Proteínas reguladoras del hierro (IRPs) y elementos de respuesta al hierro (IREs)

En el metabolismo del hierro participa un conjunto de proteínas, muchas de las cuales son reguladas luego de su transcripción, según el contenido de hierro intracelular. Las proteínas reguladoras de hierro (IRPs, por su nombre en inglés iron regulatory proteins), son proteínas citoplasmáticas que tienen interacción directa con ciertas regiones del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) llamadas elementos de respuesta al hierro (IREs, por su nombre en inglés iron regulatory elements), modulando de esta manera la expresión de proteínas blanco ^1,2.

Existen dos proteínas citosólicas reconocidas con características IRP: IRP1 e IRP2, las cuales tienen diferencias en cuanto al peso molecular, estructura

y modulación por el contenido de hierro intracelular. La IRP1 tiene 889 aminoácidos (aa) ³ y un peso molecular de 90 kDa, comparte 30 % de homología con la aconitasa mitocondrial (ACO2) ⁴ y contiene en su estructura, cuatro átomos de hierro y cuatro de azufre unidos por enlaces disulfuro con cisteína. Esta disposición se conoce como la forma activa; cuando solo tiene tres átomos de hierro y cuatro de azufre está en su forma inactiva. En la forma activa, la IRP1 no puede interactuar con el ARNm de otras proteínas para modular su expresión y en esta conformación, la proteína se comporta como una enzima, específicamente tiene actividad aconitasa ^1,5. La forma enzimática (activa), predomina cuando existen altas concentraciones de hierro en la célula y la IRP1 disminuye la afinidad de unión con el ARNm de proteínas blanco; pero en un estado de insuficiencia de hierro, la IRP1 disminuye el contenido de este mineral, cambia su conformación y permite la unión con alta afinidad, al ARNm correspondiente a genes diana. Por lo tanto, la concentración celular de hierro regula los cambios estructurales de la IRP1 y su función (1,5-7).

La IRP2 tiene 936 aa ⁸, lo que hace que aumente su peso a 105 kDa. Contrario a la IRP1, no tiene hierro ni azufre en su estructura y carece de actividad aconitasa, basta entonces con la unión de la proteína al ARNm para ejercer su función. La concentración de la proteína se regula en una secuencia de 73 aa, rica en cisteína y cerca de la región aminoterminal, la cual interviene en la degradación de la proteína; además, el hierro también se encarga de modular la proteólisis específica, comportándose como un sensor del contenido citoplasmático de la IRP2, y controlando de este modo la oxidación de la proteína, la ubiquitinación y la degradación por el proteasoma ^5,6.

La IRP1 y la IRP2 son necesarias para la homeostasis del hierro; hasta el momento no se conocen mutaciones en los genes de estas proteínas en humanos, sin embargo en ratones silenciados para el gen que codifica para IRP1 se produce una sobrecarga de hierro en los riñones y en la grasa parda; cuando la supresión ocurre en el gen que codifica para IRP2, se desencadena neurodegeneración además de la sobrecarga de hierro ⁹.

Por su parte, la estructura del IRE está conformada por un tallo con longitud variable entre 25 y 30 pares de bases complementarias. Esta estructura se localiza en las regiones no traducidas (UTR, por su nombre en inglés (untranslated region) 3’ o 5’, del ARNm que codifica para algunas de las proteínas involucradas en el metabolismo del hierro; característica importante, para conocer la regulación de la traducción. En una parte del tallo, las bases no son complementarias lo que genera uno o varios bucles según el ARNm. La secuencia CAGUGH es la que participa en la formación del bucle, donde H representa A, C o U, según el ARNm para una proteína especifica ¹. Las IRPs reconocen la secuencia CAGUGH ¹⁰, y la traducción se bloquea cuando la IRP se une al IRE, en la UTR 5’; pero cuando la IRP se asocia al IRE, en la UTR 3’, se estabiliza el ARNm de la proteína y se estimula la traducción ^2,7.

Este acoplamiento de las IRPs con los IREs forma el sistema conocido como IRE/IRP, con efecto en la traducción de proteínas como la ferritina, el receptor 1 de transferrina (TfR1, por su nombre en inglés transferrin receptor protein 1) y la ferroportina (Fpn); pero a la vez esta regulación, produce una modulación entre las mismas proteínas dependiendo del grado de acoplamiento IRE/IRP. Un ejemplo, es el efecto que causa la traducción del TfR1 sobre la expresión de la ferritina: cuando ocurre la unión de las IRPs que estabilizan el ARNm del TfR1, la unión conlleva a bloquear la traducción del mensaje de la ferritina, así la captación de hierro se incrementa y las reservas disminuyen en el caso de deficiencia de hierro celular sin embargo, cuando existe suficiente hierro se observa lo contrario ^1,2,10-14.

Las proteínas del metabolismo del hierro que hasta ahora se conocen con IREs en la UTR 5’ de sus ARNm son: la ferritina L y la ferritina H, la Fpn, la ACO2 y la succinato dehidrogenasa (SDH), dos enzimas que participan en el ciclo del ácido cítrico; además la aminolevulinato sintasa (ALAS2), enzima de la biosíntesis del hemo y el factor de transcripción y sensor de oxígeno EPAS1, también conocido como HIF2 alfa. Con IREs en la UTR 3’ son: el TfR1, el transportador 1 de metales divalentes (DMT1, por su nombre en inglés divalent metal transport 1), la enzima fosfatasa del ciclo celular (CDC14A), la alfa quinasa unida a Cdc42 (CDC42BPA) y la glicolato oxidasa de ratón (Hao1) ^1,2,7.

