LA Leishmania spp. COMO ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA LeishmaniaSIS, UN ARTÍCULO DE REVISIÓN

Leishmania spp. AS A DIAGNOSTIC STRATEGY AND AS A TREATMENT OF LeishmaniaSIS; AN ARTICLE OF REVISION.

A Leishmania spp. COMO ESTRATÉGIA DE DIAGNÓSTICO E TRATAMIENTO DA LeishmaniaSIS, UM ARTIGO DE REVISÃO

* Docente Biociencias Fundación Universitaria del Área Andina
** Docente de Microbiología y Farmacología Ocular. Fundación Universitaria del Área Andina
*** Docente de Biociencias Fundación Universitaria del Área Andina

Introducción: Algunas enfermedades emergentes y reemergentes han venido en aumento de manera casi impredecible, en cuanto al sitio de origen. Tal es el caso de la enfermedad de Chagas, malaria, dengue, fiebre amarilla, rabia, Leishmaniasis, debido entre otros a factores de movilidad poblacional, demográficos, sociales y económicos que han llevado a que los microorganismos generen adaptaciones al medio cambiante, dificultando su diagnóstico y tratamiento por métodos convencionales.

Métodos: Se realizó una búsqueda exhaustiva en las bases de datos relacionadas con genómica y proteómica como el NCBI (National Center for Biotechnology Information), auspiciado por la U.S National Library of Medicine y el National Institute of Health, donde se cuenta con acceso a PubMed

Resultados: En la actualidad se han venido aplicando técnicas de marcadores moleculares, PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) que complementan las pruebas bioquímicas y microbiológicas empleadas comúnmente en el diagnóstico. Conociendo la expresión genómica de estos parásitos, se podrán diseñar métodos nuevos más efectivos contra cepas resistentes a los fármacos disponibles en la actualidad y de prevención temprana.

Conclusiones: En este artículo se presenta una revisión bibliográfica, donde la información clínica del paciente es determinante para el diagnóstico, el cual puede ser confirmado con técnicas moleculares desarrolladas en tiempo real, para aportar al conocimiento molecular de la Leishmania spp, como estrategia de diagnóstico y tratamiento de esta patología.

Introduction: Some emerging and reemerging infirmities have been increasing in an almost unpredictable manner as far as site of origin. Such is the case with such diseases as Chagas, malaria, dengue, yellow fever, rabies, and Leishmaniasis. Various demographic, social, and economic factors, as well as population mobility have allowed microorganisms to generate adaptations to changing environments and thus make diagnosis and treatment by conventional methods more difficult.

Methodology: An exhaustive search was undertaken in the data bases related to genome and protein sequence information found at the NCBI (National Center for Biotechnology Information), part of the United States National Library of Medicine and the National Institutes of Health, all with direct access to PubMed.

Results: Today techniques using molecular markers, PCR (Polymerase Chain Reaction), are being used to complement the biochemical and microbiological tests commonly used in diagnoses. Understanding the genome of parasites allows researchers to design new more effective methods against strains resistant to current drugs and to enable early prevention.

Conclusions: This article presents a bibliographical revision where the clinical information of the patient is a major determinant in a diagnosis which can be confirmed through molecular techniques developed in real time to contribute to molecular knowledge of Leishmania spp. as a diagnostic strategy and treatment of this pathology.

Algumas enfermidades emergentes e reemergentes têm aumentado de maneira quase indecifrável, quanto ao lugar de origem. Tais são os casos do Mal de Chagas, malária, dengue, febre amarela, raiva e leishmaniose, devido entre outros, a fatores de mobilidade populacional, demográficos, sociais e econômicos que levam microrganismos a gerarem adaptações ao meio mutante, dificultando seu diagnóstico e tratamento por métodos convencionais.

Métodos Realizou-se uma busca exaustiva nas bases de dados relacionadas com genômica e proteômica, como o NCBI (National Center for Biotechnology Information), auspiciada pela U.S National Library of Medicine e o National Institute of Health, onde se conta com aceso a PubMed.

Resultados Na atualidade aplicam-se técnicas de marcadores moleculares, PCR (Reação em cadeia da polimerasa) que complementam as provas bioquímicas e microbiológicas empregadas comumente no diagnóstico. Conhecendo a expressão genômica destes parasitas, se poderão desenhar métodos novos mais efetivos contra cepas resistentes aos fármacos disponíveis na atualidade e de prevenção rápida.

Conclusões Neste artigo se apresenta uma revisão bibliográfica, onde a informação clínica do paciente é determinante para o diagnóstico, o qual pode ser confirmado com técnicas moleculares desenvolvidas em tempo real, para contribuir ao conhecimento molecular da Leishmania spp, como estratégia de diagnóstico e tratamento desta patologia.

