En los últimos años las quinolinas han despertado gran interés debido a que pueden actuar como agentes analgésicos, hipertensores, amebicidas, antibacteriales, antivirales y antitumorales (Musiol et al. 2007). Un derivado de esta molécula son las estirilquinolinas, las cuales en su estructura poseen dos grupos funcionales principales: el grupo quinolina y el grupo estireno (figura 1). La estabilidad de esta molécula permite que sea modificada con algunos grupos sustituyentes (Vieira et al. 2008) que le confieren distintas características fisico químicas, y así cada quinolina puede actuar de una manera diferente de acuerdo a la disposición espacial y las propiedades de los grupos funcionales que sean modificados (Hranjec et al. 2007, kim et al. 2005).

En vista del potencial antiproliferativo que ejercen muchas quinolinas, evaluamos in vitro seis análogos sintéticos de estirilquinolina que aún no tienen reporte de sus efectos como agentes antiproliferativos y anticancerígenos, con el objetivo de observar los efectos citotóxicos de estas moléculas en el modelo celular leucemoide Jurkat.

MATERIALES Y MÉTODOS

Síntesis de estirilquinolinas. A una solución de quinaldina (30 mmol) en 50 ml de anhídrido acético se le adicionaron 40 mmol del aldehído apropiado y la mezcla se sometió a reflujo durante 12 h. Después de dejar enfriar a temperatura ambiente, la solución se neutralizó con NaHCO₃ y se extrajo (2 x 50 ml) con la mezcla hexano: acetato de etilo (1:2); la solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó a presión reducida. El extracto crudo se purificó por cromatografía flash utilizando como eluente hexano: acetato de etilo (9:1), obteniéndose de esta manera las estirilquinolinas (Metil 4-[(E)-2-(quinolin-2il)etenil]benzoato) (JPQ 1), (2-etoxi-4-[(E)2-(quinolin-2-il)etenil]fenil acetato) (JPQ3), (2-{(E)-2-[4-(acetiloxi)-3-etoxifenil]etenil} quinolin-8-il acetato) (JPQ 4), (metil 4-[(E)-2(8-hidroxiquinolin-2-il)etenil]benzoato) (JPq5), (2-[(E)-2-(3,4-dimetoxifenil) etenil] quinolin8-ol) (JSRQ-5), (2-[(E)-2-(2,5-dimetoxifenil) etenil]quinolin-8-ol) (JSRQ-6) (figura 2).

Cultivos celulares. Se trabajó con la línea celular linfoblastoide Jurkat, cultivada en medio RPMI 1640 (SIGMA) suplementado con L-glutamina (1 mM), antibióticos penicilina (100 μg/ml), estreptomicina (100 μg/ml), y SBF al 7%, bajo condiciones de humedad saturada y 5% de CO₂.

Tratamientos. Los compuestos se emplearon a concentraciones de 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 µM. Fueron disueltos en DMSO (1%) y RPMI 1640 (99%). La solución stock y las diluciones fueron almacenadas a 4 °C, como control se usó DMSO (1%).

Ensayo de citotoxicidad. Para determinar el efecto de los compuestos químicos sobre la viabilidad celular, se realizó el ensayo Mtt (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) (Danizot y Lang 1986). En breve, se tomaron células a partir de cultivos en fase exponencial, sembradas en platos de 96 pozos con un total de 1x10⁴ células/pozo en un volumen final de 90 µl de medio RPMI 1640 suplementado con SBF al 10%. Luego de 24 h post-siembra, se agregó el tratamiento a las concentraciones indicadas y evaluados a los tiempos de 24, 48 y 72 h. Después del tratamiento con los compuestos, se agregó el Mtt, y las células fueron incubadas en una atmósfera de 5% de CO₂ y a 37 °C por 4 h. Finalmente, se diluyeron los cristales de formazán con isopropanol ácido y frío, y se procedió a las cuantificaciones en un lector de ELISA (Microplate reader Benchmark de Bio-Rad) a una longitud de onda de 570 nm (Danizot y Lang 1986).

Ensayo de citotoxicidad con fracción S9. Porciones de 1 ml de la fracción microsomal S9 de hígado de rata, que contenían aproximadamente 16 mg/ml de proteína, fueron almacenados a -70 °C. Previo a la adición de cada tratamiento se preparó la siguiente solución de trabajo: 50% PBS, 21% H₂O destilada, 3,2% MgCl₂ (0,25 M), 3,3% kCl (1 M), 2,5% glucosa-6-fosfato, 10% NADP y 10% S9. Se mezclaron 10 µl de solución de trabajo S9 con 10 µl de cada uno de los tratamientos y luego se agregó al respectivo pozo. La evaluación con Mtt se realizó como fue descrito previamente.

