Condiciones de cultivo del hongo

La cepa de P. pulmonarius fue suministrada por el Centro Nacional de Investigación de Café - Cenicafé. La semilla de P. pulmonarius se obtuvo a los cinco (5) días de incubación de la cepa en sustrato de maíz (granos) en una caja de Petri (Figura 1). El cultivo se hizo en medio líquido con infusión de papa y sacarosa (200 gramos de papa y 15 g por litro de azúcar de mesa), se ajustó el pH a 5,4 ± 0,2 y se esterilizó a 121 °C y 15 lb de presión durante 15 minutos. Se adicionaron 5 a 10 gramos del inóculo de "semilla" del hongo y se incubaron a 28 °C - 32°C sin iluminación y se controlaron la temperatura, el pH y el tiempo de crecimiento de la biomasa micelial. A los 18 días se observó una cantidad de biomasa húmeda de aproximadamente 9 g en cada ensayo. Este procedimiento de cosecha de biomasa se repitio hasta obtener 685 g de biomasa micelial húmeda, necesaria para la preparación del extracto crudo de micelio de P. pulmonarius (β-D-glucanos).

Figura 1 Etapas del cultivo del hongo Pleurotus pulmonarius. A. Micelio en medio líquido, infusión de papa liofilizada y sacarosa. B. Semilla del hongo Pleurotus pulmonarius a los cinco (5) días de incubación de la cepa en maíz (Zea mays) en granos. C. Bolsas de sustrato con residuos vegetales selladas e inoculadas con semilla del Pleurotus pulmonarius en fase micelial, incubación aislada de la luz a temperatura ambiente. D. seta comestible Pleurotus pulmonarius 

El cultivo en residuos vegetales se hizo en paquetes de 2 kg de mezcla de sustratos: 25 % de residuos vegetales de frutas y hortalizas más 40 % de maíz en tusa más 29,2 % de poda de hojas de árboles más 0,8-1 % de carbonato de calcio, en una proporción de carbono y nitrógeno de 25:1; estos se trituraron y pasteurizaron previamente a 80 °C durante 10 minutos y se inocularon con 100 gramos de semillas del hongo (un 5 % por paquete de sustrato). Posteriormente, la mezcla se empacó en bolsas de polietileno esterilizadas en autoclave a 121 °C y 15 libras de presión durante 15 minutos. Las bolsas inoculadas se aislaron de la luz para la incubación a 28 - 30 °C en la oscuridad y una humedad de 90 a 96 % hasta que el micelio invadió todo el sustrato; después, se pusieron cerca de la luz diurna (ventana, zona tropical) en un balance entre oscuridad y luminosidad de 60 a 500 unidades lux durante 8 a 12 horas diarias hasta el crecimiento máximo de la seta madura (carpóforos) (^{López, 2006}). El tamaño de los cuerpos fructíferos cosechados 60 días después estuvo entre 5 y 10 cm de diámetro (promedio de 7 cm).

La biomasa micelial y los cuerpos fructíferos se desecaron a 60 °C y se molieron en una picadora Moulinex (tamaño de partícula 1 mm). Para la obtención de la muestra se mezclaron 29,4 y 137,6 g (peso seco) de estos, respectivamente, para un total de 167 g. El polvo de hongo molido resultante se guardó protegido de la luz a una temperatura de 80 °C.

Obtención y método de caracterización del extracto crudo de β -D-glucanos

La extracción de polisacáridos de la seta comestible P. pulmonarius se hizo a partir de la modificación de procedimientos de varios autores (^{Bao et al., 2001}; ^{Li X et al., 2012}; ^{Li K et al., 2016}; ^{Choong et al, 2019}).