La proteína 1 transportadora de hemo (HCP1): también recibe el nombre de PCFT (Proton-coupled folate transporter) y de transportador de soluto familia 46, miembro 1 ¹⁵; está constituida por 459 aa ¹⁶ y se ancla a membrana con sus nueve dominios; se localiza en el borde en cepillo del duodeno y ejerce su función por transporte activo y saturable ¹⁷. La HCP1 transporta el hierro hemo al citosol del enterocito, conservando intacto el anillo de porfirina, también llamado metaloporfirina ¹⁸.

La expresión apical (hacia el lado luminal del enterocito) de la HCP1, puede estar regulada de manera positiva por el tráfico o la concentración intracelular de hierro hemo ^17,19, sin embargo, esta modulación no parece ocurrir con su ARNm, en el cual la hipoxia estimula la expresión ¹⁷.

Por otro lado, la HCP1 también tiene la capacidad de transportar folato razón por la cual se considera la base molecular de la malabsorción hereditaria de folato ¹⁹; al respecto, se ha identificado que la mutación por deleción del exón 3 en el gen PCFT/HCP1, elimina la localización de esta proteína en membrana ²⁰.

La hemo oxigenasa (HO): existen dos isoformas la HO1 con 288 aa ²¹, cuya expresión se induce por situaciones de trauma, hemorragia, estrés o por aumento de la concentración de hierro hemo; se ubica en el interior de la células y su principal función es protegerlas del estrés oxidativo por medio de la degradación limitada del hierro hemo ²⁰; en tanto que la HO2 con 316 aa ²², es una proteína de expresión constante y por análisis in vitro, con microscopía confocal, parece ubicarse de manera exclusiva en la región subapical de las células, donde es colocalizada con endosomas ²³. Ambas isoformas catalizan la misma reacción con el hierro hemo, así en la absorción de esta forma de hierro, la HO se encarga de continuar con el proceso de absorción que inició la proteína HCP1; una vez en el enterocito, el hierro hemo ingresa en una vesícula citoplasmática, donde la HO hidroliza el hierro hemo dejando hierro ferroso y protoporfirina ^18,20.

Esta proteína parece estar regulada por la concentración de hierro hemo de manera que su expresión y actividad aumentan cuando incrementa la captación y la concentración de hierro hemo intracelular ¹⁹.

Finalmente, en humanos se ha observado asociación entre algunos polimorfismos de los genes encargados de la expresión de la HO y el riesgo de desarrollar el temblor esencial de la enfermedad de Parkinson ²⁴ y en ratones desprovistos de esta proteína, se encontró daño neurológico inducido por isquemia ^25,26.

El transportador 1 de metales divalentes (DMT1): también se conoce como Nramp2 (Natural resistance associated macrophage protein 2), DCT1 (Divalent cation transporter 1) y SLC11A2 (Solute carrier family 11, member 2). Tiene 561 aa ^14,16, con 12 dominios transmembranales, dos sitios potenciales de glicosilación y 73 kDa de peso molecular. El DMT1 presenta cuatro isoformas

que tienen en común 543 aa pero difieren en 18 a 25 residuos de aa, en su extremo C terminal y en 29 residuos de aa, en el extremo N terminal; también se diferencian por la presencia o no del IRE. El IRE del ARNm del DMT1 (DMT1-IRE) se ubica en la UTR 3’; las isoformas que lo contienen se expresan en la membrana apical de la célula absortiva con el fin de captar hierro extracelular, específicamente hierro ferroso (Fe++), mediante un proceso acoplado a protones; mientras que las isoformas del transportador que no contienen el IRE (DMT1-No IRE), suelen estar en los precursores eritroides y se ubican principalmente en el citosol para transportar el hierro endosomal. El DMT1 se encarga también de transportar otros metales divalentes como el zinc, el cobre, el manganeso, el cadmio, el cobalto y el plomo. El transporte de

metales se acopla con el transporte de protones. Los tejidos en los que se sintetiza esta proteína son el intestino, la médula ósea, la placenta, el hígado, los pulmones, los riñones y el músculo esquelético ^{11,14,18,27,28}.

El hierro férrico (Fe+++) debe ser reducido previamente por la citocromo b reductasa duodenal (Dcytb), para ingresar al citosol. El DMT1 acoplado al IRE, es el encargado de la regulación de la absorción del hierro, así ante una concentración intracelular baja del mineral, la IRP se une al IRE del DMT1 para permitir la síntesis del transportador y con esto incrementar la concentración de hierro, hasta el punto en el que se desacopla el sistema IRE/IRP del transportador, deteniendo su síntesis. Cuando se acopla IRE/IRP del DMT1, simultáneamente también lo hace el sistema IRE/ IRP de la transferrina, cuyo IRE se encuentra en la región UTR 5’, por lo tanto, funciona de manera inversa al DMT1, como se discute más adelante. El DMT1-No IRE por su parte, se encarga de expulsar el hierro de los endosomas durante el ciclo de la transferrina ^11,27,29, lo cual se abordará posteriormente.

Se conocen pocos casos de mutación del gen del DMT1 en humanos, pero está claro que como consecuencias aparecen desde el nacimiento, anemia microcítica hipocrómica y sobrecarga hepática de hierro ³⁰. Algunas de las mutaciones descritas son: una homocigota (E399D) en la que solo 10 % del ARNm de la proteína, se expresa correctamente; y dos hetorocigotas (R416C y la deleción de tres pares de bases en el intrón 4), que representan en ambos casos la pérdida completa de la función de la proteína ³⁰.

La transferrina (Tf): es una glicoproteína con una sola cadena polipeptídica de 698 aa y un peso molecular de 80 kDa ³². Se sintetiza y secreta principalmente en el hígado, pero otros tejidos como el cerebro y los testículos, también producen una pequeña cantidad de la proteína. En circulación, tiene una vida media de 8 días ³³ y cuenta con dos sitios de unión al hierro distribuidos en dos lóbulos ubicados en los extremos amino y carboxiterminal; cuando los dos sitios están saturados con hierro, adquiere la denominación de holotransferrina o Tf diférrica. Normalmente, un tercio del total de la proteína se encuentra en este estado, pero si solo se satura un lóbulo, la Tf es monoférrica y cuando está desprovista del metal su nombre es apotransferrina ³⁴.