Los datos obtenidos de los experimentos fueron analizados estadísticamente mediante el test de t-student(significancia entre medias, p > 0,05).

RESULTADOS

Compuestos aislados. Los seis compuestos evaluados (JPQ-1, JPQ-3, JPQ-4, JPQ-5, JSRQ-5, JSRQ) fueron sintetizados por Juan P. Meneses y obsequiados por el profesor Jairo Sáez quien lidera el laboratorio ''química de Plantas Colombianas'' de la Universidad de Antioquia (Colombia). Son moléculas sintéticas que poseen como estructura fundamental un anillo de quinolina unido a un grupo estireno. Luego de liofilizados, son estables a temperatura ambiente y aislados de la luz. Sus estructuras químicas se detallan a continuación.

Compuesto JPQ-1. (Metil 4-[(E)-2-(quinolin2-il)etenil]benzoato): C₁₉H₁₅NO₂ . M⁺ 289.1 1H NMR (CDCl₃, 400MHz): 3.88 (S, 3H, -OCH3), 7.41 (d, 1H, J=16.3Hz, H-2'), 7.46 (t, 1H, J=8 Hz, H-6), 7.56 (d, 1H, J= 8.6 Hz, H-5), 7.62 (d, J=7.4 Hz, H-7), 7.64 (d, J=16Hz, H-1'), 7.67 (d, J=1.2Hz, H-2'', H-6''), 7.72 (d, J=8.6Hz, H-3), 8.01 (d, J=8.4Hz, H-3'', H-5''). ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz): 51.9 (CH₃), 119.3 (C-3), 126.3 (C-6), 126.9 (C-8), 127.3 (C-4a), 127.4 (C-2'', C-6''), 129.1 (C-1'), 129.6 (C-4''), 129.7 (C-5), 129.9 (C-3'', 5''), 131.1 (C-7), 132.8 (C-4), 136.3 (C-2'), 140.7 (C-1''), 148.1 (C-8a), 155.1 (C-2), 166.5 (C=O).

Compuesto JPQ-3. (2-etoxi-4-[(E)-2-(quinolin2-il)etenil]fenil acetato). C₂₁H₁₉NO₃ . M⁺ 333.38. ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz):1.43 (t, 3H, -CH3), 2.32 (S, 3H, -OCH3), 4.13 (q, 2H, -CH2), 7.06 (d, 1H, -H-5''), 7.18 (dd, 1H, -H-6''), 7.27 (d, 1H, -H-2''), 7.39 (d, J=16 Hz, 1H, -H-2'), 7.51 (t, 1H, -H-6), 7.64 (d, J=16 Hz, 1H, -H-1'), 7.70 (d, J=8 Hz, 1H, -H-3), 7.73 (d, J=8 Hz, 1H, -H7), 7.80 (d, J=8 Hz, 1H, -H-5), 8.12 (d, J=8 Hz, 1H, -H-4), 8.16 (d, J=8 Hz, 1H, -H-8). ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz): 14.7 (CH3), 20.6 (CH3), 64.4 (CH2), 111,5 (C-2''), 118,9 (C-3), 120.4 (C-6''), 122.9 (C-5''), 126.4 (C-6), 127.3 (C-4a), 127.5 (C-5), 128.8 (C-4), 128.8 (C-2'), 130.0 (C-7), 135.3 (C-1'), 136.8 (C-8), 140.6 (C-4''), 150.7 (C-3''), 155.6 (C-2), 168.9 (C=O).

Compuesto JPQ-4. (2-{(E)-2-[4-(acetiloxi)3-etoxifenil]etenil}quinolin-8-il acetato). C₂₃H₂₁NO₅. M⁺ 391.41. ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz):1.43 (t, 3H, -CH3), 2.33 (S, 3H, -OCH3), 4.14 (q, 2H, -CH2), 7.05 (d, 1H, -H5''), 7.16 (dd, 1H, -H-6''), 7.20 (d, 1H, -H-2''), 7.23 (d, J=16 Hz, 1H, -H-2'), 7.26 (d, J=8 Hz, 1H, -H-7), 7.48 (d, J=8 Hz, 1H, -H-3), 7.49 (d, J=8 Hz, 1H, -H-5), 7.61 (t, 1H, -H-6), 7.66 (d, J=16 Hz, 1H, -H-1'), 8.13 (d, J=8 Hz, 1H, -H-4). ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz): 14.7 (CH3), 20.6 (CH3), 21.0 (CH3), 64.4 (CH2), 111,5 (C-2''), 120.0 (C-7), 120.3 (C-3), 121.6 (C-6''), 122.9 (C-5), 125.5 (C-5''), 125.7 (C-6), 128.5 (C-4a), 129.2 (C-1'), 132.0 (C-4), 135.4 (C-1''), 136.3 (C-2'), 141.0 (C-8), 141.0 (C-4''), 147.3 (C-8a), 150.6 (C-3''), 155.7 (C-2), 169.5 (C=O), 169.8 (C=O).

