LRBA participa en el tráfico vesicular y reciclaje de receptores.

CTLA-4 (Del inglés Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) es un receptor proteico situado en la membrana celular de los linfocitos T activados. Su función es regular la homeostasis y la tolerancia inmunológica periférica inhibiendo la activación de los linfocitos T, por competición con la molécula coestimuladora CD28, mediante la unión a los ligandos CD80 y CD86, los cuales se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno ¹⁵. Mientras que CD28 reside principalmente en la superficie celular, CTLA-4 se localiza primero en los compartimentos intracelulares como el aparato de Golgi, los endosomas, los gránulos secretores y las vesículas lisosomales. La estimulación del TCR (del inglés, T cell receptor) promueve el tráfico de CTLA-4 desde los compartimentos vesiculares hacia la membrana celular, sin embargo, en la membrana, este receptor es continuamente endocitado dentro de las vesículas cubiertas de clatrina. Una vez endocitadas, algunas moléculas de CTLA-4 son recicladas a la membrana celular, mientras que otras son rápidamente degradadas en los compartimentos lisosomales ^16,17. CTLA-4 contiene una pequeña cola citoplasmática con dos motivos de tirosina en la posición Y₂₀₁VKM y Y₂₁₈FIP. Diversas proteínas intracelulares se unen al motivo Y₂₀₁VKM, incluyendo AP-1 y AP-2 (del inglés clathrin-associated adaptor). AP-2 media la internalización de CTLA-4 desde la superficie celular a los endosomas y los compartimentos lisosomales, mientras que AP-1 regula en el tráfico de CTLA-4 desde el aparato de Golgi a los compartimentos endosomales y lisosomas para su degradación ¹⁷. En un estudio reciente, se demostró que la proteína LRBA es necesaria para el tráfico vesicular de CTLA-4 hacia la membrana plasmática ⁸. Cuando CTLA-4 es requerida en la membrana, LRBA regula el reciclaje de CTLA-4 desde los endosomas a la membrana celular ayudando a mantener los niveles intracelulares de CTLA-4 para su inmediata movilización a la membrana. De esta manera, una deficiencia de LRBA favorece una rápida degradación de CTLA-4 en los compartimentos lisosomales, con su consecuente disminución tanto intracelular como extracelularmente ⁸. Este trabajo también demostró que LRBA interactúa por medio del dominio ConA-like y el dominio PH-BEACH con la cola citoplasmática de CTLA-4, específicamente con el motivo Y₂₀₁VKM. Finalmente, el silenciamiento de AP-1, pero no AP-2 puede rescatar parcialmente la pérdida CTLA-4 en las células deficientes de LRBA. Estos resultados sugieren que LRBA bloquea el tráfico de CTLA-4 a los lisosomas, compitiendo con AP-1 por la unión a este motivo ⁸. Hallazgos recientes indicaron que los linfocitos CD4+ Foxp3+ provenientes de células del bazo de ratones deficientes para LRBA también exhiben una disminución intracelular de CTLA-4 ¹⁸.

Otro estudio que ilustró el papel de LRBA en el tráfico vesicular fue realizado con el receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR, del inglés, epidermal growth factor receptor). Mutantes dominantes negativas para LRBA disminuyeron la expresión y fosforilación de EGFR ¹⁴. El EGFR es un receptor tirosina kinasa el cual se expresa en una gran variedad de tejidos, interactuando no sólo con el EGF sino también con TGF-( (Del inglés, Transforming growth factor-(), y otros ligandos. Esto induce la dimerización y trans-auto-fosforilación del receptor, reclutando proteínas que activan las vías de señalización necesarias para la proliferación, la diferenciación, el crecimiento, la migración e la inhibición de la apoptosis ¹⁹. En los linfocitos, al igual que CTLA-4, su expresión en la superficie celular es regulada por la endocitosis mediada por clatrina, lo cual conduce ya sea a su degradación por vía lisosomal o a su reciclaje a la superficie celular ^20,21. Defectos en el tráfico vesicular de este receptor resultan en una localización aberrante, lo cual potencia la señalización permitiendo el desarrollo de cáncer ²². Aunque no se conoce si LRBA y EGFR interactúan físicamente, se ha comprobado que AP-2 facilita la endocitosis y el tráfico de EGFR por la vía endocítica ³.