La principal función de esta proteína es ligar y transportar dos moléculas de Fe+++ en la circulación hasta los tejidos que lo requieran, como las células de la cripta en el intestino y las células de la médula ósea, lugares en donde puede unirse al Receptor 1 de transferrina (TfR1) para ingresar el hierro a la célula. La alta afinidad de la Tf por el hierro se debe a que a un pH neutro, cada lóbulo idéntico de la proteína se une al mineral a través de dos residuos de tirosina (Y), uno de histidina (H) y uno de ácido aspártico (D) con los dos átomos de oxígeno del anión carbonato. Al estar la proteína saturada con hierro, se protege al organismo de daños que puede ocasionar este metal libre, por su alta actividad redox ³⁴.

La expresión de la Tf depende del reclutamiento de varios factores de transcripción cercanos a la región promotora del gen, donde se encuentran dos sitios de unión a estos factores, los cuales se denominan región proximal I (RPI) y región proximal II (RPII); la RPI por ejemplo, tiene la capacidad de interactuar con el factor nuclear hepático 4 (HNF4, por su nombre en inglés hepatocyte nuclear factor 4), mientras que la RPII presenta la secuencia CCAAT que se une a la proteína C/EBP (por su nombre en inglés CCAAT/enhancer binding protein). En ambos casos, los sitios de unión a factores de transcripción regulan positivamente la transcripción de la Tf. Por el contrario, otras condiciones como la inflamación o estímulos inmunológicos disminuyen los niveles de Tf en circulación; sin embargo, en células de hepatoma la interleucina 6 (IL6) parece aumentar la expresión de la proteína. Frente a la hipoxia en estudios in vitro han sido identificados dos elementos de respuesta a esta condición (HRE), que se unen con el factor inducible por la hipoxia (HIF-1, por su nombre en inglés hipoxia inducible factor 1), lo que explica por qué ante las condiciones de deprivación de oxígeno, ocurre un incremento de la Tf en circulación, de manera tal que pueda facilitar la cantidad suficiente de hierro necesaria para la eritropoyesis ³³.

Las enfermedades causadas por una alteración en la Tf son escasas, se conoce un trastorno llamado atransferrinemia, caracterizado por un nivel plasmático de la proteína casi indetectable, anemia microcítica y sobrecarga hepática de hierro. La baja concentración de esta proteína incrementa la cantidad de hierro libre, el cual es tóxico y predispone al hígado a una rápida captación del mineral ³⁰.

La ferritina (Ft): es una molécula esférica compuesta de 24 subunidades. El peso completo de la proteína sin hierro (apoferritina) es de 500 kDa ^11,13,35. Presenta dos tipos de cadenas, una pesada (H) con 183 aa, un punto isoeléctrico ácido, un peso molecular de 21 kDa; y una liviana (L), con 175 aa, un punto isoeléctrico básico y un peso molecular de 19 kDa ^13,35-37. El hierro parece tener mayor afinidad por la Ft H, por lo que a la cadena tipo L se le une poco o nada de hierro. Solo la cadena H, cuenta con actividad ferroxidasa para oxidar Fe++ a Fe+++ permitiendo la acumulación del hierro férrico, dentro de la Ft ^13,36,37.

La Ft se sintetiza en el bazo, la médula ósea, el músculo esquelético, el corazón y en macrófagos del sistema retículo endotelial ¹¹. En el corazón y el músculo esquelético, también se encuentra una forma de la Ft con 36 subunidades ¹³. Es una proteína principalmente intracelular; la concentración en circulación es considerablemente baja; en el plasma, la Ft se encuentra glicosilada y con un escaso contenido de hierro mientras que la Ft citosólica, presenta un alto contenido de hierro y no está glicosilada, de ahí que su principal función sea la reserva de hierro y no el transporte del mineral a menos que exista una sobrecarga de este. La proteína puede almacenar hasta 4.500 átomos de hierro ^11,13,35. La regulación de la proteína es postranscripcional y transcipcional. En la primera, el IRE se ubica en la UTR 5’ de su ARNm por lo tanto, ante una concentración de hierro baja las IRPs se unen al IRE y bloquean la traducción, pero cuando las concentraciones de hierro son altas, las IRPs no se unen al IRE permitiendo su traducción ^13,38-40. La degradación y la síntesis de la ferritina son continuas; las vías de degradación están a cargo del proteasoma o del lisosoma, esta última es la vía principal de degradación. Cuando la concentración citoplasmática de Fe++ disminuye, la Ft libera hierro lo que produce la modificación de la proteína, su ubiquitinación y la posterior fagocitosis dentro de un cuerpo vacuolar, para ser degradada por el lisosoma o ir directamente al proteasoma ^13,37. La regulación de la Ft también parece ocurrir en forma transcripcional impulsada por especies reactivas de oxígeno y citoquinas; en este mecanismo participan un elemento de respuesta antioxidante (ARE, por su nombre en inglés antioxidant response element), descrito en la Ft H de fibroblastos de ratón y en la Ft H y L de humanos; además, al ARE se unen factores de transcripción particulares, represores y coactivadores que ejercen control en la expresión de la proteína, sin embargo, este mecanismo de regulación y los elementos que lo comandan, no están claramente establecidos ^9,35.

Gracias a experimentos en líneas celulares, se ha descrito la presencia de dos receptores de Ft, uno específico para la Ft H y otro que se une a ambas cadenas de Ft, H y L. Uno de ellos es el receptor Tim-2 presente en células T, B, células de hígado y células de riñón de ratones. Este receptor es específico para la Ft H y hasta el momento no se ha descubierto un análogo de esta proteína en humanos; sin embargo, en humanos el TfR1 puede ligar Ft H y dicha acción del TfR1 puede ser inhibida por la Tf diférrica debido a que comparten el sitio de unión. Otro receptor de Ft es el receptor Scara5, encargado de liberar hierro de las células renales de ratón durante el desarrollo del embrión, este receptor puede ligar Ft L ^36,41.