Extracción de polisacáridos. Se usó una muestra de 1,0 g de polvo molido (peso seco) de la mezcla de micelio y cuerpo fructífero en un proceso de cuatro etapas:

1) La extracción se hizo durante 24 horas con 20 mL de éter de petróleo a 70 °C (3 horas cada vez), baño de agua termorregulado (WNB45, Memmert GmbH) (^{Li K et al., 2016}). Se centrifugó a 4500 rpm por 15 minutos y se disolvió el residuo con agua Millipore (proporción 1:4). Las proteínas se eliminaron añadiendo el reactivo de Sevag (cloroformo + n-butanol (5:1) en una proporción de 2:1) en cuatro ocasiones (^{Li et al., 2012}). Se centrifugó a 4500 rpm durante 15 minutos cada vez, se agregó etanol 95 % (proporción de 1:4) al sobrenadante y el residuo resultante se liofilizó y conservó a - 80 °C.

2) Se pesó 1,0 g del extracto crudo de polisacáridos obtenido en fracción alcalina (NaOH). Se agregaron 20 mL de agua Millipore y se calentó a 95-100 °C por 3 a 4 horas; el calentamiento se repitió seis veces en un lapso de 24 horas. Se centrifugó a 4500 rpm a 4 °C por 15 minutos, se separó el sobrenadante y se almacenó como fracción soluble en agua caliente. El residuo obtenido (^{Liu et al., 2014}; Palacios et al., 2016) se disolvió en 20 mL de NaOH 1M y se calentó a 95-100 °C durante 3 a 4 horas, repitiendo el calentamiento seis veces en un lapso 24 horas; así como se hizo con el agua caliente, se centrifugó a 4500 rpm a 4 °C por 15 minutos y se recolectó el sobrenadante rotulándolo como fracción-NaOH. El residuo se desechó. Se precipitaron los polisacáridos disueltos en el sobrenadante añadiendo etanol 95 % en una proporción de 2:1 v/v. Se centrifugó a 4500 rpm a 4 °C por 15 minutos y el precipitado volvió a disolverse con agua Millipore en una proporción de 1/4, rotulándolo como extracto crudo- fracción NaOH.

3) Para la desproteinización con proteinasa K (20 mg/mL, 100 μL por cada 5 mL de extracto) del extracto crudo de polisacáridos - fracción NaOH después del ajuste a pH 8,0, se incubó con proteinasa K (rango de pH: 4,0-12,5, pH óptimo: 8,0) a 37 °C durante la noche (también se puede incubar a 56 °C por 4 horas). La modificación del método de adición de esta enzima que degrada proteinas (proteasa), se hizo para optimizar la eliminación de proteínas remanentes al usar el reactivo de Sevag (^{Li et al., 2012}) y así aumentar la pureza del polisacárido. Se adicionó después ácido tricloroacético (TCA) al 20 % (p/v) en proporción v/v para precipitar las proteínas residuales (^{Rajalingam et al., 2009}).

4) Para la purificación se agregó NaOH 1 M al sobrenadante, con el fin de neutralizar el ácido tricloroacético (TCA) antes de la precipitación con NaCl 1 % (p/v) y etanol 95 % en proporción de 2:1 de los polisacáridos presentes en el sobrenadante. El precipitado se disolvió en 5 mL de agua Millipore de tipo I y se ajustó a pH neutro antes de ser dializado. En la diálisis se usó un tubo de membrana de diálisis (Spectra/Por™ 3 RC, MerckMillipore) de 0,45 mm y límite de peso molecular de 3500 daltons en agua Millipore de tipo I durante seis horas y hasta las 48 horas, cambiando el agua cada dos horas. El contenido retenido dentro del tubo de diálisis se liofilizó, se pesó y se guardó a - 80 °C. Para su uso, este extracto crudo - fracción NaOH de β-glucanos (denominado así de aquí en adelante) se reconstituyó con 5 mL de agua Millipore y se ajustó a pH neutro; los polisacáridos aislados, identificados y reconocidos provenían de este extracto.

