Sujetos humanos

Pacientes remitidos al Grupo de Inmunodeficiencias Primarias de la Universidad de Antioquia (Medellín, Colombia) que presentan alguna manifestación clínica asociado con el fenotipo de la deficiencia de LRBA (Disregulación inmune: enteropatía, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad pulmonar intersticial linfocítica granulomatosa, diabetes melitus tipo I y/o hepatitis autoinmune crónica; organomegalia: esplenomegalia, linfadenopatía y / o hepatomegalia; hipogammaglobulinemia: niveles bajos de IgM, IgG o IgA de título, o los tres isotipos de inmunoglobulina reducidos) se reclutaron para evaluar la expresión de LRBA en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Se excluyeron pacientes con diagnóstico incompleto según los criterios del especialista. También se incluyeron controles sanos apareados por edad y género con los pacientes, padres y hermanos y se analizaron muestras en paralelo con las de los pacientes, esto se realizó para garantizar que la variabilidad de la expresión no fuera inherente a la edad o el sexo y para determinar si otro miembros de la familia también tenían afectada la expresión de la proteína. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Sede de Investigaciones Universitarias (SIU), Universidad de Antioquia, UdeA. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes involucrados en este estudio.

Evaluación de la expresión LRBA

Estudios inmunológicos

La información clínica y el análisis inmunológico (niveles de inmunoglobulina, números de subpoblación de linfocitos en sangre periférica) de pacientes se obtuvieron de los registros del servicio de diagnóstico del Grupo de Inmunodeficiencias Primarias.

Análisis estadístico

Se realizó el coeficiente de correlación de Pearson utilizando GraphPad Prism 5 (https://www.graphpad.com/support/prism-5-updates/) para medir la correlación estadística entre la intensidad de la detección de LRBA por WB (intensidad de banda de LRBA) y el Tinción de LRBA por FACS (intensidad media de fluorescencia, IMF).

Detección de LRBA en células de sangre periférica.

Para confirmar la sensibilidad de esta prueba y la precisión de dos diferentes anticuerpos anti-LRBA disponibles comercialmente, estandarizamos la evaluación de la expresión de LRBA en CMSP humanas por WB y FACS. Usando WB, se detectó la banda LRBA a 319 kDa en células CMSP estimuladas con PHA de donantes sanos (DS) (Figura 1A). Además, se detectó LRBA por FACS en células de sangre periférica ex vivo y en CMSP estimuladas y sin PHA. El LRBA se expresa constitutivamente en células CD3+ de sangre periférica ex vivo y en CMSP no estimuladas después de tres días de incubación, sin embargo, tras la estimulación con PHA, la expresión aumenta dos veces (Figura 1B). Se evaluó la correlación entre la capacidad de WB y FACS para detectar LRBA (Figura 1C), y se observó una correlación positiva (r: 0.4723, p 0.0112) entre el nivel de detección de LRBA entre ambas técnicas. Para asegurar la especificidad de nuestros anticuerpos, se realizó un análisis BLAST para evaluar si cada epítope reconocido por los anticuerpos anti-LRBA se estaba alineando con otras proteínas humanas (Figura 1D). Además del 100% de coincidencia con la proteína LRBA, estos epítopes también coincidieron con la proteína paraloga NBEA en 36% y 44%, respectivamente. Estos resultados indican que los anticuerpos policlonales anti-LRBA utilizados por nosotros también podrían reconocer NBEA, pero esta posibilidad se descarta porque esta proteína tiene una expresión muy limitada en el cerebro ⁶. Además, el anticuerpo HPA019366 mostró una unión específica a LRBA intracelular que se perdió al agregar un péptido de bloqueo específico de LRBA de una manera dosis dependiente (Figura 1E).