Igualmente, por modelos animales, se conocen los efectos de la supresión en la expresión de Ft. Una alteración en el IRE del ARNm de la Ft H, del orden autosómico recesivo, resulta en muerte temprana del embrión, y si es autosómico dominante produce un incremento de Ft L en suero y tejidos ⁹. Otros desordenes que se han reportado en esta proteína, son la mutación en la UTR 5’ de la Ft H, que se traduce en un fenotipo con sobrecarga de hierro; y la mutación en la Ft L, la cual se manifiesta como una neuroferritinemia con un fenotipo de sobrecarga de hierro en el cerebro, igualmente se puede presentar como hiperferritinemia y las cataratas son la principal complicación ^42,43.

El receptor 1 de transferrina (TfR1): el TfR1 es un receptor homodimérico transmembranal ¹¹ que contiene 760 aa ⁴⁴; tiene un peso molecular por monómero, de 95 kDa. Ambos monómeros están unidos por dos puentes disulfuro ^45,46. Es considerado el principal captador celular de hierro y se localiza en la membrana del enterocito, del hepatocito, de los eritrocitos, en la placenta, en la médula ósea y en el músculo esquelético ^{9,11,33,47,48}.

La proteína TfR1 presenta un extremo corto N-terminal hacia el citoplasma, un solo dominio transmembranal, con una secuencia particular de aa que permite la endocitosis, y un largo ectodominio C-terminal extracelular, con 640 aa. El ectodominio está dividido en tres regiones estructuralmente diferentes, denominadas dominio proteasa, dominio apical y dominio helicoidal ^9,48. La proteína es tipo II por tener el extremo C terminal en el espacio extracelular y el N terminal en el intracelular. El dominio extracelular, contiene motivos para ligar solo moléculas de Tf, y el intracelular tiene motivos de internalización. Cada receptor puede ligar una molécula de Tf diférrica, por monómero de receptor. La afinidad que la proteína tiene para unir moléculas de Tf diférrica es 10 veces mayor que la que presenta por la Tf monoférrica. En humanos, el receptor además, presenta una O-glicosilación y 3 N-glicosilaciones, estas últimas tienen especial importancia en la captación de moléculas de Tf diférrica y en la endocitosis; igualmente, presenta sitios de palmitoilación que le permite anclarse en la membrana ^11,47,48.

El TfR1 participa en el proceso de reciclaje de la Tf. Al mostrar una alta afinidad por las moléculas de Tf cargadas con hierro, se forma un complejo entre el TfR1 y la Tf diférrica que se internaliza en endosomas rodeados de clatrina; luego, una bomba de protones acidifica el endosoma y al alcanzar un pH de 5.5, el hierro pasa del estado Fe+++ a Fe++ y se disocia del complejo Tf-TfR1. En la membrana del endosoma, el DMT1 expulsa el Fe++ hacia el citosol o a la mitrocondria y el complejo TfR1- apotransferrina retorna a la membrana celular. La Tf es nuevamente secretada a la circulación y el TfR-1 se ancla en la membrana apical. La repetición de este ciclo permite captar más hierro y formar nuevos complejos ^10,14,33.

La regulación del TfR1 la ejerce el sistema IRE/ IRP de acuerdo con la concentración de hierro intracelular, debido a que tiene 5 IREs localizados en la UTR 3’; así, bajo condiciones que incrementen la demanda de hierro en las células, la IRP se une a los IREs del ARNm del TfR1 y estimula la síntesis de la proteína. Esta proteína también se regula a nivel transcripcional, debido a que el promotor contiene un HRE en una secuencia de 100pb, ubicada corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción, lo que permite la unión del factor inducible por hipoxia alfa o beta (HIF-1α o HIF-1β); ante condiciones de hipoxia, se incrementa la expresión del ARNm del TfR1 dos o tres veces, comparado con lo que se expresa en condiciones de normoxia ^9,48.

En la regulación del TfR1 también participa la proteína de la hemocromatosis hereditaria (HFE). Aunque no está claro cómo es el sistema de regulación entre estas proteínas, al parecer el control lo ejerce la formación de un complejo entre la Tf, el TfR1 soluble y la HFE, en el cual la HFE compite y disminuye la afinidad que el TfR1 tiene por la Tf ⁹. Hasta el momento no se conocen mutaciones del TfR1 en humanos, sin embargo en ratones manipulados genéticamente, una deleción en el gen del TfR1 produce anemia, alteraciones en el sistema nervioso central y muerte embrionaria ³⁰.

El receptor 2 de transferrina (TfR2): TfR2 al igual que el TfR1 es un receptor homodimérico transmembranal, encargado de importar hierro a las células; con un extremo corto N-terminal citosólico, un solo dominio transmembranal y un largo ectodominio C-terminal ⁴⁷. El TFR2 se diferencia del TfR1 por tener menos afinidad por la Tf diférrica (25 veces menor), ser codificado por 801 aa y tener un patrón de expresión diferente, pues predomina en hepatocitos y eritrocitos; además, porque no tiene IRE en el ARNm, por lo tanto, no es regulado de manera postrascripcional por la concentración de hierro intracelular ^9,33,47,48. Sin embargo, el TfR2 tiene la capacidad de sensar los cambios de hierro en circulación, interactuar con la holotransferrina y activar la hepcidina; los mecanismos por los cuales se logra la interacción de estas proteínas aún se desconocen ⁴⁸.

