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Actualidades Biológicas

Print version ISSN 0304-3584

Actu Biol vol.38 no.105 Medellín July/Dec. 2016

http://dx.doi.org/10.17533/udea.acbi.v37n105a06 

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

doi: 10.17533/udea.acbi.v37n105a06

 

Mutagenicidad y genotoxicidad en fracciones de PM2,5 del aire de Villa del Rosario, Colombia

 

Mutagenicity and genotoxicity in fractions of PM2.5 Air Villa del Rosario, Colombia

 

 

Iván Meléndez-G.1, Greila P. Quintero-S.2, Alfonso Quijano-Parra3

 

1 Profesor, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Grupo de Investigación en Biología Molecular (Biomogen), Universidad de Pamplona. Pamplona (Santander del Norte), Colombia. imgelvez@unipamplona.edu.co

2 Departamento de Química, Facultad de Ciencias Básicas, Grupo de Investigación en Química, Universidad de Pamplona. Pamplona (Santander del Norte), Colombia. greila@unipamplona.edu.co

3 Profesor, Laboratorio de Control de Calidad, Departamento de Química, Facultad de Ciencias Básicas, Grupo de Investigación en Química, Universidad de Pamplona. Pamplona (Santander del Norte), Colombia.alfonsoquijanoparra@unipamplona.edu.co.

 

Recibido: marzo 2015; aceptado: abril 2016 (Received: March 2015; accepted: April 2016).


Resumen

Las partículas atmosféricas constituyen uno de los contaminantes atmosféricos más importantes, debido a que contienen metales e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) que son compuestos con conocida actividad genotóxica, mutagénica y carcinogénica. Las partículas finas con diámetro menor a 2,5 μm (PM2,5) producidas por la combustión de los vehículos diésel están implicadas en efectos sobre la salud humana. El propósito de esta investigación fue determinar la actividad mutagénica y genotóxica de la fracción respirable del PM2,5, presente cerca de la avenida fronteriza de alto flujo vehicular en Villa de Rosario (Norte de Santander), la cual comunica los países de Colombia y Venezuela. El PM2,5 fue evaluado con filtros de cuarzo Pallflex. La actividad mutagénica y genotóxica de los extractos del PM2,5 fue determinada mediante la prueba de Ames y el ensayo cometa. En la prueba de Ames se utilizaron las cepas TA98 y TA100 de Salmonella typhimurium y el daño genotóxico se evaluó en linfocitos de sangre periférica. Los resultados mostraron mutagenicidad y genotoxicidad asociada con la fracción PM2,5 en Villa del Rosario, lo cual representa un riesgo en la aparición de enfermedades como el cáncer en la población expuesta.

Palabras clave: cepas TA98 y TA100, ensayo cometa, PM2,5, Salmonella typhimurium.


Abstract

Atmospheric particles are one of the most important pollutants because they contain metals and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which are compounds with known mutagenic, genotoxic, and carcinogenic activity. Particles with an aerodynamic diameter less than 2,5 μm (PM2.5) are generally referred to as fine particles and are involved in human health effects. The PM2.5 fraction is produced by the combustion of vehicles that run on diesel fuel. The purpose of this research is to determine the mutagenic and genotoxic activity of respirable-fraction PM2.5 particulate material captured near a high traffic flow pathway in Villa de Rosario (Norte de Santander), which connects Colombia and Venezuela. PM2.5 was monitored with a Partisol 2025 Plus computer using quartz filters Pallflex. The mutagenic and genotoxic activity of extracts of PM2.5 was determined using two tests: the Ames and the comet assay. In the Ames test, Salmonella typhimurium strains TA98 and TA100 were used. To determine the genotoxic damage, peripheral blood lymphocytes were used. Mutagenic and genotoxic activity associated with PM2.5 in Villa del Rosario is reported. It is concluded that PM2.5 samples from Villa del Rosario induced mutation in Salmonella typhimurium and DNA damage in human lymphocytes, representing a risk in the occurrence of diseases such as cancer for the exposed population.

Key words: comet assay, PM2.5, Salmonella typhimurium, strainTA98 and TA100.