Finalmente, en pacientes deficientes de LRBA se demostró una disminución en la apoptosis mediada por el receptor de muerte Fas, cuando se comparó con los individuos sanos ⁶. El receptor Fas promueve la apoptosis por la vía extrínseca, después de la unión al ligando de Fas (FasL). Posterior a la unión Fas/FasL, se da un proceso de internalización del receptor, similar a lo que ocurre con EGFR, el cual es crucial para desencadenar la apoptosis ²⁴. Hasta la fecha, se desconoce si existen alteraciones en la cantidad de receptores Fas en la membrana celular en pacientes con deficiencia en LRBA, pero el incremento de FasL en suero en dichos pacientes podría sugerir que posiblemente la deficiencia de LRBA tenga un efecto en el receptor Fas similar al de CTLA-4, regulando su tráfico ya sea hacia la membrana celular o lisosomas ²⁵.

Estas evidencias nos llevan también a preguntarnos si LRBA estaría implicado en el tráfico vesicular de otros receptores en linfocitos?. En ratones deficientes para LRBA se ha reportaron defectos en la fosforilación de ERK1/2 (del inglés, extracellular signal-regulated kinases) y AKT en células NK (del inglés, natural killer) estimuladas con anticuerpos anti-NKG2D o anti-NKp46, con una disminución significativa en la producción de IFN-gamma después de estos estímulos ²⁶. Aunque en este estudio no se determinaron los niveles de expresión de estos receptores en los ratones deficientes de LRBA, existen algunas evidencias que indican que la exposición a sus ligandos específicos, induce la degradación de NKG2D y DAP10, la molécula adaptadora intracelular de este receptor en los lisosomas ²⁷. Esta regulación parece ser mediada por clatrina ²⁸. No se conoce si LRBA está involucrado en el tráfico intracelular de estos receptores en células NK. De la misma manera, considerando que la deficiencia de LRBA conlleva a defectos en las respuestas de anticuerpos, es importante considerar también, si esta molécula regula la expresión y función de otros receptores cuya expresión es modulada por compartimentos vesiculares, procesos determinantes para la activación del linfocito B ²⁹.

A pesar de los estudios sobre la modulación de algunos receptores celulares mediada por LRBA, es poco lo que se conoce sobre las vías de tráfico intracelular utilizadas por esta molécula para realizar dicha función. Se ha descrito que dicho transporte se realiza mediante el reclutamiento de proteínas en vesículas recubiertas por clatrina, en el cual el receptor es removido a endosomas tempranos y posteriormente degradado por enzimas lisosomales o reciclado a la superficie celular ³⁰. AP-1 se considera necesario para este transporte. La localización de AP-1 en el aparato de Golgi y en endosomas, depende de su unión directa a Arf (del inglés: ADP-ribosylation factor)-1 y específicamente en endosomas de reciclaje, a Arf-6, entre otros complejos proteicos ³¹. Como ya se mencionó, LRBA inhibe la degradación de CTLA-4 en lisosomas por competición con AP-1, demostrando ser necesario para la movilización a estos compartimientos ⁸. Sin embargo, la relación de LRBA con toda la vía endosomal no es clara. El reciclaje de receptores depende además de los compartimientos vesiculares, de proteínas involucradas incluidas las Arf, de enzimas como la fosfolipasa D y de las proteínas Rab. De manera interesante, un estudio realizado en Drosophila, sugiere una posible interacción funcional entre bchs (del inglés blue cheese), un miembro de la familia BEACH, y Rab11 ³². Estos hallazgos sugieren que, así como Rab11, Bchs podría ser un regulador del tráfico de las vesículas.

Por lo tanto, son necesarios estudios que cuantifiquen la expresión de los receptores mencionados en células deficientes de LRBA (silenciadas o provenientes de pacientes). También sería útil el uso de técnicas avanzadas de microscopía, con lo cual se pudiera demostrar la localización de LRBA en otras organelas involucradas en este tipo de tráfico. Además, estudios de co-inmunoprecipitación entre LRBA y las proteínas de tráfico vesicular, el uso de drogas que bloqueen este tráfico o la implementación de dominantes negativos de ARFs, fosfolipasa D o las Rab, podrían ampliar nuestro conocimiento sobre la interacción de LRBA con otras moléculas de tráfico vesicular y así determinar su relación con la expresión en membrana de receptores como EGFR, Fas o los receptores activadores de las células NK, linfocitos B u otros en células inmunes.

LRBA es una molécula implicada en autofagia

La autofagia es un mecanismo de degradación lisosomal por el cual la célula destruye organelas dañadas y microorganismos y ayuda a reciclar macromoléculas. En este proceso se forma una doble membrana de aislamiento o fagóforo cerca al blanco, que luego se elonga, rodeándolo, para posteriormente madurar con la asimilación de una carga citosólica formando el autofagosoma. Para que la maduración sea efectiva, el autofagosoma se debe fusionar con los endosomas tempranos o tardíos formando una estructura llamada anfisoma ^33,34. Por último, el autofagosoma maduro se fusiona con el lisosoma para permitir la degradación de su contenido por las proteasas lisosómicas y enzimas hidrolíticas ³⁵.

