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Introducción
Colombia es considerado un país privilegiado por su gran diversidad de ecosistemas y microclimas, lo que permite que su vegetación sea muy variada, rica en especies endémicas y de gran variedad genética. Algunas de dichas especies producen aceites esenciales cuyos principios activos resultan interesantes para la investigación y el desarrollo de productos naturales (Torrenegra, et al., 2017).
Hoy existe la tendencia entre los consumidores a preferir alimentos libres de produc tos sintéticos (pesticidas, insecticidas, fungicidas, y fertilizantes, entre otros) y aditivos químicos (neutralizantes, conservantes, antioxidantes, colorantes y saborizantes), por lo que resulta primordial estudiar la actividad antioxidante de los aceites de plantas nativas para recomendar su potencial uso como aditivos naturales (Granados, et al., 2012).
La manzanilla (Matricaria chamomilla L.) se usa como té y como remedio casero por su amplia gama de actividades farmacológicas, terapéuticas, antiespasmódicas, antivirales y antimicrobianas. Es una de las plantas aromáticas (poleo, tomillo, albahaca, mafafa) de mayor producción en Colombia y se la comercializa frecuentemente como una fuente de aceite para las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica (Bonilla, et al., 2005).
En años recientes se han estudiado los extractos y aceites esenciales desde un punto de vista funcional. Sin embargo, esta funcionalidad está determinada por el método de extrac ción que se emplee, ya que ello influye en la proporción de los compuestos funcionales que tienen. Las técnicas de extracción se clasifican en convencionales o no convencionales: las convencionales requieren el uso de solventes asociados con el empleo de calor y agita ción, así como tiempos prolongados de residencia, en tanto que las técnicas modernas o no convencionales, llamadas verdes o limpias, minimizan o eliminan el uso de solventes orgánicos, mejoran la calidad del extracto, acortan el tiempo de extracción y aumentan el rendimiento (Rodríguez, et al., 2009).
El objetivo de este trabajo fue comparar la composición y la actividad antioxi dante del aceite esencial de manzanilla (Matricaria chamomilla L.) obtenido mediante extracción con fluidos supercríticos, destilación por arrastre con vapor, hidrodestilación, destilación por arrastre con vapor y extracción simultánea con solvente orgánico, y maceración; la composición se determinó por GC-MS y la actividad antioxidante con el método ABTS.
Materiales y métodos
Materia prima
La manzanilla (M. chamomilla L.) se obtuvo como muestra seca (hojas y flores) de la empresa Agrocomercial del Sur S.A.S. de la ciudad de Ipiales- Colombia.
Caracterización del material vegetal
Para caracterizar el material vegetal se hizo un análisis granulométrico y se midió el por centaje de humedad. Se determinó el tamaño promedio de las partículas en una Tamizadora pinzuar (modelo PS-35, serie 1182) empleando un juego de tamices de mallas (10-100) ordenadas de mayor a menor; el porcentaje de humedad se determinó en una balanza gravimétrica Radwag® PMR-50/NH a una temperatura de 103°C.
Obtención de los extractos
Extracción con fluidos supercríticos (SFE). En la extracción se empleó el equipo SFE 500 de Waters® con celda de extracción de 500 mL, una bomba de alta presión, un separador y sistemas de control de presión, de temperatura y de flujo de CO2; se usó dióxido de carbono como disolvente.
Los experimentos se realizaron empleando un rango de presiones de 90 a 210 bar y temperaturas de 35 a 65 °C. Las condiciones de extracción se establecieron teniendo en cuenta algunos estudios sobre la extracción de aceite esencial de manzanilla. Se utilizaron (10 bar y 20°C) como condiciones de separación. Se aplicó un diseño factorial de 32 con 4 puntos centrales (150 bar y 50 °C) de manera aleatoria para determinar la influencia de las condiciones de presión y temperatura supercríticas en el rendimiento (% p/p) y la composición y la actividad antioxidante utilizando una significación de p<0,05.
El rendimiento se calculó mediante la ecuación (1) y se expresó como porcentaje de aceite extraído.