Compuesto JPQ-5. (metil 4-[(E)-2-(8hidroxiquinolin-2-il)etenil]benzoato). C₁₉H₁₅NO₃. M⁺ 305.32. ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz): 3.89 (CH3), 7.1 (d, J=8 Hz, 1H, -H7), 7.27 (d, J=8 Hz, 1H, -H-5), 7.37 (d, J=8 Hz, 1H, -H-6), 7.43 (d, J=16 Hz, 1H, -H-2'), 7.65 (d, J=8 Hz, 1H, -H-3), 7.66 (d, J=8 Hz, 1H, -H-2'', H-6''), 7.72 (d, J= 16Hz, 1H, -H-1'), 8.01 (d, J=8 Hz, 1H, -H-3'', H-5''), 8.11 (d, J=8 Hz, 1H, -H4). ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz): 52.5 (OCH3), 111.1 (C-7), 118.3 (C-5), 120.7 (C-2'', 6''), 127.5 (C-3), 127.9 (C-6), 128.4 (C-4a), 130.0 (C-4''), 134.4 (C-3'', 5''), 131.2 (C-2'), 133.4 (C-1'), 137.1 (C-4), 138.6 (C-8a), 141.6 (C-1''), 153.7 (C-2), 153.8 (C-8), 167.7 (C=O).

Compuesto JSRQ-5. (2-[(E)-2-(3,4dimetoxifenil)etenil]quinolin-8-ol). C₁₉H₁₇NO₃. M⁺ 307.34. ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz): 3.92 (S, 3H, -OCH3), 3.93 (S, 3H, -OCH3), 6.9 (d, 1H, -H5''), 7.15 (d, 1H, -H-7), 7.17 (d, 1H, -H-6''), 7.18 (d, 1H, -H-2''), 7.21 (d, J=16Hz, 1H, -H-2'), 7.27 (d, 1H, -H-5), 7.37 (d, 1H, -H-6), 7.62 (d, 1H, -H-3), 7.66 (d, J=16Hz, 1H, -H-1'), 8.19 (d, 1H, -H-4). ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz): 55.8 (OCH3), 56.0 (OCH3), 109.0 (C-2''), 110.0 (C-7), 111.1 (C-5''), 117.6 (C-5), 120.2 (C-3), 121.1 (C-6''), 126.1 (C2'), 127.0 (C-6), 127.2 (C-4a), 129.3 (C-1''), 134.1 (C-1'), 136.2 (C-4), 137.9 (C-8a), 149.1 (C-4''), 149.8 (C-3''), 151.9 (C-2), 153.8 (C-8).

Compuesto JSRQ-6. (2-[(E )-2-(2,5dimetoxifenil)etenil]quinolin-8-ol). C₁₉H₁₇NO₃ ¹H NMR (CDCl₃, 400MHz): 3.84 (S, 3H, -OCH3), 3.89 (S, 3H, -OCH3), 6.87 (d, 1H, H-4'', H-6''), 7.15 (d, 1H, -H-7), 7.24 (d, 1H, -H-3''), 7.28 (d, 1H, -H-5), 7.35 (d, 1H, -H-2'), 7.37 (d, 1H, -H-6), 7.60 (d, 1H, -H-3), 7.95 (d, 1H, -H-1'), 8.0 (d, 1H, -H-4). ¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz): 55.3 (OCH3), 55.7 (OCH3), 109.9 (C-7), 111.9 (C-6''), 112.3 (C-4''), 115.3 (C-3''), 117.6 (C-5), 120.2 (C-3), 125.9 (C-1''), 128.7 (C-2'), 127.1 (C-6), 127.3 (C-4a), 136.1 (C-1'), 137.9 (C-4), 137.9 (C-8a), 151.9 (C-2), 152.0 (C-5''), 153.6 (C-8), 154.1 (C-2'').

Citotoxicidad. Los resultados obtenidos muestran que ningún compuesto generó efecto citotóxico significativo en las concentraciones y tiempos evaluados (figura 3). El ligero efecto positivo observado con los compuestos JPq1 y JPq3 a la concentración de 0,1 µM y a los tiempos de 24 y 48 h no es considerado citotóxico ya que la significancia estadística es marginal y no evidencia efecto de dosis (p > 0,05). Similares resultados se obtuvieron en presencia de la fracción S9 (figura4).