En todas las etapas se hicieron pruebas de identificación y reconocimiento de los compuestos presentes como impurezas, tales como proteínas (usando la reaccion cualitativa de Biuret y el método espectrofotométrico de rojo pirogalol con el kit de Byosistem S.A.) (^{Watanabe et al., 1986}). Asimismo, en la etapa 4 se hicieron pruebas después de la diálisis para identificar y reconocer carbohidratos, monosacáridos y disacáridos reductores (reacción cualitativa de Benedict, GODPAP- Byosistem S.A.) y polisacáridos (pruebas de Molish y Lugol) (^{Iturbe & Sandoval., 2011}). Las pruebas de detección de proteínas, glucosa oxidasa/peroxidasa y la de Benedict fueron negativas, en tanto que la de Molisch fue positiva, indicando la presencia de polisacáridos complejos en el extracto crudo -fracción NaOH dializado.

Cuantificación de azúcares totales. Se utilizó el método de fenol-sulfúrico modificado (Dubois et al., 2016) para la determinación de azúcares en el extracto crudo dializado, obtenido de 1,0 g de hongo molido de P. pulmonarius (mezcla de micelio y cuerpo fructífero). El producto final del liofilizado (peso = 7,1 mg) se disolvió en 5 mL de agua Millipore de tipo I.

La curva de calibración se hizo con D-glucosa (MercK) a distintas concentraciones: 3; 5; 8,5; 12,5; 25 y 50 μg/mL (no se muestra aquí con R2=0,9869). Las absorbancias se realizaron a una longitud de onda de 490 nm en un lector de microplaca (Thermo Scientific™ Multiskan ™ Go) a los 25 min contra blanco de agua Millipore de tipo I. Todos los análisis se hicieron por duplicado. La muestra se preparó tomando 17,6 μL del extracto crudo y completando el volumen con agua Millipore de tipo I hasta los 500 μL. Se agregaron, además, 500 μL de fenol al 5 % (p/v) y 2500 μL de H₂SO₄ concentrado.

Medición de β - glucanos de la seta comestible P. pulmonarius. Para estimar la concentración del β -(1→3) (1→6)-D-glucano en la muestra molida de la mezcla de micelio y cuerpo fructífero, se usó el método enzimático (exo-1,3 β -glucanasa / β -glicosidasa / amiloglicosidasa / glucosaoxidasa / peroxidasa) (K-EBHLG ®, Megazyme International) en un espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific Multiskan™ GO Microplate (^{Satitmanwiwat et al., 2012}). El β -glucano se determinó por la diferencia entre el β -glucano total y el α-glucano (AOAC Method 996.11). El control de β -glucano de levadura (Aspergillus niger, 49 % de pureza) fue suministrado por K-EBHLG®-Megazyme (Ireland). Todas las muestras y el control se analizaron por duplicado.

Demostración de la estructura de triple hélice. En el extracto crudo dializado de P. pulmonarius se evaluó con el método espectrofotométrico del rojo Congo el cambio en el máximo de absorción visible del color (λ: 488 - 516 nm), producto de la formación del complejo β -1,3-D-glucano-rojo Congo (^{Wood, 1980}), para demostrar la conformación de la triple hélice de los β -1,3-D-glucanos en P. pulmonarius (^{Nitschke et al., 2011}).

Los β-glucanos del hongo se aislaron siguiendo la metodología de ^{Sietsma et al. (1977}), ^{Nitschke et al. (2011)} y ^{Semedo et al. (2014)}, lo que se hizo por triplicado a partir de 10 mg de micelio o cuerpo fructífero del hongo molidos y desecados a 60 °C. Se prepararon las siguientes fracciones: fracción KOH, fracción HCl y fracción NaOH. Como patrón se utilizó el β -1,3-D-glucano de levadura con un 80 % de pureza (Megazyme, Ireland).