En el TfR2 se ha descrito la mutación autosómica recesiva, denominada hemocromatosis hereditaria tipo 3, que se manifiesta clínicamente con una concentración elevada de hierro corporal, incremento en la saturación de Tf y de la Ft sérica ^9,33,47.

Proteína transmembrana HFE: la conforman 348 aa ⁴⁹, con el extremo N terminal extracelular y el C terminal hacia el citosol; en el dominio extracelular, se encuentran los enlaces disulfuro que permiten la unión con microglobulinas ⁵⁰. La HFE tiene afinidad principalmente por la Tf diférrica, sin embargo en ausencia de Tf diférrica puede unir al dominio helicoidal del TfR1 con cada subunidad; no obstante, es posible que en presencia de la Tf diférrica, se forme un complejo ternario junto con la TfR1 o TfR2 y el HFE; esta competencia entre las proteínas por la unión al TfR1, reduce la afinidad del receptor por la Tf saturada, y produce cambios en la absorción de hierro, específicamente en la liberación de hierro en el endosoma, puesto que a pH ácido, por debajo de 6.0, la HFE no conserva la unión al TfR1 ^14,48,50-52. La HFE se sintetiza en el enterocito, donde presenta una localización intracelular y perinuclear; mientras

que en otros lugares de síntesis como el hepatocito, los macrófagos, el músculo esquelético y el sincitiotrofoblasto, la ubicación es membranal ^50,51. Parece que la HFE tiene efectos en la homeostasis de hierro, al modular la expresión de la Hpc en los hepatocitos, como vimos anteriormente esta última proteína es capaz de unirse a la Fpn y ocasionar su internalización en los hepatocitos, macrofágos y enterocitos ⁵¹.

La proteína HFE es codificada por el gen con el mismo nombre, HFE, conocido como el gen de la Hemocromatosis, una de las aberraciones genéticas más comunes, caracterizada por la acumulación de hierro de forma tóxica y letal cuando no se trata adecuadamente; la patología se conoce como hemocromatosis hereditaria tipo 1 ^9,47,48. Los tejidos en los cuales suele acumularse el mineral son el hígado y el corazón, sin embargo, en todos los tejidos puede existir una concentración elevada de hierro. La hemocromatosis es causada por una mutación en el gen HFE, el cual codifica una proteína similar a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad clase I, la mutación es la Cys260Tyr, lo que no permite la formación de enlaces disulfuro,

necesarios para la asociación de la proteína con microglobulinas además de afectarse la migración de la proteína a la membrana celular ^47,48,50,52. La mutación del gen HFE se caracteriza por incrementar la absorción del metal y la saturación de la Tf lo que resulta en una sobrecarga de hierro hepático ⁵¹.

La ferroportina (Fpn): conocida también como SLC40A1 (Solute carrier family 40 member 1), Ireg1 (Iron regulated gene 1), MTP1 (Metal transporter protein-1) ⁵³; es la proteína encargada de exportar el hierro de las células hacia la circulación. Está constituida por 571 aa ^9,54 y tiene un peso molecular de 62 kDa ⁵⁵. Aunque aún no está bien definido el número de dominios transmembrana que posee, el más aceptado es el sugerido por Liu y colaboradores ⁵⁶, que proponen 12 dominios transmembrana; los extremos (N y C terminal) de la proteína se encuentran hacia el citoplasma ^11,54,56,57, sin embargo la localización del C terminal aún es controversial, pues también se sugiere la ubicación extracelular ⁵⁹. La Fpn tiene la propiedad de funcionar como proteína monomérica o dimérica ^11,54,57,59. En los dominios citoplasmáticos de la proteína ocurre la fosforilación y la ubiquitinación, procesos necesarios para la degradación de la proteína por la hepcidina (Hpc) ^54,58-62. En el humano, la Fpn se sintetiza en la placenta, el hígado, el bazo, el corazón, los riñones, en la membrana basolateral del enterocito y en el citosol de las células del sistema reticuloendotelial ^9,28,64.

La expulsión del hierro al plasma que ejerce la Fpn, es una actividad cooperada con proteínas ferroxidasas como la hefestina en el enterocito, la ceruloplasmina en los macrófagos y hepatocitos y el zyklopen en las células del sincitiotrofoblasto en la placenta; todas éstas enzimas son dependientes de cobre. El fin de estas ferroxidasas es que el hierro exportado de las células, pase del estado Fe++ al Fe+++, para ser reconocido por la Tf ^9,28,64,65.

El IRE de la Fpn se ubica en el extremo UTR 5’, lo que permite su regulación por el sistema IRE/ IRP; sin embargo, existe otra forma de regulación de la Fpn la cual se presume que es la que ejerce el principal control sobre la proteína. En este caso, la regulación no es postranscripcional si no que está a cargo de la Hepcidina (Hcp), un péptido de 25 aa sintetizado en el hígado. Al parecer, la Fpn tiene una isoforma que carece de IRE que se ha localizado en el duodeno y en células precursoras de eritrocitos; esta isoforma es la que responde a la regulación por la Hpc ⁶⁵. En ausencia de Hpc, el sistema IRE/IRP puede ser el principal mecanismo regulador de la expresión de la Fpn.

La Fpn se comporta como un receptor de la Hpc; para formar el complejo Fpn-Hpc la Fpn debe ser fosforilada, lo que induce a la internalización, ubiquitinación y posterior degradación de la Fpn, interrumpiendo el flujo de hierro a la circulación ^{57-61,63,66-69}. En cultivos celulares de ratón, se describió que al disminuir las concentraciones plasmáticas de hierro, también disminuye la síntesis de Hpc, hecho que permite el incremento de la Fpn y la salida de hierro a la circulación ^57,60. Además, la transcripción de Fpn también puede ser regulada por el zinc que se une al factor de transcripción sensible a metales (MTF, por su nombre en inglés metal transcription factor) para conjugarse con el elemento de respuesta a metales divalentes (MREs, metal response elements), en el promotor de la Fpn y de esta manera estimular la transcripción de la proteína ^59,70.