Figura 1 Estandarización de la tinción de LRBA en células de sangre periférica humana. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) estimuladas con fitohemaglutinina A (PHA) de donantes sanos (DS) y se lisaron inmediatamente para extraer y cuantificar proteínas (40 ug) que se analizaron en una transferencia Western Blot (WB) con el anticuerpo anti-LRBA (HPA023597 , Sigma) usando GAPDH como una proteína expresada constitutivamente. Se detectaron bandas a 319 y 37 KDa, respectivamente (A). Consecutivamente, las células de sangre periférica ex vivo y las CMSP estimuladas sin PHA (1 µg / ml) se tiñeron intracelularmente con el anticuerpo anti-LRBA (HPA019366, Sigma) usando anti-conejo PE-F (ab) `2 Donkey IgG como anticuerpo secundario. Las líneas punteadas indican la tinción solo con el anticuerpo secundario. Las líneas continuas representan la tinción con el anticuerpo anti-LRBA junto con el anticuerpo secundario. Se muestra la tinción de LRBA solamente las células CD3+ activadas (B). Se realizó un análisis de correlación de Pearson comparando la intensidad de la detección de LRBA por WB (intensidad de banda de LRBA) y la tinción de LRBA por FACS (intensidad de fluorescencia media, IMF) (C). Además, se realizó un análisis BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) para evaluar si el péptido reconocido por los anticuerpos anti-LRBA utilizados en este estudio tenían reacción cruzada con NBEA (Secuencia de www.ncbi .nlm.nih.gov/nuccore/NC_000013.11) (NBEA es un paralog de LRBA) (D). En función de los anticuerpos anti-LRBA que se comercializan son policlonales, la especificidad de reconocimiento también se evaluó mediante el péptido LRBA SVLMVSKYRDILEPQNERHSQSCTETGSENENVSLSEITPAAFSTLTTASVEESESTSSARRRDSGIGEETATGLGSHVEVTPHTAPPGVSAGPDAISEVLSTLSLEVNKSPETKNDRGNDLDTKATPSVSV como un reactivo competitivo a diferentes concentraciones. Se calculó el porcentaje de reconocimiento de la proteína LRBA celular (E). 

Expresión de LRBA en pacientes con fenotipo clínico asociado a deficiencia de LRBA

Acorde a los criterios de inclusión, se reclutaron ciento doce pacientes, 29 pacientes con inmunodeficiencia común variable (ICV), 14 con agamaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA, del inglés, X-linked agamaglobulinemia), 55 con hipogammaglobulinemia idiopática (IHG, del inglés, idiopathic hypogammaglobulinemia), 1 con deficiencia selectiva de IgA (SigAD, del inglés, selective IgA deficiency), 5 con enteropatías, 3 con púrpura trombocitopénica idiopática y 5 con lupus eritematoso sistémico (LES) (Figura 2A). En nuestra cohorte, los pacientes con ICV, IHG, XLA y SIgAD presentaron hipo o agammaglobulinemia, 9 pacientes con ICV exhibieron manifestaciones autoinmunes (Tabla S2). La expresión relativa de LRBA fue evaluada por WB en 25 DS y cuantificada usando densitometría, para normalizarla contra la expresión de la proteína constitutiva (TUBA o GAPDH) (Figura 2A). Se seleccionó el punto de corte óptimo de LRBA para distinguir entre "expresión disminuida de LRBA" y "expresión normal de LRBA " considerando el valor mínimo de la expresión de LRBA entre DS (corte del punto 0.5).

Como control negativo, se usó CVID022 ya que esta muestra siempre fue negativa para la expresión de LRBA (Figura 2A). Además, se evaluó la expresión de LRBA en células de sangre perférica ex-vivo y CMSP estimuladas y sin PHA por FACS (Figura S3). El LRBA exhibió una disminución de 2.3 veces en las células de pacientes ex vivo en comparación con las células DS. Por lo tanto, la reducción en la expresión de LRBA en linfocitos de CVID022 se observó no solo por WB sino también por FACS. Desafortunadamente, no fue posible evaluar la expresión de LRBA mediante citometría de flujo en los otros pacientes con disminución de la expresión de LRBA por WB. Se observaron resultados similares en CMSP sin estímulos de PHA. Sin embargo, el efecto fue más evidente en las CMSP estimuladas con PHA con una disminución de ocho veces en la expresión de LRBA en el paciente en comparación con una DS (Figura S3).