El diagnóstico de la Leishmaniasis se basa en una buena anamnesis y hallazgos clínicos, confirmándose con pruebas microbiológicas que comprenden: aislamiento e identificación del parásito, examen directo, estudio histopatológico de una muestra tomada por biopsia, las cuales sólo reportan el género, pero no arrojan datos sobre las especies ni la multiresistecia a los fármacos. Las pruebas moleculares, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y la identificación de segmentos específicos de ADN, DNA mitocondrial, tienen gran valor como herramienta para el diagnóstico rápido y eficiente de enfermedades infecciosas de las diferentes cepas de Leishmania spp. proporcionando la selección del tratamiento adecuado. Esta alternativa en la tecnología diagnóstica es definitiva porque se reporta una reaparición de enfermedades como la Enfermedad de Chagas, Malaria, Dengue, Leishmaniasis, Fiebre Amarilla, Rabia, planteando un serio desafío para su control¹.

Con relación a la Leishmaniasis, el número de casos reportados en Colombia durante 2005 fue cuatro veces mayor que el reportado en el 2001 y han surgido focos de transmisión en lugares que no reportaban casos en el pasado. Aunque la población más afectada siguen siendo hombres jóvenes que se introducen en el ciclo selvático por exposición ocupacional (militares, agricultores, grupos armados ilegales), la enfermedad también gana importancia en el contexto doméstico, y afecta a un número creciente de mujeres y niños. Se especula que estos patrones cambiantes en la dinámica de transmisión son consecuencia de la alteración de ecosistemas, como resultado del desplazamiento de poblaciones en áreas boscosas².

En Risaralda, según el Informe Quincenal Epidemiológico Nacional (IQEN) de la Dirección General de Salud Pública del Ministerio de la Protección Social y de la Subdirección de Vigilancia y Control en Salud Pública del Instituto Nacional de Salud, son 37 los casos reportados a Marzo del 2007 por la Secretaría de salud de Risaralda³.

En las manifestaciones clínicas de Leishmaniasis, la forma cutánea adquiere importancia por ser la de mayor prevalencia. Históricamente el control de la Leishmaniasis Cutánea se ha limitado a la detección pasiva de casos y al tratamiento ambulatorio con antimonio pentavalente, a pesar de que es un medicamento costoso y de administración parenteral (intramuscular), por 20 días².

Aunque la manifestación cutánea de Leishmanisis se reporta en lesiones de piel,^4,5,6,7,8 hay otras lesiones severas que presentan compromiso en el área ocular, principalmente como lesiones en párpado, proptosis mecánica, lagoftalmos y blefaroconjuntivitis; para su diagnóstico se debe observar el tamaño de la lesión, la proximidad al borde palpebral, si hay presencia de triquiasis, opacidad corneal, queratitis, entre otros. Se ha reportado incluso conjuntivitis bulbar eritematosa^{9, 10}.

La investigación en esta patología se enfoca en la interacción huésped-parásito y en los diferentes factores (respuesta inmune, virulencia, resistencia a medicamentos) que determinan distintas manifestaciones de la enfermedad y la falla terapéutica. Hay interés particular por la búsqueda de terapias alternativas como sales de antimonio, más seguras y de sencilla administración, en especial para la población infantil que ha demostrado una baja respuesta terapéutica. Adicionalmente, ante el creciente número de pacientes que no responden al tratamiento con antimoniales, se desarrollan estudios para entender la resistencia del parásito a los medicamentos anti-Leishmania como factor contribuyente en las fallas terapéuticas, al igual que la implementación de métodos de diagnóstico rápidos y efectivos, que por los hallazgos clínicos, una buena anamnesis, exploración física, los cultivos directos, los estudios histológicos, hacen el diagnóstico muy lento, mientras que con el conocimiento molecular de la Leishmaniasis, se tendrá una nueva herramienta como estrategia para el diagnóstico y control de la enfermedad más efectivo en menor tiempo¹¹.

Se realizó una búsqueda en las bases de datos relacionadas con genómica y proteómica como el NCBI (National Center for Biotechnology Information), auspiciado por la U.S National Library of Medicine y el National Institute of Health, donde se cuenta con acceso a PubMed, un servicio que incluye citaciones de MEDLINE y otras revistas científicas dedicadas a las ciencias biomédicas. Igualmente, proporciona información taxonómica de secuencias genéticas y proteicas, como estructura, función y comportamiento de cualquier tipo de biomolécula de interés. Trabaja con un nivel mínimo de redundancia y un alto nivel de integración con otras bases de datos relacionadas.

