atRA concentration of IL-8 was significantly lower and the higher IL-10 in Dn-G compared with the other two groups. MANOVA analyses indicate these differences were attributed to the fact to belonging the group (Dn-G) and not the dose of atRA (50 nM). Analysis of the effect of different doses of atRA in each group showed a significant decrease with 50nM of atRA of IL-8 in Dn-G and IL-10 in Eu. IL-12p70 increased with doses of 17 nM in Dn-M. Conclusion: atRA affects the production of cytokines but the main determinant of concentration is the type of malnutrition.

Key words: tretinoin, cytokines, protein-energy malnutrition, C-reactive protein, children.

INTRODUCCIÓN

Las carencias de nutrientes aumentan el riesgo de enfermedades infecciosas y generan mayor mortalidad (1). En el mundo mueren anualmente cerca de 10 millones de niños, la mitad en países en desarrollo y en relación con la desnutrición (2,3). En niños desnutridos es común encontrar deficiencias concomitantes de micronutrientes, entre ellos de vitamina A, en forma de 9-cis-ácido retinoico y de all-trans ácido retinoico (atRA), este último considerado como el principal metabolito activo y que modula el sistema inmunológico por participar en la respuesta humoral y celular, al unirse a receptores nucleares RAR-RXR(4-8).Una deficiencia de vitamina A altera el balance de citocinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias y el perfil de linfocitos Th1 y Th2, generando una respuesta inflamatoria inadecuada(3-4,9-15). La deficiencia preexistente de vitamina A, al parecer, incrementa las infecciones en los niños menores de cinco años; la suplementación ha demostrado una reducción en el riesgo de muerte de estos niños hasta de 30% (16).

Cultivos de CMSP obtenidas de los niños del estudio

Mediante la técnica de Ficoll se reportan porcentajes de recuperación de CMSP entre 60 y 95% (36-37), en nuestro estudio luego de la incubación de las CMSP durante 48 horas con diferentes dosis de atRA, todos los grupos mostraron una disminución similar en el número de células recuperadas, obteniendo un porcentaje promedio de recuperación cercano al 64%, sin diferencias significativas en la disminución (p=0,393), concluyendo que los cultivos son comparables desde el punto de vista de las CMSP recuperadas.

Comparación en la concentración de citocinas entre los grupos estudiados

Sin estímulo de atRA (cultivos control) no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los valores promedio de ninguna de las citocinas entre los tres grupos, aunque la concentración de la IL-6, IL-10 e IL-12p70 fue mayor en los niños con desnutrición que en Eu. Entre los dos grupos con desnutrición, los Dn-M presentaron mayores concentraciones de IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 y TNFα que los Dn-G. Cuando se compararon los valores promedio de citocinas con los diferentes estímulos de atRA entre los 3 grupos, se observaron mayores efectos con la dosis de 50 nM, con esta dosis el valor medio de IL-8 en niños con Dn-G fue significativamente menor (p=0,021) en comparación con la de los otros dos grupos (Tabla 2, figura 1A); con 50 nM de atRA, los Dn-G también presentaron valores mayores pero no significativos, de IL-1β e IL-10 que los otros dos grupos. Al estimular las CMSP con las diferentes dosis de atRA el promedio del TNFα mostró una concentración menor en los Eu que en los otros dos grupos pero la diferencia no fue significativa (Tabla 2, figura 1B ).

Al interior de cada grupo se observó que la dosis de 50 nM de atRA produjo el mayor valor promedio de IL-1β (p=0,765) y el menor valor promedio tanto en la IL-10 como en la IL-12p70, sin diferencias significativas entre ellos (p=0,328 y p=0,912 respectivamente), (Tabla 2, figura 1C, D y E).

Para comprobar si las diferencias de los promedios de cada una de las citocinas entre los grupos se debían al grado de desnutrición (consecuencia de pertenecer al grupo) o eran efecto del estímulo con atRA independiente del grupo, se utilizó la prueba estadística MANOVA (la cual hace una comparación múltiple de todos los estímulos y de todos los grupos al mismo tiempo), teniendo en cuenta el criterio de Wilk's, encontrando que las diferencias significativas estaban determinadas por el grupo (p=0,000), más no por los estímulos (p=0,436). Mediante el pos hoc de Tukey, se determinó que las diferencias significativas se presentaban entre los Dn-G con el promedio más bajo de IL-8 y más alto de IL-10 comparado con los Eu (Tabla 3).