 

 

INTRODUCCIÓN

Los contaminantes atmosféricos se pueden clasificar en partículas en suspensión como polvos, gases, neblinas, humos; contaminantes gaseosos y olores. Varios estudios han señalado el papel de la contaminación del aire en el cáncer humano (Künzli et al. 2010, Silva et al. 2013), por esa razón el material particulado (PM) es de gran interés en el estudio de la calidad del aire de las ciudades, principalmente por sus efectos sobre la salud humana (Janssen et al. 2013, Raaschou-Nielsen et al. 2013, Shah et al. 2013). Estudios epidemiológicos han mostrado que las partículas en suspensión PM10 y PM2,5 seguido de SO2 y NOx son los principales elementos de la contaminación urbana (Greenwell et al. 2002).

La exposición prolongada a altas concentraciones de PM aumenta el riesgo de cáncer de pulmón, enfermedades respiratorias y arteriosclerosis; mientras que la exposición a corto plazo, causa exacerbación de varias enfermedades respiratorias, incluyendo bronquitis y asma, así como cambios en la variabilidad del ritmo cardíaco (Janssen et al. 2013, Raaschou-Nielsen et al. 2013, Shah et al. 2013). La exposición al PM de las emisiones vehiculares parece ser importante en las enfermedades cardiopulmonares (Nel 2005). Una fuente importante de contaminación del aire en las zonas urbanas es la combustión de las fuentes móviles que utilizan combustibles diésel y gasolina (U.S. EPA 2004), ya que las emisiones de partículas de diesel contribuyen a la formación de los metales e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) (Bostrom et al. 2002). Las fracciones de material particulado respirable (PM10 y PM2,5) tienen la capacidad de penetrar y depositarse en las regiones traqueo-bronquial y alveolar del tracto respiratorio, por lo que son las fracciones más relevantes para la salud (Kaonga y Kagabi 2010, Mehta et al. 2013, Slezakova et al. 2011, Traversi et al. 2009). Los efectos tóxicos de las partículas PM2,5 están implicadas en gran número de afecciones médicas, incluyendo artritis reumatoide, cáncer, cardiopatías y envejecimiento. La identificación de mutágenos en las partículas del escape del diésel y el aire urbano, no sólo confirmó la contribución de HAP a la actividad mutagénica, sino que también condujo al descubrimiento de nitroarenos, compuestos altamente mutagénicos en las partículas del diesel del aire urbano (WHO/IPCS 2003). Uno de estos compuestos, 3-nitrobenzanthrone, es un mutágeno extremadamente potente y carcinógeno en humanos (Enya et al. 1997), así como inductor de tumores en roedores (Arlt 2005).

La mutagenicidad y carcinogenicidad de las partículas suspendidas en el aire se atribuyó inicialmente a los HAP (IARC 1984) y su carcinogenicidad es probablemente mediada por su capacidad de dañar el ADN (Novotna et al. 2007). Es bien conocido que los extractos de PM pueden inducir estrés oxidativo en las células (Li et al. 2008). El efecto del PM en el organismo depende de su composición química, alto contenido de HAP incrementa la genotoxicidad del PM con la formación preferencial de aductos de HAP-ADN (Sevastyanova et al. 2008). La presencia de otros compuestos incluidas las o-quinonas o metales de transición, pueden conducir a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la posterior inducción del estrés oxidativo. La exposición al PM puede conducir a formación de macrófagos alveolares que conducen a la generación de radicales libres y aumento el estrés oxidativo (Topinka et al. 2011). El estrés oxidativo resulta del desequilibrio en el organismo entre los prooxidantes y los antioxidantes, generando daños a nivel del ADN, lípidos y proteínas (Klaunig y Kamendulis 2004).

El objetivo del presente estudio fue determinar la actividad mutagénica y genotóxica del material particulado-fracción respirable PM2,5, presente cerca de una vía de alto flujo vehicular en la ciudad de Villa de Rosario (Norte de Santander), Colombia.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Metodología. Se efectuó la evaluación de la fracción respirable PM2,5 con el equipo Partisol-Plus 5 Modelo 2025, que se ubicó en la entrada de la sede de la Universidad de Pamplona en Villa del Rosario, ya que en este sector hay mayor flujo de vehículos de transporte público, particular y vehículos de carga pesada. Las muestras de PM2,5 se obtuvieron con filtros de Pallflex de micro cuarzo de 47 mm. Las muestras ambientales fueron el resultado de muestreos de 24 horas para un total de 24 m3 de volumen de aire; muestreo efectuado cada tres días, entre los meses de enero a julio de 2013. Se guardaron en bolsas plásticas con cierre hermético y se mantuvieron refrigeradas hasta el día del análisis. La extracción de la materia orgánica presente en los filtros de PM2,5 se realizó por ultrasonido. Los filtros de PM2,5 se depositaron en un vaso de precipitado con 20 ml de hexano, se sometieron a ultrasonido durante 15 minutos a temperatura de 23-24 °C; seguidamente se hicieron repeticiones con el mismo volumen y tiempo hasta completar 200 ml; luego se concentró en un evaporador rotatorio de vacío, marca Heidolph modelo Laborota 400-1, a temperatura de 30 °C a 150 rpm; hasta alcanzar un volumen aproximado de 10 ml, obteniéndose el extracto global (FT), que se transfirió a viales, los cuales se sellaron y se mantuvieron en refrigeración hasta su análisis.