Se consultaron otras bases de datos especializadas como Hinari, Proquest, Science Direct, para acceder a revistas y artículos de investigación que brindan una visión amplia de la historia científica en el estudio de la Leishmaniasis, sus manifestaciones, tratamiento y diagnóstico. Otros sitios de consulta fueron los reportes de la OMS (Organización Mundial de la Salud).

Los criterios de selección de artículos se fundamentaron en los estudios moleculares para el diagnóstico y tratamiento de la Leishmaniasis; se descartaron las revisiones relacionadas con aspectos morfológicos, ciclos reproductivos, manifestaciones clínicas y distribución geográfica.

Características generales del genoma

La Leishmania posee un genoma con características poco ortodoxas en su organización y expresión, en comparación con la mayoría de los eucariotes13,30. En Leishmania muchos genes se encuentran agrupados en unidades de transcripción policistrónicas y hacen que cada transcrito primario sea un ARNm precursor policistrónico15. Los ARNm individuales son escindidos del precursor por medio de una reacción de trans-empalme, durante la cual una secuencia líder de 39 nucleótidos (miniexón, ME) se une a cada uno de los transcritos en el extremo 5'-, donándoles la estructura cap (residuo 7- metilguanosina) al mismo tiempo que el extremo 3'- de cada mARN es poliadenilado, y generan así los ARNm maduros16,31. Las unidades policistrónicas pueden contener múltiples copias de un gen en tandem, así como también genes relacionados o no relacionados entre sí¹⁵.

El genoma de Leishmania muestra una carencia acentuada de los factores conocidos de iniciación de la transcripción y la expresión génica está regulada casi completamente a nivel postranscripcional, a través del empalme de los ARNm y los mecanismos que involucran el procesamiento diferencial de la región no traducida 3' del ARNm (3'UTR). El genoma de Leishmania contiene secuencias de iniciación de la transcripción divergentes de las conocidas en otros eucariotes y éstas han sido explotadas como herramientas en el diseño de vectores de transfección¹².

Las especies de Leisnhmania causan un espectro de enfermedades humanas en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. En estudios a partir de Leishmania major se han reportado la secuenciación de 36 cromosomas de su genoma haploide que presenta un tamaño de 32.8 megabases y se han predecido 911 genes del RNA, 39 pseudogenes, y 8272 genes codificantes de proteínas, de los cuales al 36% se le atribuye una supuesta función ³².

Genes relacionados con la patogenicidad

La transfección o introducción de ácidos nucleicos al interior del microorganismo, facilita la cuantificación de células de Leishmania y permite realizar ensayos para el desarrollo de la terapia con drogas. El gen bacteriano lacZ (alfa - galactosidasa) permite la detección de parásitos en tejidos de ratón hasta 4 semanas después de la infección por medio de una reacción colorimétrica visualizada bajo el microscopio de luz³³. Por otro lado, existe una correlación lineal entre el número de parásitos recombinantes que expresan el gen reportero luc (luciferasa de la luciérnaga Photynus pyralis) y la actividad luciferasa; por ello, la transfección con luc resulta muy útil para vigilar la progresión de infecciones dentro de macrófagos y tejidos hospederos, y la cuantificación rápida y sensible en pruebas de citotoxicidad de drogas por medio de luminometría^34,35.

Además, la transfección estable en Leishmania permite estudiar algunos aspectos de la interacción del parásito con el sistema inmune. Los parásitos que expresan ovoalbúmina y alfa - galactosidasa fueron capaces de dirigir estas proteínas reporteras hacia el fagolisosoma, donde se procesaron para el reconocimiento por células CD4+, lo cual sugiere que el estudio de las vías procesadoras del complejo mayor de histocompatibilidad clase II utilizando parásitos de Leishmania modificados, podría ser una aproximación valiosa para estudiar aspectos de la interacción parásito-hospedero³⁶.

Mediante experimentos de eliminación de genes se han identificado genes relacionados con la patogenicidad, importantes en el conocimiento del parásito dentro del insecto vector o del hospedero mamífero, pero no para su crecimiento en los medios rutinarios de cultivo³⁷. Por ejemplo, el gen A2 fue esencial para la supervivencia de L. donovani en el macrófago, así como lo fueron la fosfomanomutasa (PMM) para L. mexicana y la proteína de choque térmico HSP100 para L. major^38,39,40.

En la categoría de virulentos entran genes que están involucrados en la virulencia pero no la explican totalmente, cuya eliminación muestra pérdida cuantitativa pero no completa de virulencia y se puede retener la capacidad de producir lesiones aunque a una tasa más lenta que la de los parásitos de tipo silvestre^41,42. Por ejemplo, la eliminación del arreglo de genes de cisteína proteinasa (LmCPb) en L. mexicana redujo la supervivencia intracelular en 80%⁴¹.

