Introducción

Las neoplasias mieloproliferativas crónicas (NMP) no asociadas con mutaciones BCR-ABL o Filadelfia negativas son un conjunto de enfermedades cuya principal característica es la proliferación clonal de células mieloides con madurez morfológica y eficiencia hematopoyética variables. Las neoplasias más comunes de este grupo son la policitemia vera, la mielofibrosis primaria y la trombocitemia esencial ¹. Según Shallis et al. ², la incidencia de neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL negativas es de 0.44-5.87 casos por 100,000 habitantes, con tasas de 0.84, 1.03 y 0.47 casos por 100,000 habitantes para policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria, respectivamente ².

Los estudios sobre neoplasias BCR-ABL negativas en Colombia son escasos. El único estudio que investigó las características clínicas de estas neoplasias fue presentado en el primer informe del registro colombiano de neoplasias mieloproliferativas realizado por la Asociación Colombiana de Hematología y Oncología (ACHO), que comprende 79 pacientes de diferentes hospitales del país entre 2013 y 2017. En este grupo, la trombocitemia esencial fue la enfermedad más frecuente de las tres patologías con 93 pacientes (51.9%), seguida de la policitemia vera con 55 pacientes (30.7%) y la mielofibrosis primaria con 31 pacientes (17.3%) ³. Sin embargo, hasta la fecha no se han publicado estudios moleculares de estas neoplasias en la población colombiana.

Las mutaciones en los genes que regulan la vía de señalización JAK-STAT, como los genes JAK2, MPL y CALR, causan neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL negativas. Por ejemplo, la mutación sin sentido de la tirosina quinasa JAK2 V617F conduce a un intercambio de valina por fenilalanina en la posición 617, lo que produce la fosforilación constitutiva de JAK2 y Ba/F3 o Ba/F3-EpoR, lo que permite que varias líneas celulares sobrevivan y proliferen independientemente de las citocinas ⁴. Asimismo, mutaciones en el gen MPL, como el cambio W > L o W > K en el codón 515, provocan la activación espontánea de la vía JAK-STAT ⁵. Además, han sido informadas mutaciones somáticas para el gen CALR que implican cambios en el marco de lectura causados ​​por deleciones o inserciones en el exón 9 ⁶.

La principal característica clínica de la policitemia vera es el aumento de la producción de glóbulos rojos independiente de los mecanismos que normalmente regulan la eritropoyesis ⁷. El noventa y cinco por ciento de los pacientes con esta patología presentan la mutación V617F u otra mutación en el gen JAK2, lo que resulta en el rápido aumento del linaje eritroide y otras líneas mieloides (panmielosis). Sin embargo, la trombocitemia esencial compromete principalmente el linaje megacariocítico y se caracteriza por trombocitosis sostenida (recuento de plaquetas > 450 x 109/L) en la sangre periférica y un número creciente de megacariocitos maduros grandes, que forman grupos ⁸. Los pacientes con trombocitemia esencial tienen una mutación JAK2 en 50 a 60% de los casos, mutaciones CALR en 30% y mutaciones MPL en 3%; aproximadamente el 12% son triple negativos. Ninguna de estas mutaciones es específica de TE, pero su presencia excluye la trombocitosis reactiva (el principal diagnóstico diferencial de TE) ⁽⁴. Finalmente, la mielofibrosis primaria se caracteriza por el rápido aumento de granulocitos y megacariocitos en la médula ósea relacionado con el depósito de tejido conectivo fibroso y la hematopoyesis extramedular en las últimas etapas de la enfermedad ⁽⁹. La mutación JAK2 V617F se observa en el 50-60% de los casos independientemente del estadio de la enfermedad, la mutación CALR en el 24% de los casos y las mutaciones MPL en el 8 %; Aproximadamente el 12% de los casos son triple negativos ⁵.

Las mutaciones en los genes JAK2, MPL y CALR son fundamentales para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de pacientes con neoplasias mieloproliferativas crónicas y fueron propuestas y revisadas por la OMS en 2008-2016 ⁽¹⁰. Ninguna publicación ha identificado la frecuencia y el tipo de estas mutaciones en estos tres genes en pacientes con neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL negativas en Colombia. Este estudio está dirigido a establecer las frecuencias de mutaciones en los genes JAK2, MPL y CALR en pacientes colombianos con diagnóstico clínico negativo de neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL. El análisis genético permite determinar un diagnóstico molecular más preciso en estos pacientes colombianos para establecer el pronóstico y tratamiento más adecuado que impacte en su supervivencia.