Figura 2 Expresión de LRBA en pacientes. Ciento doce pacientes fueron reclutados para evaluar la expresión de LRBA por westerm blot (WB). Se obtuvieron CMSP estimuladas con PHA de 25 donantes sanos para extraer y cuantificar proteínas (40 μg) que se analizaron en un WB con el anticuerpo anti-LRBA Ab HPA023597 (Sigma) usando GAPDH o TUBA como proteína expresada constitutivamente. Se detectaron bandas a 319 kDa para LRBA, 37 KDa para GAPDH y 49 KDa para TUBA. La normalización de la intensidad de la banda LRBA contra la proteína constitutiva (GAPDH o TUBA) se muestra en (A). Las intensidades de la banda WB de LRBA en células estimuladas con PHA de pacientes con expresión disminuida de LRBA se muestran en (B). ICV o CVID: inmunodeficiencia común variable, XLA: agammaglobulinemia ligada a X, IHG: hipogammaglobulinemia, SIgAD: deficiencia selectiva de IgA, PTI: púrpura trombocitopénica idiopática, LES: lupus eritematoso sistémico. Las barras grises representan las muestras repetidas. Las flechas rojas indican los pacientes con disminución de LRBA que continuaron en el estudio.  

Se observó una disminución de la expresión de LRBA en nueve lisados ​​de proteínas de CMSP estimuladas con PHA (Figura 2A, barras grises), pero solo se repitieron en ocho y se confirmaron en seis lisados ​​por obtención de una segunda muestra de sangre: dos pacientes con CVID (CVID22 y CVID024), dos pacientes con XLA (XLA012 y XLA014) y dos pacientes con hipogammaglobulinemia (IHG001 e IHG002) (Figura 2 flecha roja). Curiosamente, los pacientes con hipogammaglobulinemia son hermanos. Es importante mencionar que CVID027 es hermana de estos hermanos, sin embargo, no mostró disminución de la expresión de LRBA en CMSP (Figura 2A).

No hubo diferencias en la expresión de LRBA por WB en células obtenidas de pacientes con las diferentes condiciones clínicas evaluadas en comparación con DS (media/DE de la intensidad de banda normalizada: DS: 0.86/0.25; CVID: 0.69/0.32; XLA: 0.86/0.47; IHG: 0.90/0.35; enteropatías: 1.10/0.31; ITP: 0.98/0.25 y SLE: 0.77/ 0.20).

Curiosamente, se observó un aumento en la expresión de LRBA en siete pacientes (XLA001, XLA011, IHG003, IHG022, IHG022, IHG038, Entero003). La Figura 2B muestra las intensidades de banda de WB de LRBA en células estimuladas con PHA de pacientes con expresión disminuida de LRBA.

Fenotipo clínico de pacientes con expresión disminuida de LRBA

Las características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1. La paciente CVID022 es una mujer nacida a término en 1982, producto del primer embarazo de padres sanos no relacionados de Medellín (Antioquia-Colombia). Aunque no se documentaron antecedentes familiares de infecciones recurrentes, autoinmunidad o neoplasias hematológicas, los miembros de la familia describieron rinitis, bronquitis, diabetes tipo II, asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

El paciente CVID024 es un hombre, nacido a término en 1998 de padres sanos no relacionados. Es el primer hijo y tiene un hermano más joven y saludable. Su padre es de Medellín y su madre de Bolívar (Antioquia-Colombia). Solo tenía antecedentes familiares de diabetes tipo II y asma en su abuela paterna. A los 8 años, se identificaron dos variantes en TACI en un patrón de herencia heterocigoto compuesto: una variante, c.121G> C (p.41D> H) en el exón 2 y la segunda variante c.297_299insT (p.Q99fsX6) en el exón 3. Sin embargo, ambas variantes también se identificaron en la madre y en el hermano del paciente, los cuales no están afectados, El padre portaba ambas variables tipo silvestre.