Trabajos en modelos animales, describen que una deleción en el gen de la Fpn resulta en la inhabilidad para el eflujo de hierro desde el enterocito y una incapacidad para reciclar el hierro en los macrófagos; además, pueden ocurrir alteraciones en el cierre del tubo neural ⁷⁰. En humanos, las mutaciones en el gen de la Fpn son del orden autosómico dominante, y se manifiestan con un fenotipo de sobrecarga de hierro principalmente en los macrófagos; estas manifestaciones incluso, se han categorizado como un fenotipo de hemocromatosis hereditaria tipo 4 ^9,57,58.

La hepcidina (Hpc): proviene de una pre-proteína de 84 aa que se vuelve funcional al ser dividida en el extremo N-terminal hasta dejar un péptido de 25 aa. Tridimensionalmente, la proteína forma una horquilla que presenta ocho cisteínas unidas por cuatro puentes disulfuro en una configuración tipo “escalera”, donde también se incluye un enlace disulfuro poco usual porque conecta dos cisteínas adyacentes ^40,64,67,71. Se consideraba que su expresión era exclusiva del hígado, sin embargo, se ha descrito su síntesis en baja concentración en el intestino, el estómago, el colon, los pulmones, el corazón y los macrófagos, aunque al parecer esta expresión se activa por inflamación ^40,64,72; bajo esta misma condición estudios recientes han descrito que el adipocito también tiene la capacidad de sintetizar Hpc ⁴⁰. La Hpc madura se secreta al plasma y circula unida a la α2-macroglobulina ^33,40,71. La Hpc se comporta como un regulador negativo porque disminuye la salida de hierro de la célula; como se mencionó anteriormente, el péptido se une a la Fpn provocando la fosforilación, internalización y degradación de esta proteína por el lisosoma ^33,40,70,72; además, es la molécula señal que disminuye la absorción de hierro en el intestino delgado y libera el hierro de reserva de los macrófagos, en respuesta al aumento de las reservas corporales o a la inflamación ^64,69. El aumento en la expresión de este péptido en respuesta al estímulo inflamatorio, es considerado un mecanismo de la inmunidad innata, desencadenado como una estrategia defensiva del hospedero, al impedir el acceso de hierro a los microorganismos infecciosos, puesto que el mineral es esencial para su crecimiento y multiplicación ^33,40.

Su regulación está condicionada por el almacenamiento de hierro. Ante una suficiencia de hierro se estimula su expresión, pero ante una deficiencia hay represión del péptido; igualmente, la tasa de eritropoyesis afecta la expresión comportándose de manera inversa, una tasa de eritropoyesis elevada disminuye la expresión de Hpc ^64,69, en razón a que el eritroblasto bajo el influjo de la eritropoyetina, produce la hormona eritroferrona, un regulador negativo de la producción de Hpc ⁷³. Citoquinas como la IL6 y la IL1β estimulan la expresión, pero la hipoxia y el estrés oxidativo reprimen la expresión del péptido ^64,69.

La regulación transcripcional, aún es motivo de investigación; hasta el momento se conoce la ausencia de IREs que puedan ser los responsables del control en la transcripción de la Hpc, pero se propone que el péptido puede ser regulado por metales divalentes, porque en la región promotora del gen se encuentra un MREs que al conjugarse con metales como el zinc o el hierro y con el MTF, genera un efecto en la expresión de la Hpc; por ejemplo, se estimula la expresión del ARNm de la Hpc cuando el metal que se une es el zinc y se bloquea cuando el metal es el hierro, sin embargo, son necesarios más estudios para aclarar este sistema de regulación ⁷⁴. Además, para que sea exitosa la transcripción del péptido, se requiere de la proteína C/EBP, la cual se conjuga con el elemento promotor CCAAT y promueve la transcripción de la Hpc ³³.

Otras vías implicadas en la transcripción, son las que están relacionadas con la activación de proteínas citoplasmáticas STAT3 Y SMAD; en las STAT3, traductores de señales y activadores de la transcripción, la expresión es inducida por citoquinas proinflamatorias como la IL6; una vez activadas se transfieren al núcleo y se transcribe el gen de la Hpc. Las proteínas SMAD por su parte, se activan ante una concentración suficiente de hierro, forman un complejo con un morfógeno y se transfieren al núcleo para activar la expresión de la Hpc ^71,74,75.

Estudios sugieren que en circulación, la Hpc es regulada por el TfR1, el TfR2, la Tf diférrica y el HFE; el TfR1 tiene la capacidad de secuestrar la HFE y bloquear la actividad de señalización para la expresión de Hpc, pero cuando se disocian estas dos proteínas ocurre expresión del péptido. Por otro lado, la Tf y el HFE se unen al mismo dominio del TfR1, por lo que es posible que la Tf diférrica compita con el HFE por la vinculación al TfR1, sin embargo, el TfR2 puede unir simultáneamente Tf diférrica y el HFE; además, el TfR1 y el TfR2 compiten por unir HFE independientemente de los niveles de Tf diférrica. Cuando el hierro plasmático es alto, la Tf saturada pero no la apotransferrina, desplaza el HFE del TfR1, lo que genera interacción del HFE con el TfR2, complejo que activa la cascada de señalización para la transcripción de la Hpc ³³. Las mutaciones en el gen que codifica la Hpc, dejan como consecuencia

una sobrecarga de hierro a edades tempranas, patología conocida como hemocromatosis juvenil; esta alteración genética, puede presentarse por deficiencia en la síntesis de Hpc o por resistencia de la Fpn a la unión del péptido, lo que produce un incremento en la absorción de hierro y una acumulación progresiva y sistémica del mineral ^33,70,71. También se ha descrito anemia por deficiencia de hierro, refractaria al tratamiento con hierro oral, que se caracteriza por ser congénita, hipocrómica, microcítica y es causada por una sobreproducción de Hpc debido a una mutación en el supresor de esta proteína ⁷¹.