Determinación de la longitud de onda y la concentración de rojo Congo. En el espectro-fotómetro (Thermo Fisher Scientif Multiskan™ GO Microplate) se hizo un barrido espectral de las longitudes de onda de 300 a 700 nm con las fracciones - NaOH extraídas del micelio y los cuerpos fructíferos utilizando rojo Congo 0,08 %. El control positivo fueron 150 μg/mL de β -1,3-D-glucano con 80 % de pureza (Megazyme, Ireland) y el control negativo, un blanco sin β -glucano. Con una concentración constante de estas soluciones, se determinó en cada una la longitud de onda en la que se presentó el pico máximo de absorbancia.

Ensayo del efecto de la concentración de NaOH en el máximo de absorción del complejo rojo Congo- β -1,3-D-glucano. En un ensayo por duplicado con las fracciones NaOH y KOH extraídas de la mezcla de micelio y cuerpo fructífero, se evaluó la formación del complejo β -1,3-D-glucano con rojo Congo a partir del cambio en el máximo de absorción visible del color en orden creciente de concentración de NaOH (rango: 0 a 2,0 M) (^{Semedo et al., 2014}). Las lecturas de la absorbancia se hicieron con un espectrofotómetro UV/ VIS (Thermo Fisher Scientif Multiskan™ GO Microplate) en la longitud de onda en que presentaron el pico de máxima absorción.

Determinación de la concentración de β -1,3-D- glucano en el extracto-fracci ón NaOH de P. pulmonarius. Definidos los parámetros del método, la concentración del rojo Congo, el tiempo de reacción, la temperatura ambiente y la longitud de onda de máxima absorbancia (^{Semedo et al., 2014}), se determinó la curva de calibración (no se muestra aquí). Para ello, se pesaron 750 μg (0,75 mg) de β -1,3-D-glucano (Megazyme) con 49 % de pureza y se disolvieron en 5,0 mL de NaOH 1,0 M para preparar el estándar de p-1,3-D-glucano de 150 μg/mL. En tubos de ensayo se agregaron 35, 70, 140, 210, 280 y 350 μL de la solución estandar para completar un volumen de 350 μL con agua Millipore de tipo I después de ajustar a pH neutro con HCl y agregar 300 μL de tampón (50 μL de ácido cítrico/didróxido de sodio 0,2 M, pH 7.0, y 20 μg/mL de rojo Congo preparado con el mismo tampón). Las absorbancias del complejo de color resultante se hicieron a 505 nm (^{Nitschke et al., 2011}). Todas las concentraciones de las soluciones estándar y las muestras se prepararon por triplicado.

Preparación de las muestras. Se agregó tampón (ácido cítrico/hidróxido de sodio 0,2 M, pH 7.0) a 22 mL del extracto-fracción NaOH de P. pulmonarius hasta completar un volumen de 525 μL. De esta dilución se extrajeron 350 μL para la reacción de color, empleando 300 μL de tampón (ácido cítrico/NaOH, 0,2 M, pH 7,0) y 50 μL de solución de rojo Congo. Se calculó el resultado según el dato registrado en la curva de calibración.

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). La determinación de la configuración anomérica de los monosacáridos se analizó mediante espectroscopía infrarroja en un interferómetro IRAffinity-1S (Shimadzu). Se analizaron las moliendas de tres fuentes de β-glucanos; estas muestras se maceraron con polvo de KBr de grado espectrofotómetrico y se prensaron en gránulos de 1 mm (rango de frecuencia de 4000400 cm-1).

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de ¹ H y ¹³ C. Se utilizó un espectrómetro Bruker Avance III (9.4 T) de 400 MHz y una sonda de 5 mm. Se analizaron muestras de hongo molido, mezcla de micelio y cuerpo fructífero y extracto crudo - fracción NaOH dializado de P. pulmonarius, y como control se empleó un β-1,3-D-glucano obtenido de levaduras con 80 % de pureza (Megazyme, Ireland). Se disolvieron aproximadamente 25 mg de cada muestra en 600 μL de DMSO-d6 (99,8 %) y sulfóxido de dimetilo-D6 con tetrametilsilano (TMS) 0,03% (Merck). Los análisis se realizaron a 45 °C. Para los espectros de protones se utilizó la secuencia de pulso zg30 y para los del carbono-13, la zgpg30. Con el TMS se ajustó la escala de desplazamiento químico (0,00 δ, ppm).