En los sobrenadantes de las células control (sin estímulo) se halló una correlación positiva y significativa entre las citocinas IL-1β con la IL-6 (r=0,884, p=0,00), con la IL-10 (r=0,927, p=0,00) y con el TNFα (r=0,874, p=0,00). La IL-1β del sobrenadante control también correlacionó positivamente con la IL-6 producida con dosis de atRA de 17, 30 y 50 nM (r=0,839, p=0,00; r=0,897, p= 0,00; r=0,792, p= 0,00 respectivamente), con el TNFα en células estimuladas con dosis de atRA de 17, 30 y 50 nM (r=0,831, p=0,00; r=0,834, p=0,00; r=0,894, p=0,00 respectivamente) y con la IL-10 en sobrenadante estimulado con dosis de atRA de 17, 30 y 50 nM (r=0,642, p=0,00; r=0,638, p=0,00; r=0,741, p=0,00 respectivamente). Con dosis de 50 nM de atRA se encontró una correlación positiva entre la IL-8 y la IL-1β (r=0,595, p=0,00) y entre la IL-8 con la IL-6 (r=0,605, p=0,00).

Cambio al interior de cada grupo en la producción de citocinas según las diferentes dosis de atRA

Se midieron en un mismo momento los valores promedios de las citocinas en los sobrenadantes de CMSP al interior de cada grupo de niños y se encontró una disminución significativa en la producción de IL-8 con el estímulo de 50 nM de atRA (Figura 2, Tabla 2). En los sobrenadantes de CMSP de niños con Dn-M se observó un aumento significativo en los promedios de IL-12p70(Figura 3, Tabla 2). En el grupo de niños Eu se observó una disminución significativa de la IL-10 (Figura 4, Tabla 2).

El mayor cambio en la concentración de IL-1β, aunque sin significancia estadística, se observó con dosis de 50 nM, con la cual aumentaron las concentraciones de esta citocina en los sobrenadantes de CMSP en los tres grupos de niños estudiados: Dn-G, Dn-M y Eu (tabla 2). La dosis de 50 nM de atRA en comparación con el control (sin atRA) indujo un aumento en los valores de IL-6 en sobrenadantes de CMSP de niños con Dn G y contrariamente, una disminución de dicha citocina en los sobrenadantes de CMSP de niños con Dn-M y Eu, sin diferencias significativas (Tabla 2, figura 1F). Las diferentes dosis de atRA incrementaron la producción de TNFα en niños con Dn-G y la disminuyeron en niños Eu, aunque tampoco se presentó significancia estadística.

DISCUSIÓN

La desnutrición y la deficiencia de micronutrientes impiden una adecuada respuesta inflamatoria al disminuir la producción de reactantes de fase aguda como la CRP y alterar la respuesta inmune mediada por células Th1 y Th2, en la cual intervienen las citocinas, siendo la respuesta Th2 la que más se afecta (37).

En la primera fase del estudio se analizaron las características clínicas y el estado nutricional de los niños con el fin de tener mayores elementos de análisis al estimular sus CMSP con atRA, encontrando que el 71% de los Dn-G presentaron procesos infecciosos, lo cual se correlacionó con un valor significativamente mayor de CRP. En concordancia la mayoría de investigaciones han demostrado que en malnutrición hay aumento de proteínas de fase aguda, pese al desgaste proteico (28,30,38-39) . Amesty-Valbuena y colaboradores (17) demostraron que había una concentración de CRP significativamente mayor en niños infectados que en sanos, pero una magnitud de respuesta superior en niños con estado nutricional adecuado que en los desnutridos graves; en la MPE aunque se carece de suficientes sustratos para la síntesis de nuevas proteínas, se incrementa el recambio proteico para producir las de fase aguda, pero en menor magnitud, por lo que hay mayor ocurrencia de sepsis.

La atrofia generalizada de tejidos linfoides y escasez de nutrientes como la vitamina A alteran la proliferación de linfocitos T; en nuestro estudio los niños con desnutrición e infección presentaron valores bajos de linfocitos. La célula dendrítica presentadora de antígenos (CPA) aporta atRA e IL-2 a la célula T, durante la sinapsis inmunológica y estimula la expresión de ciclina D3, por medio de receptores nucleares RAR, para activar la maquinaria celular, promoviendo el paso de los linfocitos T (LT) de la fase G1 a la fase S y estimulando su proliferación; la IL-2 disminuye la apoptosis y aumenta la vida media del LT humano activado; ante una deficiencia de vitamina A la población celular disminuye (4-7). Las citocinas IL-1, IL-6 y el TNFα también promueven la proliferación de LT, los valores de estas tres citocinas fueron mayores en los Dn-M, quienes presentaron además una mayor cantidad de linfocitos, en comparación con los Dn-G.