Fraccionamiento del extracto global de la materia orgánica del PM2,5. Para el fraccionamiento del extracto global, se utilizó una columna de silicagel (Yang et al. 2010). La silica tuvo un tratamiento térmico de ocho días a 170 °C y dos días a 110 °C. Después del tratamiento, se acondiciona una columna de vidrio con 10 g de silica. Posteriormente en la columna ya preparada, se agregan 5 ml del extracto global. Para la elución de la columna se agregan 200 ml de diclorometano, obteniéndose la fracción 1 (F1); 200 ml de una mezcla diclorometano-hexano (3:1, v/v) obteniéndose la fracción 2 (F2); y 200 ml de hexano obteniéndose la fracción 3 (F3). Para los análisis mutagénicos y genotóxicos se usaron tres concentraciones no tóxicas: dosis 1 (100 μg, D1); dosis 2 (200 μg, D2) y dosis 3 (500 μg, D3). Para verificar la reproducibilidad de los resultados, se realizaron tres experimentos independientes, cada uno por duplicado.

Detección de la actividad mutagénica. El efecto mutagénico de los extractos del PM2,5 del aire de Villa del Rosario, se determinó por medio de la prueba de Ames, usando el protocolo descrito por (Mortelmans y Zeiger 2000). En esta prueba el indicativo de la mutación está dado por la reversión his- a his+, las revertantes se identifican porque crecen en medio mínimo sin histidina. Se usaron las cepas de Salmonella typhimurium TA98 y TA100. Como control positivo se utilizó 4-nitroquinolina óxido (4-NQO) y como control negativo se usó dimetil sulfóxido (DMSO) al 12%. Para determinar la mutagenicidad se calculó la razón de mutagenicidad (RM), que es la relación de los revertantes inducidos por el tratamiento (RI) con los revertantes espontáneos en el control (RE), así: RM = RI/RE La respuesta positiva se catalogó cuando hubo incremento significativo de revertantes con relación al control negativo.

Detección del daño en el ADN. Para detectar ruptura del ADN se utilizó el ensayo cometa o electroforesis en gel de células individuales, según metodología propuesta por Pandrangi et al. (1995). 200 μl de suspensión de células (5 x 104 células) se incubaron durante 1 h con el extracto de PM a ensayar. Después de la incubación, se extrajeron 10 μl y se mezclaron con 75 ml de agarosa punto de fusión bajo (APFB) al 0,5% (p/v), esta suspensión se pipeteo sobre portaobjetos previamente impregnados con agarosa de punto de fusión normal. Las placas se incuban a 4 °C por seis minutos, para luego agregarle 100 μl de APFB, e incubar nuevamente seis minutos a 4 °C. Luego los portaobjetos se sumergieron en solución de lisis fresca (2,5 mM NaCl, 100 mM Na EDTA, 10 mM Tris, 10% (p/v) DMSO, 1% (p/v) sarcocinato de Na, 1% (v/v) Tritón X-100) a pH 10. Después de la lisis, los portaobjetos son llevados a una cámara de electroforesis horizontal con tampón alcalino (pH 13) durante 30 minutos, luego se corrió la electroforesis a 25 V y 300 mA durante 30 minutos. Los portaobjetos se tiñeron con bromuro de etidio (0,02 μg/μl) y se observaron a 400X en microscopio de fluorescencia. La ocurrencia de daño en el ADN se basó en la longitud de la cola del cometa, inducida por la ruptura del ADN. Se determinó que el daño basal fue de 25 ɥm que es la longitud total producida por otros factores diferentes al tratamiento. Las células usadas fueron linfocitos humanos de sangre periférica, que fueron obtenidas de un voluntario joven (25 años), a saber saludable, no fumador, sin ningún tipo de tratamiento clínico. Se realizaron cuatro experimentos por cada tratamiento y en cada uno se contaron 100 células. Como control positivo se utilizó el peróxido de hidrógeno 25 mM y como control negativo se utilizó DMSO al 12% (p/v). Como las concentraciones ensayadas en la prueba de Ames fueron tóxicas para las células usadas en la determinación de la actividad genotóxica, se seleccionaron dosis subtóxicas de 12,5, 25 y 50 μg, tanto para el extracto global como para cada una de las fracciones.