DISCUSIÓN

Entre los medicamentos antileucémicos efectivos, hay drogas como Mk571, quinina y primaquina cuyo compuesto activo contiene anillos de quinolina (Vezmar y Georges 2000). No obstante, y como en la mayoría de antineoplásicos, algunos generan efectos adversos en la recuperación del paciente (Cortes y kantarjian 1995) y resistencia (kaspers et al 1997). De ahí la necesidad constante de investigar nuevos compuestos. Y una estrategia para empezar dicha búsqueda es realizar tamizaje con compuestos químicos estructuralmente modificados y derivados de moléculas que se usan actualmente en la preparación de agentes antileucémicos y en modelos celulares leucemoides.

Los resultados obtenidos en esta investigación con las nuevas estirilquinolinas sintéticas mencionadas, indican que a las concentraciones ensayadas no se alcanzó un efecto citotóxico considerable (IC₅₀) (p > 0,05) sobre la línea celular Jurkat, salvo en algunas concentraciones que mostraron diferencias estadísticamente significativas pero con relación al control, pero sin alcanzar el IC₅₀ (p > 0,05).

En relación a los compuestos individuales cabe mencionar los siguientes aspectos. Los tratamientos con los compuestos JPq-1 y JPq-3, aunque no alcanzaron los umbrales IC₅₀, mostraron diferencias significativas marginales con respecto al control. Estos dos compuestos, estéricamente tienen libre el grupo amino ya que no hay grupos funcionales sustituyentes en los carbonos adyacentes, lo que podría estar permitiendo interacción de este nitrógeno reactivo con componentes celulares, generando inhibición transitoria de la proliferación celular, aunque no suficiente para ser citotóxica. Por otro lado, los compuestos JPq4, JPq5, JSRq6 y JSRq5 que poseen un sustituyente en los carbonos adyacentes al grupo amino fueron menos activos posiblemente porque este grupo está impedido estéricamente por dicha sustitución. Se sabe que los grupos amino poseen dos electrones que son muy reactivos, pero que al haber impedimento estérico, posiblemente no podrían estar activos (kim et al. 2005).

En cuanto a la molécula de estireno se observan grupos sustituyentes los cuales aparentemente no estarían induciendo efecto citotóxico. Evidencia de lo anterior se puede observar cuando se comparan los compuestos JPq-1 y JPq-3 que poseen grupos sustituyentes similares a aquellos que poseen los compuestos JPq5 y JPq4, y a diferencia de los primeros estos dos últimos no causaron efecto alguno sobre la proliferación celular.

Estudios previos indican que compuestos análogos a quinolinas generan un efecto citotóxico directo cuando son evaluados en diferentes tipos de líneas celulares tales como: k562, Jurkat, H460, SW620 (Hranjec 2007, kim et al. 2005, Volkova et al. 2007). Otras quinolinas son inocuas o requieren activación metabólica adicional por el complejo enzimático citocromo P450 (CyP) para poder generar algún efecto cito/genotóxico (knasmüller et al. 2004, yoshie et al 2002).

Con el fin de establecer si la activación metabólica exógena de nuestras quinolinas es un paso determinante a la hora de generar un efecto citotóxico, se procedió a evaluar los compuestos en presencia de la fracción S9 de hígado de rata. Bajo esta condición experimental, tampoco se generó efecto citotóxico (figura 4). Aunque existen trabajos en los cuales se reporta la inhibición de la proliferación en cultivos celulares en presencia de la fracción S9, al parecer el efecto inhibitorio varía considerablemente dependiendo de la línea celular en la cual se evalúe y el tipo de inductor de la activación microsomal (Lebsanft et al. 1989). Nuestra fracción S9 fue obtenida a través de inducción con fenobarbital, el cual preferentemente induce la expresión de los citocromos CyP2B1, CyP1A2, CyP2CS, CyP2C9 y otros CyPs en menores cantidades. Así, podría ser una explicación alterna si partimos de reportes que indican activación preferencial de las quinolinas por los citocromos CyP2E1 (Reigh et al. 1996), CyP2A6 y CyP3A4 (Hirano et al. 2002). Sin embargo, la fracción S9 no carece de ellos, y se trata de nuevas quinolinas sintetizadas cuya acción biológica recién se empieza a investigar en esta investigación.

En conclusión, los seis análogos y/o los grupos sustituyentes que caracterizan a cada una de las moléculas, no están causando efectos en la bioactividad citotóxica de estas quinolinas en células Jurkat leucemoides. y aunque estas evidencias apuntan a clasificarlas como no promisorias en el contexto de la antiproliferación de células B, deja abierta la posibilidad de realizar ensayos en otras líneas celulares con diferentes perfiles de expresión génica-bioquímica y/o que representen otro modelo de enfermedad (Martirosyan et al. 2004).

AGRADECIMIENTOS

A los Programa Sostenibilidad-CODI y ''Joven Investigador'' CODI de la Universidad de Antioquia por el apoyo económico.

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