Cuando estudiamos los genes homólogos de LRBA, encontramos que varios de ellos están implicados en la autofagia. WDFY3 (del inglés - WD and FYVE zinc finger domain containing protein 3), codifica una proteína que colocaliza con marcadores de autofagosomas ^36,37. Además, su dominio PH-BEACH interacciona con la proteína p62 ³⁴. P62 es una proteína localizada en los sitios de formación de los autofagosomas y se asocia tanto con LC3 (Del inglés, microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) como con proteínas ubiquitinadas ^34,38,39. LC3 es una proteína citosólica que cuando se conjuga con una fosfatidiletanolamina es reclutada a la membrana del autofagosoma favoreciendo el flujo autofágico ³⁴. Por otro lado, defectos en el gen ortólogo de LYST, mauve (mv) en Drosophila, afecta la función de autofagosomas ⁴⁰.

En células B inmortalizadas provenientes de pacientes con deficiencia de LRBA se observó una reducción significativa en el proceso de autofagia en respuesta a la inanición, además hubo un incremento en el área del aparato de Golgi, una acumulación de los autofagosomas y la presencia de centriolos, al compararse con las células provenientes de un individuo sano ². Estos resultados sugieren que el flujo de la autofagia está deteriorado en la deficiencia de LRBA, un hallazgo que fue demostrado por una fusión deficiente del autofagosoma a los lisosomas en linfocitos B inmortalizados de pacientes deficientes de LRBA, sometidos a inanición ². Sin embargo, ¿cuál son las posibles funciones de LRBA en los procesos de autofagia? Considerando que tanto el tráfico de receptores de superficie celular como la autofagia necesitan de vesículas endocíticas, y que LRBA posiblemente se encuentra ubicado en estas vesículas, una posible hipótesis es que LRBA facilite la fusión entre el autofagosoma y el endosoma tardío y, por consiguiente, la formación del anfisoma. Uno de los marcadores de los endosomas tardíos es Rab7 y se ha demostrado en células CHO transfectadas con la mutante dominante negativa de Rab7, T22N, que esta molécula se requiere para la formación de los anfisomas ³³. Otra hipótesis que se podría considerar es que, de la misma manera que con el tráfico vesicular de CTLA-4, también en el contexto de autofagia en linfocitos, LRBA compita con proteínas adaptadoras de clatrina, regulando este proceso. Esto ya que se ha observado, que moléculas como clatrina y sus proteínas adaptadoras son también importantes para el flujo autofágico ^41,42. Por otra parte, herramientas in silico han predicho que LRBA interactúa con LC3 ¹³.

En un intento por asociar los defectos en la autofagia con las características clínicas encontradas en los individuos con deficiencia de LRBA, es importante tener en cuenta que una de las manifestaciones clínicas más comunes entre estos individuos es la gastropatía, en muchos casos expresada como Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) o enfermedad similar a EII, una condición que se caracteriza por una inflamación recurrente destructiva en el tracto intestinal ^3-5. Un incremento en la producción de IL-1β en la mucosa intersticial se ha involucrado con la inflamación descontrolada en esta enfermedad ⁴³. Los macrófagos derivados de ratones deficientes para ATG16L1 (del inglés, autophagy-related 16-like 1), los cuales presentan un defecto en la autofagia, muestran una elevada producción de IL-1β después de la estimulación con LPS ⁴⁴. De la misma manera, el polimorfismo rs2241880 en ATG16L1 incrementó la producción de IL-1β en células mononucleares de sangre periférica aisladas de pacientes con EII ⁴⁵. La autofagia puede regular la producción de IL-1β mediante dos vías: en ausencia de autofagia, las mitocondrias defectuosas se acumulan generando un incremento de ROS (del inglés, reactive oxygen species) y liberando ADN mitocondrial al citoplasma, eventos que activan el inflamosoma, aumentando la producción de IL-1β ^46,47. Por otra parte, la degradación de la pro-IL-1β mediada por los procesos de autofagia limita el sustrato disponible para el inflamasoma, regulando de esta manera la activación de la IL-1β ^48,49. Por lo tanto, las alteraciones en la autofagia limitarían este mecanismo, aumentando los niveles de IL-1β e induciendo inflamación. No se conoce si las manifestaciones intestinales en los pacientes con deficiencia en LRBA están mediadas por una excesiva actividad del inflamosoma y la exagerada producción de IL-1β.