Análisis estadístico. Se utilizó la prueba de Dunnett para determinar el nivel de significancia entre el tratamiento y el control. Las diferencias de las medias se consideraron significativas con un p < 0,05.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la tabla 1, se muestra la actividad mutagénica inducida por diferentes fracciones de material particulado (FPM) con las cepas TA98 y TA100. Los datos muestran incremento significativo con p < 0,05, en la mutagenicidad para las dosis D2 y D3, en cada una de las fracciones analizadas. La fracción total (FT) y la fracción eluida con diclorometano (F3), presentaron mayor razón de mutagenicidad en la cepa TA98, en la que principalmente se da mutación por pérdida o ganancia de bases. Los resultados observados, se pueden atribuir a agentes mutagénicos presentes en el PM que pueden alterar el marco de lectura u originar sustitución de bases; dichos agentes pueden ser derivados nitro-aromáticos, HPA, metales y agentes cancerígenos amino (Ianistcki et al. 2009, Kawanaka et al. 2008). Gran parte de la actividad mutagénica encontrada en este estudio podría ser debida a dinitropirenos, compuestos que no requieren activación metabólica y lesionan el ADN originando pérdida o ganancia de bases (Kawanaka et al. 2008). Estos resultados son similares a los encontrados en las muestras de PM2,5 del aire de la ciudad de Pamplona (Norte de Santander; Meléndez et al. 2012).

 

El solvente que mostró mayor eficiencia en la elusión de compuestos potencialmente mutagénicos fue el diclorometano (F3D3), comparado con hexano (F1D3) y la mezcla n-hexano/diclorometano (3:1) (v/v) (F2D3).

En la tabla 2, podemos observar los resultados de la genotoxicidad después de analizar 400 núcleos/fracción/dosis. En cada una de ellas se muestra el promedio de los datos y la desviación estándar. Los datos muestran que el daño genotóxico incrementa significativamente (p < 0,05), a medida que aumenta la concentración del PM.

 

Se puede observar que la dosis mayor de la fracción total (FT) y las dosis mayores de las fracciones eluidas con hexano/DCM (F2) y DCM (F3), presentan daño genético alto, reflejado en las longitudes de los cometas con una p < 0,05, los cuales superan los 100 μm. Para todas las muestras analizadas podemos observar incremento en la genotoxicidad a medida que aumenta la dosis con p < 0,05.

El daño causado al material genético por las muestras de aire analizadas, muy posiblemente es inducido por los compuestos químicos presentes en el PM2,5. En estudios recientes se encontró correlación directa entre la genotoxicidad de las partículas respirables PM2,5 determinada como los niveles de aductos en el ADN y la presencia de HPA, especialmente el benzo(a) pireno (BaP) (Topinka et al. 2011). Teniendo en cuenta, que en estas muestras de aire ya se identificaron algunos HAP (Quijano et al. 2015), la respuesta genotóxica encontrada la podemos atribuir a la presencia de compuestos como el BaP. La actividad genotóxica de estos compuestos se da a través de la biotransformación a reactivos intermedios que se enlazan covalentemente al ADN induciendo rupturas en sus cadenas, lo que trae como consecuencia la promoción de alteraciones en el ADN (Zhang et al. 2011). Los resultados de esta investigación sugieren que las muestras de aire provenientes del municipio de Villa del Rosario contienen compuestos químicos que inducen mutagenicidad y genotoxicidad. Teniendo en cuenta los criterios de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, que clasifican al BaP como cancerígeno para los humanos (IARC 1987, US EPA 2012), en la población del municipio de Villa del Rosario pueden aumentar los riesgos para la población urbana por su constante exposición al aire contaminado cada vez con mayores concentraciones de estos elementos carcinogénicos por el incremento del tráfico vehícular.

 

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