El proceso extractivo se llevó a cabo utilizando una carga de 140 g de manzanilla molida dispuestos en el recipiente de extracción. Se hizo pasar el CO2 a través de un serpentín sumergido en líquido refrigerante (etilenglicol) a una temperatura de 2 °C para evitar su gasificación y mantenerlo líquido. Empleando una bomba de alta presión se bombeó el CO2 en intervalos de 90 a 210 bares; la temperatura dentro del recipiente extractor se elevó de 35 a 65 °C. Una vez alcanzadas las condiciones de operación (presión y temperatura) en el extractor, se inició el proceso de extracción ajustando el flujo de CO2 a 30 g/min durante 150 minutos (el CO2 extrae el aceite de las flores secas de manzanilla). Por último, se despresurizó el equipo, el CO2 en estado gaseoso circuló hasta el escape, el aceite extraído se recogió en el separador, se almacenó en un vial ámbar y se calculó el rendimiento del proceso de extracción en el aceite esencial.
Extracción por destilación por arrastre con vapor (AV). La extracción del aceite esencial por el método de arrastre con vapor se hizo siguiendo la metodología descrita por Arango, et al. (2012): se utilizó vapor saturado a presión atmosférica de 1 psig y densidad del lecho de 95,4 g.L-1, la extracción se hizo con 7,25 kg de manzanilla seca con un tiempo de extracción aproximado de cuatro horas. El rendimiento se calculó a partir de la cantidad de aceite esencial obtenido por unidad másica de materia prima en términos porcentuales. El equipo utilizado fue la unidad de extracción por arrastre con vapor DINOX con capacidad de 80 L.
Extracción por maceración (MC). La maceración se hizo en un balón de vidrio de 2.000 mL en el que se dispusieron 500 g de manzanilla seca y 1.000 mL de etanol puro; el tiempo de extracción fue de 16 días, los extractos se concentraron en un rotaevaporador EYELA N-1100, con una base de agua a 60 °C y posteriormente se almacenaron en refrigeración y protegidos de la luz.
Hidrodestilación (HD). El procedimiento se hizo en un equipo de hidrodestilación con manta calefactora Thermoscientific y condensador tipo clevenger (Walter Velasco, Colombia). Se tomaron 100 g de manzanilla seca y se depositaron en un balón de vidrio de 2.000 mL junto con 1.500 mL de agua, y este se calentó hasta el punto de ebullición usando una malla térmica durante tres horas; posteriormente, se hizo una extracción líquido-líquido del extracto obtenido con diclorometano y se obtuvo una mezcla de aceite esencial y diclorometano, la cual se almacenó en refrigeración y protegida de la luz para su concentración y posterior análisis.
Destilación por arrastre con vapor y extracción simultánea con solvente orgánico (DES). Se pesaron aproximadamente 20 g de manzanilla seca y se agregaron al balón A con agua suficiente para tapar la muestra de material vegetal (140 mL); se agregaron 50 mL de diclorometano al balón B y se inició el calentamiento en ambos balones hasta alcanzar la temperatura de ebullición de cada solvente a lo largo de dos horas; como producto del proceso de condensación se obtuvo una mezcla de aceite esencial y diclorometano. La mezcla se separó, se concentró en un rotaevaporador EYELA N-1100, se envasó en un recipiente ámbar protegido de la incidencia de la luz y se mantuvo en refrigeración.
Medición de la actividad antioxidante del aceite esencial por el método ABTS
La metodología aplicada fue la descrita por Re, et al. (1999), citados por Jiménez & Villarreal (2008). El radical ABTS•+ se generó tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM). La mezcla reaccionante permaneció a temperatura ambiente y en ausencia de luz durante 24 horas. El ABTS•+ preparado se diluyó con metanol hasta obtener un valor de absorbancia de 0,8 + 0,2 a una longitud de onda de 734 nm utilizando un espectrofotómetro Genesys™ UV-VIS 10S (Thermo Scientific, USA).
Se hizo una curva de calibración con distintas concentraciones de trolox (0,5 - 2,5 mmol), para lo cual se tomaron 2 mL de la solución ABTS«+ y se añadieron 20 µL de las distintas concentraciones de trolox para después agitar durante un minuto y medir la absorbancia al cabo de 6 minutos más a 734 nm. Cada muestra se midió por triplicado y se obtuvo la siguiente ecuación: Y = -0,144X + 0,6655 (R2 = 0,9946). Los resultados se expresaron como actividad antioxidante equivalente en trolox (TEAC) en unidades de µmol de trolox por mL de aceite de manzanilla. El potencial antioxidante de la muestra se probó con la adición de 2 mL de la solución del radical ABTS•+ a 20 µL del aceite diluido en una mezcla de isopropanol y etanol de 80:20 y se leyó la absorbancia a 734 nm; la lectura se interpoló en la ecuación de la recta obtenida a partir del trolox. La funcionalidad del método se verificó con un patrón de ácido ascórbico de 1,5 mmol al cual se le aplicó el mismo procedimiento que a las muestras de aceite.