El paciente XLA012 es un hombre, nacido por cesárea en 2010 de padres sanos no relacionados de Cúcuta (Norte de Santander, Colombia). Él también tiene una hermana mayor sana. La diabetes y la hipertensión se informaron en su abuela materna. También se documentó la historia familiar de un tío fallecido a la edad de 5 años debido a "edema". El diagnóstico genético de XLA se realizó a los 2 años con la detección de la mutación c.1573C> T p.Arg525X en Btk. Durante los cinco años de seguimiento, se ha documentado un síndrome bronquial crónico, anemia y sinusitis crónica.

El paciente XLA014 es un hombre, nacido a término en 2013, producto del segundo embarazo de padres sanos no relacionados de Santa Rosa del Sur de Bolívar (Santander-Colombia). Su madre tuvo un aborto espontáneo previo y él también tiene un hermano menor saludable. Cáncer hematológico se informó en su abuela paterna.

IHG001 es un hombre, nacido en 2008 en Medellín - Colombia de padres sanos no relacionados. Fue el producto del tercer embarazo, nacido prematuramente a las 34 semanas de gestación por cesárea con enfermedad de membrana hialina. Su padre sufría de rinitis alérgica y su abuela materna documentó asma e hipotiroidismo. También tiene un primo con hipotiroidismo. Su hermana (IHG002) nació en 2006. Ella fue el producto del segundo embarazo, nacido a las 36 semanas de gestación por cesárea. Estos hermanos tienen una hermana mayor (CVID027) con inmunoglobulinas séricas normales y expresión de LRBA en CMSP.

Fenotipo inmunológico en pacientes con disminución de la expresión de LRBA

Un análisis inmunológico de los diferentes subgrupos de linfocitos en sangre periférica de todos los pacientes con disminución de LRBA en CMSP no mostró una característica fenotípica común y distintiva (Tabla 2). Sin embargo, las características inmunológicas de los diferentes pacientes se confirmaron según el grupo de enfermedad. Todos los pacientes con ICV exhibieron una disminución de IgG e IgA en suero. Las subpoblaciones de linfocitos T en sangre periférica fueron normales en los pacientes con ICV. Se observó una disminución en los linfocitos B de memoria (IgD+ / CD27+) en ambos pacientes, sin embargo, solo CVID022 tuvo una disminución en los linfocitos B de memoria con cambio de isotipo (IgD- / CD27+). Con respecto a los pacientes con XLA, la disminución en los tres isotipos de Ig en suero se observó en XLA012, mientras que no se encontraron datos de inmunoglobulinas (Ig) en suero previos a la terapia de reemplazo de inmunoglobulina intravenosa (IVIG, del inglés intravenous immunoglobulin) para XLA14. Fue notorio el muy bajo número de linfocitos B de sangre periferica observadas en estos pacientes. Además, se observaron algunas alteraciones menores de los linfocitos T CD3+ en los pacientes con XLA. Curiosamente, los dos hermanos con IHG exhibieron un fenotipo inmunológico diferente. IHG001 exhibió niveles muy bajos de IgG e IgA en suero, mientras que IHG002 presentó solo una disminución de IgG en suero. Sin embargo, ambos exhibieron un aumento en la subpoblación de los linfocitos B de memoria (Tabla 2).