Materiales y métodos

Se realizó un estudio descriptivo, transversal. La población de estudio estuvo compuesta por una muestra por conveniencia de pacientes con diagnóstico clínico e histopatológico de neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL negativas según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) ⁽¹⁰ y mayores de 16 años. Los criterios de exclusión fueron: diagnóstico <15 años, no hubo estudios moleculares de muestras de sangre total y los pacientes no estaban dispuestos a participar en el estudio. Las muestras se obtuvieron de pacientes al momento del diagnóstico y de pacientes que recayeron en cualquiera de las tres enfermedades consideradas en este estudio. Los parámetros clínicos y de laboratorio se obtuvieron desde el momento del diagnóstico o recayeron mediante la revisión de sus historias clínicas. Las muestras fueron remitidas a la Unidad de Genética Médica de la Universidad de Antioquia desde tres hospitales de Medellín-Colombia (Hospital San Vicente Fundación, Clínica León XIII, IPS Universitaria y Hospital Pablo Tobón Uribe) entre 2017 y 2021. Después de que los pacientes proporcionaran su consentimiento informado firmado, sus muestras de sangre periférica se utilizaron para el análisis de biología molecular de los genes JAK2, MPL y CALR. El protocolo del estudio y el consentimiento informado fueron aprobados por el Comité de Bioética para experimentación en humanos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia.

Resultados

Se incluyeron en el estudio 54 personas con esta patología, de las cuales dos fueron excluidas por no existir estudios moleculares por la baja calidad de las muestras (Figura 1). Veintisiete pacientes (51.9%) eran hombres y 25 mujeres (48.1%). La edad promedio fue de 58 años (DE: 15.8), con un mínimo de 16 y un máximo de 87 años, donde la mielofibrosis primaria se presentó a una edad más tardía del diagnóstico (valor de edad = 68.25 años) (Tabla 1). El diagnóstico más frecuente fue trombocitemia esencial con 20 pacientes (38.5%), seguido de mielofibrosis primaria con 16 pacientes (30.8%) y policitemia vera con 13 pacientes (25.0%). Sin embargo, 3 (5.8%) pacientes no pudieron clasificarse en uno de los diagnósticos y se clasificaron como neoplasias mieloproliferativas crónicas negativas para BCR-ABL1 no clasificables. Se encontraron diferencias significativas en el nivel de hemoglobina, nivel de hematocrito, hematocrito y recuento de plaquetas entre las tres neoplasias (p= <0.001). Los pacientes diagnosticados con policitemia vera tenían los niveles más altos de hemoglobina y hematocrito, los pacientes con trombocitemia esencial tenían el recuento de plaquetas más alto y los pacientes con mielofibrosis primaria tenían los niveles más bajos de hemoglobina (Tabla 1).

Figura 1 Diagrama de flujo de pacientes seleccionados. 

De los 52 pacientes analizados, el 51.9% tenía la mutación JAK2 V617F, el 85.0% policitemia vera, el 35.0% trombocitemia esencial, el 43.7% mielofibrosis primaria y el 67.0% neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL1 negativas no clasificables. Además, se encontraron mutaciones en el exón 9 de CALR en el 35% de los pacientes con trombocitemia esencial y en el 31% de los pacientes con mielofibrosis primaria. Finalmente, la frecuencia de mutación del MPL fue del 12.5% de la mielofibrosis primaria. Además, en el grupo de pacientes diagnosticados de trombocitemia esencial se encontró un caso doble positivo para JAK2 V617F y CALR, contribuyendo doblemente a las frecuencias de estos genes (Tabla 2).

Respecto a la mutación en el exón 10 de MPL, 2 pacientes presentaban la mutación W515K. De los 12 pacientes con mutaciones en CALR exón 9, 7 presentaron una deleción de 52 pb (mutación tipo I - c.1092_1143del; L367fs*46), 2 presentaron una inserción de 5 pb (mutación tipo II - c1154_1155ins- TTGTC; K385fs*47) y 2 tenían mutaciones tipo I "similares" (de 34 pb y 46 pb). En particular, un paciente tenía una triple mutación en el gen CALR: una deleción de 10p (NM_004343.4):c.1130_1139delAAGAGGAGGA); esta ubicación también tenía una inserción de 9 pb (NM_004343.4):c.1130_1131insGCCTCTGTC) y otra eliminación de 9 pb ((NM_004343.4) c.1177_1185delGAGGAUGAG)-(CALR:p.E398_D400del)).