Análisis por cromatografía de gases
El análisis cromatográfico del aceite esencial de M. chamomilla se hizo en los laboratorios especializados de la Universidad de Nariño mediante cromatografía de gases acoplados a espectrometría de masas (GC-MS) utilizando un equipo Shimadzu QP2010S GC-MS y la metodología descrita por Arango, et al. (2012).
Para la determinación de los componentes químicos se utilizó una columna DB-5 de J&W Scientific con 30 m de largo, 0,25 mm de diámetro, espesor de película de 0,25 µm, un flujo de helio de 1mL/min UAP como gas portador, y una temperatura del detector o la interfaz (GC-MS) de 300°C. La temperatura inicial de la columna fue de 40 °C, que luego se incrementó de 5 °C/min a 250 °C con una isoterma de separación durante 15 minutos. La energía de ionización fue de 70 eV.
Se inyectó 1,0 µL del aceite esencial en el GC-MS a una concentración del 10 % disuelto en diclorometano. Los componentes se determinaron comparando sus espectros de masas con los referenciados en las bases de datos Nist y Adams. La cuantificación de los componentes se calculó a partir de las cantidades relativas de áreas.
Diseño experimental y análisis estadístico
Las matrices del diseño de experimentos y el análisis estadístico de los datos se llevó a cabo con ayuda del programa estadístico Statgraphics Centurion XV® (StatPoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, USA). El análisis estadístico de los datos se hizo mediante el análisis de varianza con un nivel de confianza del 95 %, con lo cual se determinó la significación estadística de los factores sobre la variable de respuesta.
Para el análisis estadístico de la composición y de la actividad antioxidante de los aceites esenciales de manzanilla se usó un diseño experimental completamente al azar con cinco tratamientos correspondientes a las técnicas de extracción y tres repeticiones por método: extracción con fluidos supercríticos (SFE), arrastre con vapor (AV), hidrodestilación (HD), destilación y extracción simultanea (DES) y maceración (MC) y cuatro variables de respuesta que correspondieron a tres componentes mayoritarios encontrados en los perfiles cromatográficos: enindicicloeter, β-farmseseno y óxido de bisabolol A, y al porcentaje de actividad antioxidante (µmol de trolox/mL de aceite).
Como referencia para la extracción con fluidos supercríticos se emplearon los valores del punto óptimo (T=65 °C y P=210 bar).
Resultados y discusión
Obtención de los extractos
Los extractos se obtuvieron a partir de manzanilla con una humedad de 4,83 % y un tamaño promedio de partícula de 0,54 mm.
Extracción confluidos supercríticos (SFE)
Los resultados de rendimiento obtenido con CO2-SC bajo condiciones de extracción se muestran en la tabla 1 y la significación estadística de los factores (temperatura y presión) y sus interacciones en el rendimiento se determinaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) (Tabla 2).
Tabla 2 Análisis de varianza para el rendimiento del aceite de manzanilla (Matricaria chamomilla L.) obtenido por SFE
Gl: Grados de libertad; P: Valor-P
El mayor rendimiento obtenido en la extracción con fluidos supercríticos fue de 0,87 % a 210 bar y 65 °C en un tiempo de extracción de 150 minutos; estas condiciones se consideraron como el punto óptimo en este estudio. Rahimi, et al. (2011) obtuvieron un rendimiento de 0,6 % de aceite esencial de manzanilla empleando la tecnología de fluidos supercríticos a una temperatura de 40 °C y una presión de 250 bar, es decir, inferior al obtenido en el presente estudio con condiciones de extracción similares.
En el análisis de varianza (Tabla 2) se pudo observar que únicamente la temperatura (A) influyó significativamente en el rendimiento del aceite de manzanilla extraído (p<0,05), en tanto que la presión (B) y las demás interacciones no tuvieron un efecto significativo en el intervalo de las condiciones estudiadas (Figura 1). La investigación realizada por Kotnik, et al. (2007) demostró que, efectivamente, el rendimiento de la extracción es directamente proporcional a la temperatura.