Eficiencia biológica (EB) del cultivo del hongo P. pulmonarius

Esta se determinó expresando en porcentaje la relación entre el peso fresco de los hongos producidos y el peso del sustrato seco, utilizando la ecuación (1):

La eficiencia biológica de la producción de biomasa de las setas húmedas fue del 60 %, lo que se considera un valor óptimo (^{Romero et al., 2000}; ^{García, 2003}; ^{Fernández, 2004}).

Caracterización estructural de los β-D-glucanos del extracto crudo obtenido

Contenido de polisacáridos totales. El contenido de azúcares totales del extracto crudo de polisacáridos dializado según la técnica de fenol sulfúrico fue de 1.198 mg en el liofilizado (peso=7,1 mg) y de 119,89 mg por cada 100 g de hongo molido (peso seco), expresado como glucosa.

Contenido de β-1,3:1,6-D-glucano en la muestra original. Cabe destacar el contenido de β-1,3-1,6-D-glucano analizado con el método enzimático (exo-1,3-β-glucanasa /β-glicosidasa / amiloglicosidasa / glucosaoxidasa / peroxidasa) de Megazyme, pues las muestras de polvo molido de micelio y cuerpo fructífero del hongo original dieron un porcentaje total del 32,5 % (p/p) en la seta y de 17,10 % (p/p) en el micelio. Estos datos son semejantes a los reportados por otros autores (^{Ruthes et al., 2013}; ^{Xu et al. , 2017}). ^{McCleary & Draga (2016)} encontraron que el peso seco del cuerpo fructífero de los hongos comestibles Pleurotus ostreatus y de P. eringyii fue de de 32,3 % y 37,1 %, respectivamente. ^{Satitmanwiwat et al. (2012)} registraron un 30,5 % de contenido de β-glucanos del polvo de P. sajor-caju y reportaron que en los hongos Ganoderma lucidum, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus bisporus, Flammulina velutipes, Agaricus blazei Murill, P. ostreatus, Phellinus linteus, Gyrophora esculenta, Auricularia auricular, Inonotus obliquus y P. eryngii el contenido de β-glucanos determinados con el kit de Megazyme (Ireland) fluctuó entre el 4,7 y el 46,2 % en peso seco. Por el contrario, ^{Baeva et al. (2019)} encontraron en fracciones extraídas de P. eryngii un contenido de β-glucanos entre 45 y 60 %.

Confirmación de la estructura de triple hélice

Espectro de absorción UV-vis del complejo 1,3- β-glucano en rojo Congo. La figura 2 muestra la región de máxima absorbancia en los espectros de absorción de las mezclas de rojo Congo al 0,08 % con soluciones de β -1,3-1,6-D-glucano, las cuales revelaron un cambio batocrómico en las longitudes de onda de máxima absorción (480 a 505 nm), y un desplazamiento de 25 nm por la interacción específica del p-1,3-1,6-D-glucano de triple hélice ramificada de P. pulmonarius, datos similares a los publicados en otros estudios (^{Nitschke et al., 2011}; ^{Semedo et al., 2014}).

Estudio de la estructura conformacional de triple hélice mediante la transición hélice-espiral en solución de NaOH. La figura 3 muestra la evaluación del efecto de varias concentraciones de NaOH y KOH (rango de 0 a 2 M) en los espectros de absorción de los complejos formados con el rojo Congo y los polisacáridos presentes en el extracto crudo dializado de β -glucanos extraidos del micelio y el cuerpo fructífero de P. pulmonarius.