En otro estudio se observó que las lesiones inducidas por parásitos mutantes lmcpbse curan acompañadas de respuesta inmune Th1, a diferencia de las inducidas por parásitos de tipo silvestre, lo cual sugiere que las cisteína proteinasas de L. mexicana suprimen la respuesta inmune antiLeishmania⁴³. Además, cuando L. major fue transfectada con un cósmido que expresa múltiples genes de CPB de L. mexicana, estos parásitos indujeron una respuesta IFNg significativamente inferior comparada con L. major silvestre. Estos datos indican que la inhibición de CPB podría probarse como estrategia inmunorreguladora para formas crónicas de Leishmaniasis

En otros ensayos, la eliminación de GP63, la proteína de superficie más abundante en el promastigote, produjo un efecto pequeño en el fenotipo de L. major in vitro (afectó el depósito del complemento) pero no tuvo efecto en las infecciones al insecto, al macrófago o al rató⁴⁴.

De igual manera, la eliminación de los genes que codifican para las proteínas SHERP/HASP (proteína hidrofílica en membrana del retículo endoplásmico y mitocondria/proteína de superficie hidrofílica acilada), abundantes en estadio metacíclico infectivo⁴⁵, y la ausencia de proteínas que intervienen en la síntesis de diferentes glicoconjugados implicados en la virulencia, tuvieron un efecto pequeño en la pérdida de virulencia^46-50.

Acción de fármacos sobre proteínas o genes del parásito

Se ha reportado el uso de diferentes medicamentos para tratar la Leishmaniasis según la situación clínica u organismos (Ver Tabla 1)⁵².

Las diferentes formas clínicas y manifestaciones del parásito, requieren de un tratamiento prolongado para la forma mucosa y visceral (Ver Cuadro 2). Los ajustes de tratamiento por Kilogramo de peso también deben ser tenidos en cuenta para la posología (Ver Cuadro 3). La administración de isotianato de pentamidina requiere de ajustes en la dosificación (Ver Cuadro 4). La Secretaría de Salud del Departamento de Risaralda establece como tratamiento a seguir ante esta parasitosis:5

En Leishmania la acción de los fármacos sobre proteínas o los genes del parásito está asociada a su resistencia a drogas y relacionada con la amplificación génica. Gran parte de los estudios de transfección se han enfocado a aclarar los mecanismos de resistencia a drogas^61-74. El locus H, una región de 40 kb en el ADN genómico, se encuentra amplificado en forma de grandes círculos extracromosómicos, luego de la exposición de las células a varias drogas no relacionadas entre sí⁷⁵. Para identificar los genes que confieren resistencia al arsénico y a los antimoniales, se clonaron fragmentos de la región H de L. major en un vector de expresión y luego se reintrodujeron al parásito en un alto número de copias, confirmando la asociación entre la presencia del gen lmpgp A en los constructos y el nivel de resistencia^55,56.

Las técnicas moleculares brindan un acercamiento al conocimiento del genoma de la Leishmania, técnicas consideradas como herramienta relevante para el diagnóstico y tratamiento, pues permiten selectividad al escoger el fármaco adecuado para cada especie. Ante los fallidos tratamientos por multiresistencia de las cepas, se dilucida la aparición de nuevas especias producto de mutaciones ante procesos de recombinación genética, fruto de la movilidad de las poblaciones. El uso de herramientas y técnicas moleculares, al igual que el análisis de restricción e hibridación molecular con sondas específicas, permite conocer la distribución geográfica de las especies de Leishmania que originan la Leishmaniasis en las diferentes zonas del país. La inmunofarmacología está tomando fuerza para el tratamiento bacteriano; en parasitología se empieza a abordar en la última década, gracias a estos hallazgos de la biología molecular.

Los reportes referentes a pruebas bioquímicas y microbiológicas para la detección de Leishmania resultan numerosos, comparativamente con las pruebas basadas en técnicas moleculares; sin embargo, de manera complementaria éstas podrían ser de primera elección en los Institutos de Salud, donde se requiere capacitación de personal idóneo para la ejecución e interpretación de estas técnicas moleculares, y la asignación de un presupuesto por parte de entidades gubernamentales.

Al Doctor Gustavo Adolfo Vallejo PhD. en Parasitología. Universidade Federal De Minas Gerais, UFMG, Brasil. Docente – Investigador Universidad del Tolima, por la revisión y asesoría sobre el tema. Publica v.6 n.3 Washington Sept. 1999

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