La Figura 2 describe las principales características clínicas y hematológicas de los pacientes con neoplasias mieloproliferativas crónicas negativas para BCR-ABL1 según JAK2, CALR y mutaciones triple negativas en estos genes. Los pacientes con una mutación en MPL fueron excluidos del análisis estadístico debido al pequeño tamaño de la muestra (dos pacientes). En cuanto a los resultados hematológicos, se encontró diferencia significativa entre pacientes triple negativos y aquellos con mutaciones en CALR en los recuentos de leucocitos (p= 0.019) y linfocitos (p= 0.051). Los pacientes positivos para mutaciones CALR tuvieron los recuentos más bajos para estas dos variables hematológicas (Figura 2A y B .). Aunque los pacientes con la mutación JAK2 tenían un recuento de plaquetas más bajo que aquellos con CALR y mutaciones triple negativas (Figura 2C ), tenían valores más altos de hemoglobina y hematocrito (Figura 2D y E ).

Figura 2 Relación entre el perfil mutacional de JAK2, CALR y muestras triple negativas y las características hematológicas de los pacientes. A. Recuento de leucocitos, B. Recuento de linfocitos, C. Recuento de plaquetas, D. Nivel de hemoglobina, E. Nivel de hematocrito y F. Recuento de neutrófilos. 

Discusión

El presente estudio evaluó las frecuencias de mutaciones en los genes JAK2, MPL y CALR en 52 pacientes colombianos. Hasta la fecha, este estudio es el primero en describir el perfil mutacional de estos tres genes en neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL1 negativas en Colombia. Aunque el tamaño de la muestra fue pequeño, se obtuvieron frecuencias similares a las reportadas en otros estudios de poblaciones latinoamericanas, como los de Argentina y México (Tabla 3) ^15,16. Estas similitudes probablemente se debieron a que las poblaciones comparten un trasfondo genético común con un origen triétnico: europeo, amerindio y africano.

La caracterización genética de pacientes colombianos con neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL1 negativas cuyo contexto genético es diferente al de otras poblaciones es fundamental para un diagnóstico certero, un buen pronóstico y un adecuado manejo y supervivencia del paciente. La mutación JAK2 V617F se asocia con un mayor riesgo de trombosis arterial y un menor riesgo de mielofibrosis postrombocitemia arterial. En la policitemia vera, una mayor frecuencia del alelo mutante JAK2V617F se ha asociado con prurito y transformación fibrótica. En general, la mutación JAK2V617F se asocia con edad avanzada, niveles más altos de hemoglobina, leucocitosis y niveles más bajos de plaquetas. Además, los pacientes con mutación positiva del exón 12 de JAK2 generalmente tienen mielopoyesis predominantemente eritroide, eritropoyetina sérica por debajo de lo normal y una edad más joven en el momento del diagnóstico, pero su pronóstico es similar al del exón 14 JAK2V617F ⁵. En la trombocitemia esencial, la mutación CALR se asocia con un nivel más bajo de hemoglobina, un recuento más alto de plaquetas, un recuento más bajo de glóbulos blancos y una edad más joven en comparación con la mutación JAK2V617F. Se han observado características similares en pacientes con mielofibrosis primaria. La mutación CALR también se asocia con el género masculino, un menor riesgo de trombosis y una mejor supervivencia general ⁸.

La mutación JAK2 V617F fue la más común entre las tres neoplasias evaluadas en nuestra cohorte, con frecuencias similares a las reportadas en otras poblaciones ^(15,16,19. Sin embargo, se observaron pocas diferencias en las frecuencias mutacionales dado que la mutación más común asociada con esta patología fue la mutación JAK2 V617F estudiada en este estudio ¹³. Esta mutación activa tres receptores principales: el receptor de eritropoyetina, el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y MPL. Por este motivo, JAK2V617F se asocia con policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria ²⁷. Sin embargo, la mutación MPL W515K se informó sólo en dos pacientes con mielofibrosis primaria. Esta mutación ocurre con baja frecuencia, principalmente en pacientes con ET o mielofibrosis primaria, lo que implica que puede favorecer la determinación del linaje megacariocítico en lugar del eritroide ²⁸.

En este estudio, la frecuencia de mutaciones en el exón 9 de CALR fue del 35% tanto para la trombocitemia esencial como para la mielofibrosis primaria. Se encontraron frecuencias similares en diferentes estudios, como se informa en la Tabla 3. En particular, en pacientes diagnosticados con trombocitemia esencial, se encontró un caso doble positivo para JAK2 V617F y CALR. Recientemente, se informó la coexistencia de mutaciones CALR y JAK2V617F en algunos casos de neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL1 negativas ^29-35, así como mutaciones JAK2 V617F y MPL W515L/S ³⁶. La coexistencia entre estos genes se produjo en el 5-15% de los casos de MPL. Estos hallazgos contrastan la hipótesis de que las mutaciones en JAK2, CALR y MPL son mutuamente excluyentes ¹⁰. Además, en este estudio se encontraron seis tipos de mutaciones en el exón 9 de CALR, principalmente deleciones; la más prevalente fue la mutación tipo I, seguida por la tipo II ^33-35.