Hemojuvelina: también recibe el nombre de proteína de la hemocromatosis tipo 2 ⁷⁷, posee 426 aa, una secuencia N-terminal transmembrana, un sitio de división proteolítico y un glicosilfosfatidilinositol anclado al extremo C-terminal ⁷⁸; cuando la proteína pierde esta última parte, se genera la forma soluble (sHJV) encontrada en suero o plasma. La HJV se sintetiza principalmente en hígado y en menor cantidad en músculo cardiaco y esquelético. Esta proteína se encarga de la regulación transcripcional positiva de la Hpc y funciona como correceptora de la proteína morfogénica ósea (BPM) formando un complejo, proceso en el que también interviene la vía de señalización SMAD; el complejo se trasloca al núcleo promoviendo así la síntesis del ARNm de la Hpc ⁷⁹. Dos proteínas regulan la HJV, la matriptasa 2 también llamada TMPRSS6, una serina proteasa que actúa como regulador negativo de la HJV ⁸⁰ y la neogenina, que interactúa con la HJV, la BPM y su receptor, modulando positivamente la expresión de la Hpc por medio de un complejo de unión a HVJ ⁸¹. Las mutaciones en esta proteína se manifiestan clínicamente, como la hemocromatosis juvenil caracterizada por hipogonadismo, miocardiopatía y una concentración casi indetectable de Hpc y elevada de sHJV ⁷⁹.

La ceruloplasmina (Cp): es una multicobreoxidasa con 1065 aa ⁸² y un peso molecular de 132 kDa ⁸³; la conforman 6 dominios conectados por 5 horquillas, estabilizadas por puentes disulfuro ⁸⁴, contiene 6 átomos de cobre, 3 de los cuales forman un grupo trinuclear y el resto están dispuestos en dominios por separado; estos iones oxidan tanto al hierro como al cobre; presenta también un átomo de calcio, que parece ser un componente integral de la estructura proteica, capaz de interactuar con las proteínas del plasma; además posee un sitio de unión al sodio, necesario para dar pliegue a la proteína y para la formación de sitios estructurales que limitan el acceso a los iones de cobre ^82,84,85.

La Cp participa en la liberación del Fe++ de los macrófagos y de los hepatocitos, y es la encargada de catalizar la oxidación de Fe++ a Fe+++, con el fin de que sea reconocido por la Tf. La Cp se expresa en el hígado y es secretada al plasma por los hepatocitos, aunque también se encuentra en el cerebro y en los pulmones. El “splicing” alternativo de la Cp determina si la proteína va a ser secretada o anclada a la membrana celular; la isoforma anclada, se caracteriza por remplazar 5 aa en el extremo C terminal lo que permite unirse a un glicosilfosfatidilinositol, forma como se encuentra la proteína principalmente en el sistema nervioso central y en los riñones ^9,28,84. La Cp hace parte de la homeostasis del hierro, porque su actividad oxidasa permite la adecuada función de la Fpn, razón por la cual se encuentran colocalizadas; además de su actividad ferroxidasa, la Cp evita la internalización y degradación de la proteína exportadora de hierro ^83,84.

Se considera una proteína de fase aguda que también cumple una función antioxidante por convertir Fe++ a Fe+++ y de esa manera, disminuir el potencial de formación de especies reactivas del oxígeno. La deficiencia de la proteína en humanos, se denomina aceruloplasminemia y conduce a una degeneración tardía de la retina y de los ganglios basales, por la acumulación patológica de hierro en estos tejidos al igual que en el hígado, bazo, páncreas y células del cerebro ^9,28,85,87.

La hefestina (Hph), por su nombre en inglés hephaestin: es una proteína transmembranal con un solo dominio; homóloga de la Cp, la conforman 1158 aa ^87-88, conserva los átomos de cobre y los enlaces disulfuro de la Cp. Se expresa principalmente, en las microvellosidades del enterocito y se colocaliza con la Fpn en la membrana basolateral y de manera intracelular, en un sitio supranuclear de la célula absortiva del intestino, pero en cantidades inapreciables en las células de la cripta intestinal; estos hechos son consistentes con la función del transporte de hierro de la proteína, en el enterocito diferenciado; sin embargo, pequeñas cantidades de la proteína también se encuentran en el bazo, pulmón, placenta y cerebro ^52,64,88-90.

La Hph facilita el egreso del hierro de los enterocitos mediante la oxidación, preparando el átomo de hierro para que se una con mayor afinidad a la Tf ^9,28,89,92. Hasta el momento, no son claros los mecanismos de regulación de esta proteína. A diferencia de la mutación en la expresión de Cp, que conduce a sobrecarga de hierro, una mutación en la expresión de la proteína homologa, la Hph, produce anemia, conocida comúnmente como anemia ligada al sexo, en ratones, alteración que se manifiesta como una anemia microcítica e hipocrómica ^14,70.

Zyklopen: proteína recientemente descrita, también conocida como la isoforma b de la hefestina. Tiene actividad ferroxidasa, es dependiente de cobre y homologa a la Cp y la Hph. La conforman 891 aa ⁹³, presenta un sitio de unión de alta afinidad para el hierro y al igual que la Hph, tiene un segmento transmembrana cerca de la región C terminal; similar a la CP, la proteína zyklopen tiene 6 dominios organizados en un arreglo triangular. La expresión se ha descrito en placenta, en las células del sincitiotrofoblasto, participando en la oxidación del hierro ferroso a hierro férrico en el transporte materno fetal del mineral ^66,87. Resultados de inmunohistoquímica en tejidos de ratón han identificado esta proteína en la retina, los testículos, el riñón y el cerebro, pero no en el hígado ni en el enterocito ⁹⁴. Hasta el momento, se desconoce el mecanismo de regulación de la proteína.

