¹ M.Sc., Grupo de Ingeniería Genética de Plantas. Departamento de Biología & Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia.

² Bióloga, Grupo de Ingeniería Genética de Plantas. Departamento de Biología & Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia.

³ Ph.D. Grupo de Ingeniería Genética de Plantas, Departamento de Biología & Instituto de Genética .Universidad Nacional de Colombia.

Correspondencia: ecdiazg@unal.edu.co ; achaparrog@unal.edu.co

Recibido para evaluación: 30-08-2011. Aprobado para publicación: 18-07-2013.

RESUMEN

La población mundial está excediendo los 6 mil millones de personas, y es necesario que en los próximos años se incremente la producción de alimentos en un 50 %. Entre los factores limitantes de la producción agrícola estánlos insectos plaga. Se estima que las pérdidas causadas por diferentes plagas fluctúan entre 20% y 40%. Entre las estrategias que se han implementado para manejar este problema,  está la utilización de plantas transgénicas resistentes a insectos, usando genes derivados de Bacillus thuringiensis (Bt). La mayoría de estos genes están  protegidos por patentes, y por tanto el acceso esta restringido. Se hace necesario buscar nuevas formas y herramientas que permitan el uso de estos genes, para la solución de problemas agrícolas. Se diseñó y construyo mediante paquetes bioinformáticos, una versión semisintética del gen cry1Ac,  optimizando su expresión para arroz (Oriza sativa), mediante el criterio del uso codónico de arroz y se realizo un análisis in silico de las características de la proteína traducida.

PALABRAS CLAVE: Cultivos Transgénicos, Arroz, cry1Ac, Genes Semisintéticos, Bioinformática.

ABSTRACT

Theworld's population isexceeding6 billionpeople and it’snecessary inthecomingyearsto increasefood productionby50%.Amongthe limiting factors toagricultural productionareinsect pests. It isestimatedthatlosses causedbydifferentpestsare rangingbetween20% and 40%. Among thestrategiesthat have been implementedto handlethis problemistheuseof transgenic plants resistantto insects, using genes derivedfromBacillusthuringiensis(Bt).Most of thesegenesareprotectedby patents andtherefore accessis restricted.It isnecessary tofind newwaysand tools toenableaccess tothesegenes, for the solution of agricultural problems. It was designedand builtthroughbioinformaticspackages, a semi synthetic versionof thecry1Acgene, codonoptimizedfortheuseofrice(Oryzasativa), andwasperformedinsilicoanalysisof the characteristics ofthe translated protein.

KEY WORD: Transgenic Crops, Rice, cry1Ac, Gen semi synthetic, Bioinformatics.

RESUMO

população mundialé superior a 6bilhões de pessoas,e é necessárionos próximos anosaumentara produção de alimentosem 50%.Entre os fatores limitantesda produção agrícolasão as pragasde insetos.Estima-seque as perdas causadaspor pragasvariam de20% a 40%. Diversas estratégias têm sidoimplementadas paralidar com este problema, um dos quais é o uso deplantas transgênicasresistentes a insetosusandogenesderivados deBacillusthuringiensis(Bt). A maioria destesgenesestão protegidos porpatentese, portanto,o acesso é restrito. É necessárioencontrar novas formase ferramentas parausar essesgenespara a solução deproblemas agrícolas. Neste trabalho foi projetado e construídoatravés dabioinformática, uma versão semi-sintéticodo genecry1Acpara otimizar a expressãopara o arroz (Oryza sativa), pelo critériode usocódonde arroz efoi realizadain silicoanálise das característicasda proteínatraduzida.

PALAVRAS-CHAVE: Cultivos Transgênicos, Arroz, cry1Ac, Genesemi-sintético, Bioinformática.

INTRODUCCIÓN

La población mundial está excediendo los 6 mil millones de personas, es necesario que en los próximos años se incremente la producción de alimentos en un 50 %, [1,2]. Entonces, se debe combatir eficazmente uno de los factores más limitantes, que son los insectos plaga que atacan los cultivos. Se estima que las pérdidas en la producción agrícola mundial causadas por plagas fluctúan entre 20% y 40%, con costos entre los 30 a 50 mil millones  de dólares anuales [3,4].

La forma más usual para el control de insectos plaga  de cultivos, es la aplicación de pesticidas químicos. El uso indiscriminado de insecticidas ha traído varias consecuencias: contaminación ambiental, resistencia en los insectos plaga, aumento en los costos de producción y problemas para la salud humana y animal [5,2].  Unaalternativa son las plantas transgénicas resistentes a insectos. La utilización de cultivos genéticamente modificados(GM) puedecontribuir de manera significativa al manejo integrado de plagas [6,4].

Diferentes versiones de genes derivados de Bacillusthuringiensishan sido transferidos a algodón, tomate, papa y maíz  [7,8]. El gen Btmás usado es el gene cry1Ac, que fue transferido a 15 variedades de algodón, una de tomate y 6 de maíz. Se ha reportado que en estos cultivos controla Heliothisvirescens, Helicoverpazea, Pectinophoragossypiella, Ostrinianubilalis, Diatreagrandiosella y Pseudoplusiaincludens[7,9,10]. En arroz, se han reportado varios trabajos experimentales usando el gen cry1Ac [11,12,13].