Extracción por arrastre con vapor
La extracción por arrastre con vapor se ajustó a la metodología descrita por Arango, et al. (2012). El rendimiento del aceite esencial de manzanilla extraído por arrastre con vapor fue de 0,046 % p/p, un valor bajo comparado con el obtenido por Gawde, et al. (2014) y González (2004), quienes utilizaron la misma técnica y obtuvieron rendimientos de 0,31 y 0,34 %, respetivamente.
Análisis del aceite esencial de manzanilla mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)
El análisis por GC-MS permitió la identificación de 26 compuestos (Tabla 3) con base en un porcentaje relativo de área superior al uno por ciento; entre ellos se destacan los dicicloeteres, los sesquiterpenos y los sesquiterpenos oxigenados. Los componentes mayoritarios en el aceite esencial de manzanilla determinados en esta investigación fueron, en su orden, enindicicloeter, β-farneseno y óxido de bisabolol A. El análisis de varianza (ANOVA) de estos componentes mayoritarios se puede observar en la tabla 4; no hubo diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre los métodos de extracción evaluados para estos compuestos.
Tabla 3 Compuestos identificados en el aceite esencial de manzanilla (Matricaria chamomilla L.) por GC-MS
*HD: hidrodestilación; DES: destilación por arrastre con vapor y extracción simultánea con solvente orgánico; AV: extracción por destilación por arrastre con vapor; MC: extracción por maceración; SFE: extracción con fluidos supercríticos. * % A: porcentaje relativo de área; * IRL: índice de retención lineal
Tabla 4 Valor de p en los análisis de varianza para el enindicicloeter, el β-farneseno y el óxido de bisabolol A en el aceite esencial de manzanilla
Gl: Grados de libertad; P: Valor-P
En el aceite extraído por maceración y con fluidos supercríticos se encontró mayoritariamente enindicicloeter (47,6 y 29,6 %, respectivamente) comparados con los otros métodos (Figura 2A). Esto coincide con estudios como los de Formisano, et al. (2015), quienes extrajeron aceite esencial de manzanilla empleando el método de maceración y obtuvieron como componente mayoritario enindicicloeter, en tanto que Rahimi, et al. (2011) obtuvieron como compuesto mayoritario enindicicloeter al extraer aceite esencial de manzanilla por SFE.
Figura 2 Gráficas de medias y 95 % de Tukey HSD para: A. Eni-dicicloeter, B. B-farneseno y C. óxido de bisabolol A presentes en el aceite esencial de manzanilla extraído por AV, DES, HD, MC, SFE
El β-farneseno tuvo un mayor porcentaje relativo de área con los métodos de hidro destilación y arrastre con vapor y fue el componente mayoritario (Figura 2-B), lo que se explica porque ambos métodos emplean principios muy similares. Scalia, et al. (1999) y Tolouee, et al. (2010) extrajeron aceite esencial de manzanilla por arrastre con vapor e hidrodestilación, respectivamente, y encontraron el β-farneseno como uno de sus compuestos mayoritarios; por otra parte, Rahimi, et al. (2011) reportaron un contenido mínimo de β-farneseno con la extracción con fluidos supercríticos. Todos estos valores son similares a los obtenidos en la presente investigación.
En los estudios de Cano (2002), Gawde, et al. (2014) y Scalia, et al. (1999), se reportaron altos contenidos de óxido de bisabolol A en el aceite esencial de manzanilla obtenido por arrastre con vapor, lo que difiere de los valores obtenidos en la presente investigación (Figura 2-C) y se explica por el efecto de diferentes factores ambientales sobre el contenido de compuestos de las plantas medicinales: la intensidad de la luz y el fotoperiodo, que varían de región en región, la época de recolección y la edad de las plantas que afectan la composición del aceite esencial.
Evaluación de la actividad antioxidante
La mayor actividad antioxidante obtenida por el método ABTS se observó en el aceite de manzanilla extraído por arrastre con vapor (27,56 µmol de trolox/mL de aceite) (Tabla 5), el cual, además, era de color azul. Formisano, et al. (2015) aseguran que el color azul en el aceite se debe a la presencia de chamazuleno, un compuesto de elevada actividad antioxidante, ya que inhibe la peroxidación de lípidos. Dicho compuesto no se destacó en este caso, pero podría estar presente con una mayor concentración en el aceite esencial obtenido por arrastre con vapor que en el extraído por los otros métodos.