En las curvas espectrales del complejo rojo Congo- β -1,3-glucanos, se observaron los cambios en los máximos de absorción visibles debidos a las condiciones alcalinas en concentraciones crecientes, que rompieron los enlaces de hidrógeno intramoleculares e intermolecuares y las interacciones hidrofóbicas estabilizadoras de la unión del polisacárido y la molécula del rojo Congo, lo que revela el cambio transicional de la triple hélice a una conformación en espiral.

Se encontró que la absorción máxima disminuyó después de la adición de NaOH 0,5 M y KOH 0,4 M a la reacción de rojo Congo y 1,3- β -glucanos. Estos resultados son comparables a los obtenidos por otros investigadores ( ^{Palacios et al., 2012}; ^{Semedo et al., 2014}). Mediante este método de reacción con el rojo Congo se comprobó que los p-1,3-glucanos triple helicoidales son la forma dominante de los β -glucanos presentes en el micelio y el hongo P. pulmonarius.

Concentración de β -1,3-D-glucano del extracto crudo - fracción NaOH de P. pulmonarius según el método de rojo Congo. La cantidad de β -1,3-D-glucano con triple hélice presente en el extracto crudo - fracción NaOH lograda con este método de extracción y aplicando diálisis para el proceso de purificación, fue de 6,3 μg en el liofilizado (peso=7100 μg) y 6,3 mg/100 g de la mezcla de micelio y cuerpo fructífero (peso seco) del hongo molido. Con este método colorimétrico del rojo Congo, ^{Nitschke et al. (2011)} determinaron la cantidad de β -1,3-D-glucano en diferentes hongos comestibles y reportaron que varíaba de 0,41 a 3,28 g/100 g en micelios y de 1,92 a 12,91 g/100 g en cuerpos fructíferos (peso seco); entre los hongos se hallaba P. pulmonarius, con 0,25 g en la fracción NaOH de un total de 0,41 g/100 g (peso seco). También Semedo et al. (2015) informaron en su estudio una biomasa de 7,44 x 10^-1 ± 4,67 x 10^-2 mg/100 g del contenido de la fracción NaOH extraída de la seta P. ostreatus. No obstante, debe tenerse en cuenta que el contenido de β -1,3-D-glucano puede variar dependiendo del método de extracción utilizado, la forma y los nutrientes empleados en el cultivo y la etapa de crecimiento de la seta durante su recolección. Asimismo, estas propiedades químicas pueden influir en la biodisponibilidad y, por lo tanto, en la actividad biológica (^{Palacios et al., 2012}).

Fuente: Datos propios

Figura 2 Región del espectro de absorción UV-vis del complejo rojo Congo-β-1,3-1,6-D-glucano del hongo P pulmonarius a la longitud de onda de máxima absorción. Efecto batocrómico entre el rojo Congo y las soluciones neutralizadas de β -1,3-1,6-D-glucano de micelio-fracción-NaOH y de cuerpo fructífero - fracción NaOH de la seta comestible Pleurotus pulmonarius *Control negativo: sin β -Glucano; se reemplazó el volumen de la muestra-fracción NaOH por agua Millipore de tipo I más rojo Congo y se completó con NaOH 1M. "Control positivo: estándar de β -1,3-D-glucano, 80 % de pureza, 150 μg/mL (Megazyme, Ireland) en solución de NaOH 1 M con pH neutro  

Figura 3 Demostración de la conformación de la triple hélice de los β -1,3-D-glucanos del hongo Pleurotus pulmonarius con rojo Congo. Acción de la concentración de NaOH y KOH sobre el máximo de absorción del complejo rojo Congo-1,3-β-glucanos. Control negativo: solución de NaOH más rojo Congo sin β -glucano. Control positivo: 1,3- β -glucano extraído de levaduras (Megazyme, Ireland: 80,0 % p/p de pureza; impurezas < 1 % de α-glucano). 