Se requieren estudios de microscopia con células deficientes de LRBA que estudien la distribución intracelular de moléculas como Rab7 y LC3 tras el flujo autofágico. Sería interesante también investigar si LRBA interactúa físicamente con alguna de las moléculas Rab involucradas en los diferentes tipos de autofagia, por medio de ensayos de co-inmunoprecipitación. El papel de LRBA en la actividad del inflamosoma pudiera abordarse mediante la medición de la producción de IL-1β en células fagocíticas o del epitelio intestinal deficientes de LRBA o determinando la actividad del auto-inflamosoma activo por medio de redistribución de ASC (del inglés, apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain), la cual es una proteína que recluta las caspasas necesarias en para la activación del inflamosoma.

LRBA participa en la apoptosis

En linfocitos B inmortalizados sometidos a inanición provenientes de pacientes deficientes de LRBA, se observó un incremento significativo de la apoptosis ². Adicionalmente, en células HeLa silenciadas para LRBA expuestas a luz ultravioleta o estaurosporina, se observó un mayor clivaje de PARP (por sus siglas en inglés, Poly (ADP-ribose) polymerase) y de la caspasa 3, eventos necesarios para iniciar la cascada de señalización que finalmente lleva a la apoptosis ¹⁴.

La apoptosis es un tipo de muerte celular programada por la misma célula con el fin de controlar su desarrollo y crecimiento. Por mucho tiempo se ha considerado a las caspasas como las proteasas involucradas en la ejecución del programa de apoptosis, y hoy en día se conoce que la desestabilización parcial de la membrana lisosomal, con la consecuente liberación de enzimas hidrolíticas, puede iniciar y ejecutar el programa de apoptosis, activando las caspasas ^50,51. En los centros germinales provenientes de amígdalas se observó que la desestabilización lisosomal en linfocitos B contribuye a la apoptosis ⁵⁰. La inducción del daño lisosomal en estos linfocitos B resultó en el clivaje de la caspasa 8 y también del ADN, debido a la actividad incrementada de la catepsina B en el citoplasma. De manera interesante, se ha observado que p53 induce desestabilización lisosomal ⁵² y el promotor de LRBA es regulado negativamente por p53 ¹⁴. P53 es un gen supresor de tumores que codifica un factor de transcripción nuclear cuya expresión se incrementa en respuesta al daño, deteniendo el ciclo celular y facilitando la reparación del ADN o induciendo apoptosis ⁵². Se podría plantear la hipótesis que en ausencia de LRBA, p53 induce desestabilización lisosomal y como consecuencia la apoptosis en linfocitos. Sin embargo, hasta el momento no se conoce el mecanismo por el cual p53 induce la desestabilización lisosomal ni como LRBA protege las células de la apoptosis.

No obstante, parece existir una conexión entre los mecanismos de autofagia y la apoptosis. Aunque la diafonía entre los procesos de autofagia y la apoptosis es compleja también es crítica para el destino celular. Bajo ciertas condiciones celulares, la autofagia puede promover la supervivencia celular y evitar la apoptosis ⁵³. Por ejemplo, el aumento de la autofagia en células privadas de nutrientes o factores de crecimiento permite la supervivencia celular al inhibir la apoptosis. Un mecanismo sugerido por el cual la autofagia inhibe la apoptosis, es el secuestro de las mitocondrias dañadas por el autofagosoma, evitando así que el citocromo c mitocondrial liberado sea capaz de formar un apoptosoma funcional en el citoplasma ⁵³. Sin embargo, en otras condiciones, la autofagia puede culminar en la muerte celular, de manera dependiente o independiente de la apoptosis ⁵³. Adicionalmente, son varias las proteínas que comparten un papel dual tanto en la apoptosis como en la autofagia ⁵³. Estas proteínas autofágicas regulan positivamente o negativamente la apoptosis mitocondrial directa o indirectamente a través del clivaje de proteasas ⁵³. En el contexto de las células deficientes de LRBA, se ha demostrado una autofagia defectuosa con un aumento en la apoptosis. No se conoce si una alteración en la depuración de las mitocondrias dañadas o un exagerado clivaje de las proteasas son los responsables de este fenotipo celular.

Por lo tanto, es necesario evaluar la cantidad y la integridad de los lisosomas en las células inmunes deficientes de LRBA. Además, se pudiera estimar la cinética de desestabilización lisosomal en relación con la cinética de otros parámetros apoptóticos como, inestabilidad mitocondrial, activación de caspasa-3 y escisión de ADN.