Tabla 5 Actividad antioxidante del aceite esencial de manzanilla extraído con SFE, AV, HD, MC, y DES analizados por ABTS•+
Hubo diferencias estadísticamente significativas de la actividad antioxidante entre los diferentes métodos de extracción utilizados, lo que se observó en el análisis de varianza (ANOVA), en el cual el valor de p fue ≤ 0,05 (Tabla 6). Se hizo, además, una gráfica de medias y se empleó la diferencia significativa honesta (HSD) de Tukey con un intervalo de confianza del 95 % (Figura 3) para verificar que los métodos eran diferentes entre sí y que con el arrastre con vapor se obtenía la mayor actividad antioxidante.
Tabla 6 Valor de p en el análisis de varianza para la actividad antioxidante del aceite esencial de manzanilla
Gl: Grados de libertad; P: Valor-P
Figura 3 Gráfica de medias y 95 % del Tukey HSD para la actividad antioxidante del aceite esencial de manzanilla extraído por AV, DES, HD, MC, SFE
La actividad antioxidante del aceite esencial de manzanilla fue de: 27,56 µmol de trolox/mL con el arrastre con vapor, de 23,62 con la maceración, de 19,24 con la destila ción y extracción simultánea, de 15,25 con extracción con fluidos supercríticos y de 13,81 con hidrodestilación. Estos valores son mayores que los reportados por Formisano, et al., (2015) y Kolodziejczyk, et al. (2015), quienes obtuvieron 8,45 y 12,00 µmol de trolox/mL de aceite esencial de manzanilla, respectivamente.
Torrenegra, et al. (2017) evaluaron la capacidad antioxidante (ABTS) del aceite esencial de manzanilla extraído por hidrodestilación y obtuvieron 59,07 µg /mL ± 0,33. En este trabajo se obtuvieron 13,80 µmol de trolox/mL por hidrodestilación, diferencia que podría deberse a que Torrenegra, et al. obtuvieron bisabolol (85 % de abundancia relativa) como componente mayoritario, y este es habitual en muchos productos destina dos al cuidado de la piel, puesto que presenta propiedades antiinflamatorias y antiradicalarias (Mckay & Blumberg, 2006).
Al comparar la actividad antioxidante del aceite esencial de manzanilla con la de otros aceites esenciales, la del primero resultó mayor que la de especies como el estragón morado (3,68 µmol de trolox/g de extracto), el anís (5,6 ¡mol de trolox/g de extracto), la albahaca (5,1 µmol de trolox/g de extracto), el estragón (0,00023 µmol de trolox/g de extracto), el hinojo (0,00015 µmol de trolox/g de extracto) (Muñoz, et al., 2009) y el cilantro (0,6585 µmol de trolox/g de extracto) (Ceballos & Giraldo, 2011). Sin embargo, Muñoz, et al. (2007) encontraron que la actividad antioxidante del orégano (2040 µmol de trolox/ g de extracto) y del tomillo (890 µmol de trolox/ g de extracto) eran superiores a las obtenidas en la presente investigación, y Granados, et al. (2015) y Granados, et al. (2012) reportaron valores superiores para el eucalipto (38,96 µmol de trolox/ g de extracto) y la muña (631,72 µmol de trolox/g de extracto).
Conclusiones
Se registraron diferencias estadísticamente significativas en la composición de las muestras de aceite esencial de manzanilla (M. chamomilla L.) dependiendo del método de extracción.
La extracción con fluidos supercríticos (SFE) ofrece considerables ventajas sobre el método tradicional de arrastre con vapor (AV). El aceite esencial de manzanilla se extrajo en menor tiempo utilizando CO2 supercrítico y el rendimiento de extracción fue mayor (0,871 %).
El aceite esencial de M. chamomilla L. obtenido por el método de arrastre con vapor tuvo la mayor actividad antioxidante (27,556 µmol de trolox/mL de aceite), superior a los aceites obtenidos mediante otros métodos de extracción, incluso superior al aceite extraído por SFE, con el cual se obtuvieron, además de aceite, resinas y oleorresinas, extractos que favorecen el rendimiento, pero disminuyen la actividad antioxidante debido a la acción sinérgica de sus compuestos.
El aceite esencial de manzanilla (M. chamomilla L.) exhibe una actividad antioxi dante superior a otras especies aromáticas como el estragón, el estragón morado, el anís, la albahaca, el hinojo y el cilantro.