Confirmación de la estructura del β -glucano por transformada de Fourier. Los espectros infrarrojos por FTIR de las fracciones obtenidas se muestran en la figura 4. Se observan los picos 1.662; 1.409; 1.317;1.246; 1.078; 1.043; 929 y 879 cm^-1, característicos de hongos estudiados por otros autores (^{Synytsya et al., 2014}). Además, se reconocen otros compuestos presentes en la muestra como los grupos amida de proteínas en la banda comprendida entre el pico 1.662,64 y 1.246 cm^-1 y los α-D-glucanos en los picos 930; 879; 771 y 532,3 cm^-1 (^{Synytsya et al., 2014}).

En la figura 4A se observa en el espectro de la muestra molida (micelio y cuerpo fructífero) de P. pulmonarius una banda entre los 2250 y los 2375 cm¹, característica de la presencia de los enlaces amida (N-H) de las proteínas (^{Yang et al., 2012}), lo que contrasta con lo observado en la figura 4B, donde esta no aparece debido al proceso de purificación del extracto crudo - fracción NaOH. En la figura 4A también se observan varios picos en la región entre los 700 y los 1200 cm^-1 en los tres espectrogramas de FTIR (hongo molido, avena y levadura): las bandas intensas superpuestas de las vibraciones de estiramiento de CO y CC, entre los 950 y los 1200 cm^-1, corresponden a enlaces betaglicosídicos y la configuración piranoide de los polisacáridos; además, entre los 500 y los 950 cm^-1 se observan otros picos (no señalados aquí) de diferentes grupos funcionales, como el grupo hidroxilo del carbono C1 anomérico de la glucosa (los diasteroisómeros alfa y beta), que confirman la complejidad de la estructura química de los polisacáridos de la levadura, la avena y la seta ( ^{Gutiérrez et al., 1996}; ^{Baeva et al., 2019}).

Figura 4 A. Espectro IR de tres fuentes de β-glucanos: seta molida (micelio más cuerpo fructífero) de P. pulmonarius, avena (Avena sativa) y levadura (Saccharomyces cerevisiae). B. Espectro IR del extracto crudo - fracción NaOH de la seta P. pulmonarius (micelio más cuerpo fructífero) 

En la figura 4B, se observa en el extracto crudo - fracción NaOH de P. pulmonarius (micelio + cuerpo fructífero) un pico débil alrededor de los 890 cm ^-1 asignado a los enlaces anoméricos específicos para β-glucanos, característicos de la estructura de estos polisacáridos (^{Ramírez, 2016}; ^{Zhou et al., 2019}). Según ^{Synytsya et al. (2009)} y ^{Gutiérrez et al. (1996)}, el espectro FTIR muestra varios picos en la región entre los 890 y los 1400 cm-1, correspondientes a enlaces glicosídicos p (1→3), siendo los de 1020, 1149 y 1374 cm-1 producto de residuos de glucosa (1,3)-di-O- sustituida típicos de los β-glucanos.

En las figuras 4A y B, se observa entre los 1630 y los 1660 cm^-1 un pico fuerte, característico del enlace O-glicosídico p (1→4) (^{Amaya & Ardila, 2016}). Los grupos hidroxilos (OH) de los carbohidratos se encuentran a los 3000 a 3500 cm^-1 del enlace β-O-glicosídico (^{Wade, 2011}; ^{Ramírez, 2016}; ^{Du et al., 2017}).

^{Liu et al. (2011)} consideraron que la amplia banda alrededor de los 3.401,32 cm¹ era un estiramiento debido al hidroxilo de los polisacáridos, y que la banda débil a los 2.921,86 cm^-1 mostraba la vibración de estiramiento de C-H. La absorbancia a los 1.642,09 cm^-1 indicaba presencia de H₂O unida. Asímismo, los autores asignaron a los α-glucanos la banda cercana a los 843,11 cm^-1".