Variantes de LRBA en los pacientes con disminución de la expresión de LRBA

WES se realizó en los pacientes con disminución de la expresión de LRBA. En general, se identificaron dieciocho variantes no sinónimas en exones o intrónes en LRBA, en estos pacientes (Tabla 3). Se encontraron cinco variantes con una frecuencia de población <1% (Tabla 3, barras grises), de las cuales, dos variantes, rs148385798 en el paciente CVID022 y el rs950337550 en el paciente CVID024 fueron posiblemente patógenas (Tabla 3, recuadro rojo). La variante rs148385798 es un cambio sin sentido heterocigoto c.T194C en el exón 2 que corresponde al cambio p.I65T en el dominio ConA de la proteína. El análisis in silico predijo ser "perjudicial" con SIFT (puntuación: 0.02); "Causante de enfermedad" con MutationTaster (valor p: 0.995) y "perjudicial" en PROVEAN (puntaje: -2.558) y el puntaje CADD fue 16.37. La segunda variante rs950337550 es una variante sin sentido heterocigota c.6892A> G en el exón 46 que confiere un cambio p.K2298E en el dominio BEACH. El análisis en silco predijo que sería "perjudicial" con SIFT (puntuación: 0.005); "Causante de enfermedad" con MutationTaster (valor p: 1) y "No perjudicial" con PROVEAN (puntaje: -1.44).

Teniendo en cuenta que el patrón de herencia LRBA es autosómico recesivo y que no habíamos encontrado variantes bialélicas, continuamos con el análisis de variantes en otros genes involucrados en el sistema inmune.

Otras variantes relevantes encontradas secuenciación del exoma completo (WES- Whole-Exome Sequencing)

Se identificaron 50,300 variantes de alta calidad en el exoma CVID022. Entre ellos, 17,056 fueron homocigotos y 33,244 heterocigotos (Tabla 4). Las variantes en los genes IDP se analizaron primero y se encontraron variantes homocigóticas en tres genes (PLCG2, POLE, RLTPR). Sin embargo, estas variantes se localizaron en regiones intrónicas, muy distantes del exón proximal. Para proceder con el análisis de WES, siguiendo la hipótesis de un estado de herencia recesivo, se seleccionaron variantes homocigóticas o heterocigotas compuestas. Estas variantes deben cumplir también los criterios definidos. Se seleccionaron tres genes candidatos (KCNN3, TRPM3, ECT2L), sin embargo, KCNN3 y TRPM3 no se expresan en los tejidos linfoides. Además, el padre del paciente también portaba ambas variantes en ECT2L. Finalmente, evaluamos las variantes heterocigotas de novo. Se encontró una variante en la proteína L3 mitocondrial ribosómica (MRL3). Las enfermedades asociadas con MRPL3 incluyen la Deficiencia combinada de fosforilación oxidativa 9 ⁷. sin embargo, esta es una condición severa que afecta principalmente la función neurológica y hepática.

En XLA12, se identificaron 53,002 variantes, 14,785 homocigotas y 20,730 heterocigotas (Tabla 4). Dentro de los genes IDP, se identificaron 27 variantes. Entre ellos, se confirmó la variante c.1573C> T p.Arg525X en BTK. En otros genes, no se encontraron variantes candidatas patogénicas potenciales.

En XLA14, se identificaron 52,821 variantes de alta calidad en el exoma, 15,015 fueron homocigóticas y 20,530 heterocigotas (Tabla 4). Dentro de los genes relacionados con IDP, se encontraron 40 variantes y se identificó una variante potencialmente patógena en el gen BTK. Esto corresponde a c.622 + 1G> A (NM_001287344). 3. El análisis in silico (fruit fly y NetGene2) mostró que los efectos de la mutación BTK confieren un cambio en el sitio donante de empalme al final del intrón 6 dentro de este gen que afecta a la proteína en el dominio PH.

En los hermanos IHG001 e IHG002, se encontraron un total de 53,215 variantes en ambos. Los números de variantes homocigotos y heterocigotos se especifican en la Tabla 4. Sin embargo, no se identificaron heterocigotos homocigotos o compuestos comunes en los genes IDP. Sin embargo, las variantes homocigotas en PLCL2, FDFT1 y GPRIN2, su padre tenía las mismas variantes homocigotas en PLCL2 y FDFT1 y su madre tenía las mismas variantes homocigotas en GPRIN2. Además, se encontraron variantes heterocigóticas compuestas en SEC22B, sin embargo, su padre portaba las mismas variantes.