La anemia afecta el sistema inmunológico, por alterar la función de los LT, la producción de citocinas y la actividad de los neutrófilos, generando mayor dificultad para combatir las infecciones (40-43). Entre el hierro y las citocinas pro-inflamatorias existe una relación recíproca, dicho mineral regula su producción, en particular la IL-1β, al tiempo que las citocinas permiten el mantenimiento del balance de hierro intracelular (40); en el presente estudio los Dn-G mostraron valores significativamente más bajos de hemoglobina y concentraciones más bajas de citocinas pro-inflamatorias; un estudio previo reportó concentraciones bajas de hemoglobina en niños con kwashiorkor (8.9±1.24 g/L) y en niños con marasmo (9.8±1.41 g/L)(30). La concentración baja de IL-1β e IL-8 en niños con Dn-G, se relacionan con bajas concentraciones de hemoglobina en este grupo; Bergman y colaboradores (41) demostraron que las CMSP de pacientes con anemia por deficiencia de hierro secretaban menos IL-2 que las células de sujetos sanos, citocina esencial para la proliferación y diferenciación de LT; Jason y colaboradores (42) también reportaron disminución de IL-8 como en el presente estudio, además de incremento de la IL-6 en niños con deficiencia crónica de hierro.

Los promedios de las citocinas se midieron antes de estimular las CMSP con atRA (control), encontrando concentraciones mayores en niños desnutridos que en los Eu, y entre los desnutridos eran mayores en Dn-M que en Dn-G. Diversas investigaciones reportan concentraciones mayores de citocinas proinflamatorias en CMSP en niños desnutridos que en eutróficos (28-29,44-45). Otros autores han reportado menor producción de IL-1β en CMSP de niños con desnutrición grave (kwashiorkor), lo que se relaciona con la incapacidad de manifestar fiebre y la dificultad para el diagnóstico de sepsis (46-47). En el presente estudio el grupo de niños con Dn-G fue el más afectado en peso y talla, el más anémico, con los valores de CRP más elevados, más bajos de linfocitos y con menor capacidad para producir citocinas, evidenciando así que entre mayor es el grado de desnutrición, mayor es el compromiso en la respuesta inmune.

Los niños con Dn-G tipo kwashiorkor presentan comprometida la reserva y disponibilidad de micronutrientes y aminoácidos, lo que les impide realizar un adecuado recambio proteico y responder a las demandas de la infección (39). En el presente estudio se observaron diferencias en la producción de citocinas según el grado de desnutrición, lo que podría explicarse por las carencias múltiples de sustratos para aumentar sus concentraciones (14). Azevedo y colaboradores (29) demostraron que las células sanguíneas de los niños con desnutrición no eran deficientes en la producción de TNFα, y sugirieron que sus células aumentaban de manera primordial la cantidad de esta citocina; Muñoz y colaboradores (48) reportaron disminución del TNFα en niños con marasmo; Velásquez y colaboradores (30) encontraron valores significativamente mayores de IL-8, IL-1β, IL-6, TNFα e IL-10 en el suero de niños con kwashiorkor comparados con los de niños con marasmo; aunque se conoce que las concentraciones de citocinas pro-inflamatorias, son más bajas en las células que en el plasma de los niños desnutridos.

La disminución del TNFα puede provocar diseminación de la infección y sepsis (49), principal causa de muerte en los niños con Dn-G(19). En este estudio se encontró una fuerte correlación entre la IL-1, IL-6 y el TNFα, las dos primeras contribuyen a la síntesis de proteínas de fase aguda (50-51). Adicionalmente estas tres citocinas correlacionaron con el valor medio de IL-10, lo que podría sugerir que la IL-10 (reguladora) aumenta para atenuar la respuesta pro-inflamatoria.