Cabe destacar que un paciente presentó tres mutaciones en el gen CALR: una deleción de 10 pb (NM_004343.4):c.1130_1139delAAGAGGAGGA); esta ubicación también tuvo una inserción de 9 pb (NM_004343.4):c.1130_1131insGCCTCTGTC) y otra eliminación de nueve pb en sentido descendente ((NM_004343.4) c.1177_1185delGAGGAUGAG)- (CALR:p.E398_D400del)). La deleción de diez pb se informó en la anemia refractaria como variante patogénica (COSV57120310), cambiando el marco de lectura al de las mutaciones CALR más frecuentes ³⁷. La inserción de 9 pb en este punto no se ha informado hasta la fecha y representa un hallazgo sorprendente en este paciente. Finalmente, la tercera mutación es una deleción de nueve pb informada en un estudio de neoplasias mieloproliferativas. Esta variante está anotada como un polimorfismo de 9 pb (rs550353351; NM_004343.4: c.1177_1185del-GAGGATGAG) que elimina tres aminoácidos (NP_004334.1: p. Glu398_Asp400del) que desplaza el marco de lectura de +1 pb, lo que resulta en el reemplazo del extremo C-terminal normal por una nueva secuencia de aminoácidos ³⁶. La gravedad de estas mutaciones podría explicar la falta de respuesta al tratamiento del paciente y su posterior muerte.

No pudimos comparar las características clínicas y hematológicas estratificadas por enfermedad y mutación, dado el pequeño tamaño de la muestra. Sin embargo, se realizó un análisis de las características clínicas y hematológicas por mutación en la población total de estudio. Los pacientes con mutaciones JAK2 tenían recuentos de plaquetas más bajos que aquellos con CALR y mutaciones triple negativas, hallazgos similares a los publicados en diferentes poblaciones, como las de Brasil y Tailandia. ^22,25. Los pacientes con mutaciones en JAK2 también presentaron niveles elevados de hemoglobina y hematocrito, como lo reportan las guías de la OMS de 2017 y otros estudios ^10,27,38. Sin embargo, los recuentos de leucocitos y linfocitos fueron más bajos en pacientes con mutaciones CALR que en pacientes triple negativos. Este resultado es consistente con varias poblaciones en América Latina, Corea e Italia y los informes de la OMS ^{10,15,17,33,34}. Cabe destacar que los dos pacientes con mutaciones raras (doble positivo para JAK2 y CALR y triple mutación en CALR) tuvieron un diagnóstico de trombocitemia esencial y presentaron valores de hemoglobina y hematocrito bajos en comparación con los valores de referencia normales en este tipo de pacientes. El paciente con doble positivo para JAK2 y CALR también tenía un recuento bajo de glóbulos blancos. El diagnóstico de trombocitemia esencial en pacientes con mutaciones raras también ha sido reportado en otros estudios de diferentes poblaciones ^31,35,39.

En cuanto a la relación entre características hematológicas y neoplasias, los pacientes con policitemia vera presentaron valores elevados de hemoglobina y hematocrito, hallazgo esperable en esta patología asociada a un fenotipo hematológico de eritrocitosis aislada por alteración predominante del linaje eritroide. Además, se observó hiperplasia variable de los linajes megacariocíticos/granulocíticos ^9,10,27,40. Los pacientes con trombocitemia esencial presentaron un recuento elevado de plaquetas independientemente de su perfil mutacional, hallazgo que concuerda con lo reportado en las guías de la OMS ^{10,17,22,33,34}. Otra característica de la trombocitemia esencial fue una mayor frecuencia de pacientes diagnosticados de sexo femenino (13 mujeres frente a siete hombres), hallazgo que también se ha informado en otros estudios ^41-43. Finalmente, los pacientes con mielofibrosis primaria presentaron niveles bajos de hemoglobina, coincidiendo con otros hallazgos reportados en la literatura ^4,18 y considerado un criterio diagnóstico menor en las guías de la OMS. ¹⁰.

Este estudio tiene una limitación en el tamaño de la muestra, lo que disminuye el poder para detectar asociaciones significativas y aumenta el riesgo de informar falsos positivos. Sin embargo, las variantes analizadas han sido reportadas previamente, lo que reduce sustancialmente el riesgo y aumenta la confiabilidad de los resultados. Por lo que se sugieren estudios futuros con un tamaño muestral mayor, como un estudio multicéntrico prospectivo para realizar un análisis genético completo y validar los resultados de nuestro estudio y la utilidad del pronóstico en pacientes colombianos con neoplasias mieloproliferativas crónicas BCR-ABL1 negativas.