FLVCR1: es la proteína relacionada con el receptor del subgrupo C del virus de la leucemia felina (feline leukemia virus subgroup C receptor-related protein), tiene 555 aa ⁹⁵, 12 dominios transmembrana y extremos N y C terminal intracelulares ²⁰. Esta proteína presenta dos isoformas, la primera es la FLVCR1a, se expresa en membrana y es esencial para prevenir hemorragias y edemas ⁹⁵; en tanto que la segunda isoforma, FLVCR1b, se expresa en la mitocondria ⁹⁶, y es la encargada de regular la eritropoyesis controlando el eflujo de hierro en la mitocondria ⁹⁵. Los tejidos en los que se sintetiza son el intestino, el hígado, el riñón, el cerebro y la medula ósea ²⁰.

Ambas isoformas de este receptor, son importantes en el control del movimiento extracelular de hemo principalmente como exportadores de superficie celular de este compuesto, por lo cual son esenciales en la eritropoyesis y la homeóstasis del hierro sistémico. La FLVCR1a es importante para la formación esquelética y la integridad vascular y la FLVCR1b evita la acumulación de hemo durante la eritropoyesis fetal. El hemo es fundamental para diferentes procesos celulares pero su exceso es tóxico para la célula, causa estrés oxidativo y daño a membranas, por lo tanto, la expresión y funcionalidad de estas proteínas es esencial para su homeostasis ⁹⁷.

FLVCR1 es un miembro de la familia SLC49A1 y en cuanto a su regulación transcripcional, se han identificado motivos de unión al gen de un represor regulado por hemo, BACH1, sin embargo debido a importantes diferencias entre el contenido de ARNm y la proteína como tal en tejidos y líneas celulares, se afirma que FLVCR1 tiene regulación postraduccional ²⁰.

En pacientes con un raro trastorno neurodegenerativo consistente en ataxia de la columna y retinitis pigmentosa, se han observado mutaciones de SLC49A1 ²⁰.

Existe una variante de la proteína FLVCR, denominada FLVCR2, la cual también recibe el nombre de CCT o transportador de quelato de calcio, con 526 aa ⁹⁸, 12 dominios transmembrana y terminaciones N y C terminal intracelulares pero con motivos de unión diferentes a los de la FLVCR1; se sintetiza en hígado, riñón, cerebro, pulmones, hígado fetal, médula ósea y placenta. La proteína FLVCR2 es un transportador de calcio, pero se ha postulado como un posible importador extracelular de hierro hemo; al respecto se empiezan a hacer estudios para entender mejor su función y regulación en el metabolismo el hierro. La mutación en esta proteína se manifiesta como síndrome de Fowler, que consisten en una vasculopatía cerebral proliferativa letal, autosómica recesiva que se traduce en hidranencefalia con hidrocefalia (ausencia de los hemisferios cerebrales y aumento de líquido cefalorraquídeo en cerebro) ²⁰.

ZIP8/14: son dos proteínas de la familia transportadora de metales SLC39, con características estructurales de transportadores de zinc. El ZIP8 es también conocido como el LZT-Hs6, tiene 460 aa ⁹⁹ y se expresa en la membrana celular de los hepatocitos, en células del riñón, los pulmones y los testículos ¹⁸; en tanto el ZIP14 también se denomina FAD-123, la constituyen 489 aa ¹⁰⁰, y se expresa principalmente en enterocito, hepatocitos, células del páncreas y corazón ^18,101. Ambas proteínas ZIP tienen 8 dominios transmembrana con los extremos N y C terminal extracelulares, en los dominios 4 y 5 presentan una histidina de unión a metales; sin embargo el ZIP14 muestra entre los dominios 3 y 4 en citoplasma, un bucle rico en histidina, importante para la degradación y ubiquitinación de la proteína ¹⁰¹.

Además de su bien conocida función como transportadores transmembrana de zinc, recientes estudios han evidenciado que estas proteínas de la familia ZIP, median la captación de hierro no unido a la transferrina (NTBI), por transporte a través de la membrana celular. Tanto ZIP8 como ZIP14 muestran máxima eficiencia en esta función a un pH por encima de 7, cercano al fisiológico, a diferencia del DMT1 que es más eficiente a pH de 5.5. Un reciente estudio en neuronas de rata demostró que ZIP8 es el principal transportador de NTBI mientras que el DMT1, es responsable de transportar el hierro unido a la transferrina desde el endosoma al citoplasma ¹⁰².

En contraste con otros genes de transporte de hierro como el TfR1 y el DMT1, cuya expresión se regula por cambios en la estabilidad de sus ARNm en respuesta al hierro celular, la expresión de ZIP8/14 no es afectada por el hierro; sin embargo, los niveles de proteínas ZIP correlacionan positivamente con el estado de hierro de tal forma que cuando existe sobrecarga del mineral aumentan las proteínas ZIP8/14, mientras que la deficiencia de hierro disminuye la cantidad de proteína ¹⁰².

Hasta el momento las investigaciones en ratones silenciados en el gen de ZIP8, permiten establecer que la falta de esta proteína causa alteraciones en la hematopoyesis, la organogénesis del bazo, el hígado, el riñón y el pulmón y se asocia con mortalidad perinatal; además, estos ratones muestran anemia grave y tienen concentraciones significativamente más bajas de hierro y zinc. Por el contrario, los ratones silenciados para el gen de ZIP14 son viables y tienen reservas de hierro adecuadas, sin embargo, presentan enanismo propio de una alteración profunda en el crecimiento óseo; en este caso se encontró que la alteración en el metabolismo del zinc más que del hierro, fue la causa principal del enanismo lo que indica la importancia de ZIP14 para el transporte de zinc más que de hierro, en el crecimiento normal ¹⁰².