Los datos obtenidos en el espectro FTIR de la muestra original de polvo molido de seta y micelio de P. pulmonarius (Figura 4A) son semejantes a los publicados en otros estudios del β-1,3-1,6-D-glucano de hongos (^{Synytsya et al., 2009}); ^{Liu et al., 2011}; ^{Vetvicka et al., 2013}; ^{Semedo et al., 2014}; López et al., 2021).

Análisis de la resonancia magnética nuclear. En la figura 5 se observan los dos espectros RMN ¹H del polisacárido, tanto del control como el del extracto crudo dializado - fracción alcalina de la seta P. pulmonarius, con picos de carbono anomérico a 5,1 y 4,51, característicos de los enlaces a y p, respectivamente.

Figura 5 Resonancia Magnética-RMN¹H (400MHz) del Extracto Crudo de polisacáridos del hongo Pleurotus pulmonarius. A. Extracto crudo de β glucano - fracción NaOH obtenido de P. pulmonarius purificado por diálisis. B. Control de 1,3-β-D- glucano, 80 % de pureza (Megazyme, Ireland). Los desplazamientos químicos se expresan en ppm. 

Según ^{Palacios et al. (2012)}, los picos representativos de carbohidratos correspondían a las señales de protones anoméricos (H1), entre 4,5 y 5,1 ppm de glucósidos, y las H2, H3, H4, H5 y H6 correspondían a 3,01 - 4,36 ppm del anillo glicosídico. Las señales de desplazamiento del carbono anomérico (C1) del glucósido se atribuyeron a las 100 - 104 ppm. Los carbonos C2, C4 y C5 del anillo glicosídico se expresaron entre las 70 y las 80 ppm. Por otro lado, se observa una máxima señal en el carbono C3 a 87 ppm, lo que puede atribuirse a la presencia de residuos con enlaces 1,3 (^{Chenghua et al., 2000}); el C6 se observó entre las 60 y 62 ppm. Así, las relaciones entre protones y carbonos respaldan las asignaciones propuestas de los átomos H1/C1 (4,51/103,1), H2/C2 (3,46/73,03), H3/C3 (3,69/87), H4/C4 (3,01/69,8), H5/C5 (3,01/76,32), que confirman la presencia de la configuración de los residuos de β-D- gucopiranosilo en el polisacárido (^{Ojha et al., 2010}). La señal de desplazamiento de H6/C6 se observó a 3,58/60,87.

Figura 6 Espectro de RMN¹³C de polisacáridos disueltos en sulfóxido de dimetilo-D6 con TMS 0,03 % a 100 MHz y 45 °C de temperatura. A. Hongo P. pulmonarius molido (mezcla de micelio y cuerpo fructífero). B. Extracto crudo de β glucano - fracción alcalina obtenido de P. pulmonarius. C. Control de 1,3-β-D-glucano, 80 % de pureza (Megazyme, Ireland). Los desplazamientos químicos se expresan en ppm. 

Según los resultados de la RMN del extracto crudo dializado - fracción alcalina, el espectro se correlacionó adecuadamente con los espectros conocidos para glucanos de estructura similar (^{Gorin, 1981}; ^{Ruthes et al., 2013}). La cadena β(1→3) glicosídica quedó evidenciada por la aparición de la señal correspondiente al C-anomérico a 103,8 ppm, característica de uniones β, y la señal a 87,9 y 87,2 ppm característica de C-3, O-sustituido (Figura 6). La señal alrededor de las 61 ppm corresponde al C-6 no sustituido tanto en la cadena central como en el extremo no reductor de las ramificaciones, y la señal a 72 ppm corresponde, en cambio, al C-6, O-sustituido, del punto de ramificación. En la muestra de hongo molido (mezcla de micelio y cuerpo fructífero) también se evidencian señales similares de desplazamiento H2/C2, H6/C6 de los residuos de β-D-gucopiranosilo y H6/ C6 (3,01/69,8), correspondiente al enlace α (1→6).