Al adicionar atRA a los cultivos de CMSP de niños con Dn-G se evidenció una tendencia no significativa al aumento de IL-1β y TNFα y a la disminución de IL-12p70 e IL-10, lo que podría sugerir que se favorece la focalización de la inflamación y se evita la sepsis; sin embargo este efecto se contradice con el hallazgo más relevante en este grupo que fue la disminución significativa en la IL-8 con dosis de atRA de 50 nM, potente factor quimiotáctico de neutrófilos, que amplifica la respuesta inflamatoria local; los neutrófilos expuestos a IL-8 junto con el TNFα se activan para producir explosión respiratoria y contribuir a la defensa del hospedero(48), por tal motivo la disminución de la IL-8 en los niños con Dn-G, quienes presentan procesos infecciosos y requieren localizar la respuesta inflamatoria, podría considerarse como un efecto poco benéfico del atRA a dosis altas (50 nM), debido a que al no localizar la inflamación, el proceso infeccioso se podría diseminar aumentando la producción de TNFα por otros tejidos, con efectos deletéreos para la salud y podría generar un alto grado de mortalidad por sepsis (51).

La adición de atRA a cultivos en Dn-M evidenció un aumento significativo de la IL-12p70 (pro-inflamatoria) con dosis de 17 nM; ésta se produce rápidamente cuando hay una infección y aumenta la producción de INF? para activar las células fagocíticas, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th1 e inhibiendo Th2; sin embargo con la dosis de 50 nM la IL-12p70 presentó una tendencia a disminuir en los tres grupos estudiados, lo que podría corroborar el efecto del atRA en favor de la respuesta Th2, como lo demuestran investigaciones previas que reportan que el atRA a través del ligando RAR/RXR inhibe la trascripción de genes de respuesta (22, 52-54).

Varios estudios reportan aumento de la IL-10 como un mecanismo de autorregulación (la IL-12p70 induce la producción de IL-10, para bloquear la acción de la IL-12p70 (22,55-56). Los resultados indicaron que la IL-10 presentó una tendencia a la disminución en los tres grupos de niños, pero permaneció más elevada en niños con Dn-G en comparación a los niños con Dn-M, similar a lo reportado en otros estudios, que evidencian efecto estimulador o ningún efecto de los retinoides en la síntesis de IL-10 (20), por lo que el retardo leve en la expresión de la IL-10, comparada con la IL-12p70 y con otras citocinas pro-inflamatorias tanto in vivo como in vitro, evidencia una respuesta particularmente efectiva de regulación (56) y posiblemente para poder evidenciar el efecto en la disminución de IL-12p70 y el aumento en la IL-10, se requieran dosis más altas de atRA o un mayor lapso de tiempo; no obstante Dawson y colaboradores (20) reportaron en un estudio la disminución en IFN?, IL-2, IL-12p70 y TNFα en CMSP de individuos sanos, dependiente de la dosis de atRA y evidente a las 12 horas post estímulo.

En los niños Eu se encontró una disminución significativa en la concentración de IL-10 con dosis de 50 nM de atRA, su disminución con dosis altas de atRA podría comprometer la capacidad de regulación de la respuesta inflamatoria en niños con adecuado estado nutricional (49).

Una limitante de esta investigación es que no permite sacar una conclusión en cuanto a la inducción de los linfocitos T hacia un perfil Th1 o Th2; tampoco se pudieron homogenizar el tipo de infección (que determina repuesta Th1 o Th2), el tiempo de evolución del proceso infeccioso, la depleción de nutrientes requeridos para el funcionamiento del sistema inmunológico, entre otros (43,57-58).

Prospectiva: continuar investigando las repercusiones de la suplementación con vitamina A en la disminución de la IL-8 en los niños con Dn-G, la cual es clave para la quimioatracción, localización de la infección y evitar la sepsis, debido a que pudiera ser más un riesgo que un beneficio su disminución en una fase inicial de la infección.

Quedan interrogantes: ¿la inducción que hace el atRA en la producción de citocinas requiere del apoyo de otros nutrientes o de un tiempo de estímulo mayor?, ¿la respuesta inmunológica de un niño con desnutrición depende del tipo de desnutrición que presente?, ¿el tratamiento de recuperación nutricional y en especial la suplementación con micronutrientes, debería ser diferente según la modulación que se quiera lograr en el sistema inmunitario o dependerá además del tipo de infección y del estado nutricional?

AGRADECIMIENTOS

A la bióloga Ruth Beatriz Peña por el acompañamiento en las técnicas de laboratorio. A la Vicerrectoría de Investigación, a la Escuela de Nutrición y Dietética y al Grupo de Investigación en Alimentación y Nutrición Humana de la Universidad de Antioquia por el apoyo económico.

Conflicto de Intereses: no existen.

Origen del apoyo económico. Los recursos para realizar la investigación se obtuvieron de la Universidad de Antioquia por Vicerrectoría de Investigación mediante la estrategia de sostenibilidad a grupos 2009-2010 y de la Escuela de Nutrición y Dietética.

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