Bacillus thuringiensis es un bacilo flagelado, esporulado y gram + que produce durante la esporulación, un cristal de proteína tóxico para los insectos, conocido como delta endotoxina, que puede variar de forma y de tamaño[14,15]. Según el espectro de actividad insecticida que presentan, se clasifican en: Cry I tóxicos para lepidópteros, Cry II tóxicos para lepidópteros y dípteros, Cry III tóxicos para coleópteros,  y Cry IV tóxicos para dípteros [16,17]. Si la proteína es ingerida por un insecto susceptible en su fase larvaria, llega al intestino medio, se disuelve por la acción de los jugos intestinales de pH alcalino, sufre una proteólisis enzimática, origina una toxina activa, que se une a receptores específicos en las membranas epiteliales del intestino, generando poros que desequilibran el balance osmótico y provocan lisis celular,  causando muerte del insecto por inanición [15,18].

Los derechos de propiedad intelectual que se han concedido, en la forma de patentes sobre materia biológica [19], generan redes de patentes que limitan las posibilidades de uso tecnológico del conocimiento. Sobre el gene cry1Ac aparecen 16 reportes en la base de datos “Patentlens” usando la palabra clave “cry1Ac” en el “abstract”, búsqueda realizada el 10 de agosto de 2011 (www.patentlens.net).

Se debe buscar maximizar la libertad de operación, sobre la base de que las patentes: 1)tienen aplicación en jurisdicciones nacionales; 2) las leyes varían de país a país;y 3) son un monopolio limitado y expiran [20].

Los genes Cry se encuentran cercados por una red de patentes, pero gracias a las herramientas de bioinformática, es posible el diseño de genes semisintéticos a partir de secuencias conocidas. Luego se produce una nueva versión optimizada por uso codónico, cuya proteína traducida se analiza in silico. Varias empresas ofrecen la síntesis de secuencias de DNA, mediante un contrato de servicios, en el que se puede solicitar la exclusión de cualquier restricción de uso [21].

El presente trabajo trata sobre el diseño y construcción mediante paquetes bioinformáticos de un gen sintético Cry1Ac, su optimización por el uso codónico del arroz y el posterior análisis in silico de las características de la proteína traducida.El desarrollo de este gen semisintético está orientado a la obtención de plantas transgénicas de variedades colombianas de arroz que presenten resistencia al ataque de plagas de tipo lepidóptero.

MÉTODO

Desarrollo de la construcciónsemi-sintética del gen Cry 1Ac

Se hizo la revisión de literatura correspondiente y la búsqueda de secuencias, para genes que codifiquen la proteína cry1Ac, usando bases de datos de acceso público y/o disponible en el sistema nacional de bibliotecas de la Universidad Nacional de Colombia (SINAB) [22].

Una vez identificadas las secuencias de los genes, se realizo el proceso de diseño y construcción de la versión semi-sintética, empleando los siguientes paquetes: BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html);Lasergene (http://www.dnastar.com/t-products-lasergene.aspx);DNA 2.0 Gene designer(https://www.dna20.com/genedesigner2/);DNAsis SmartNote (http://smartnote.miraibio.com/index.htm).

Empleando estos software se realizo: 1) alineamientos de las secuencias nucleotídicas de los genes seleccionados; 2)establecimiento de una secuencia consenso; 3) selección y establecimiento de las secuencias de la región promotora y terminadora; 4) construcción del casete de expresión mediante el ensamble de las secuencias; 5) cambio de uso codónico para Oryza sativa en la región codificante; 6)ubicación de sitios de restricción dentro de la construcción y elaboración del mapa de restricción [1,22,23,24,25].

Análisis de la proteína CryIGP

Para evaluar la predicción de las modificaciones post-traduccionales, se utilizó la herramienta SIGNAlP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), que predice la presencia y localización del péptido señal y su punto de clivaje. En el análisis de la estructura primaria de la proteína, se utilizaron distintas herramientas de EXPASY, para calcular el peso molecular y el punto isoeléctrico COMPUTE pI/Mw(http://expasy.org/tools/ pitool.html). Para calcular la hidrofobicidad, el porcentaje de residuos accesibles y la tendencia transmenbranal, se usóPROTSCALE(http://expasy.org/tools/protscale.html). La predicción trans-membranal se realizo con los programas TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) y TMPRED(http://www.ch.embnet.org/software/TMPREDform.html).

Los motivos y dominios conservados se analizaron con INTER PRO SCAN(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/). Se realizo un Blastx en la base de datos NCBI de Proteinas no redundantes para buscar secuencias con alto nivel de homologia.

El análisis de la estructura terciaria, se realizo por “threading” utilizando el servidor I-tasser [26,27,28]. Al mejor modelo obtenido por  “threading”, se le realizo una evaluación de la estructura 3D, y una búsqueda de posibles errores, utilizando el algoritmo Rampage Ramachandran [29]. Utilizando el servidor DALI se realizo una comparación de estructuras tridimensionales de todas las proteínas contenidas en esta base de datos [30].

RESULTADOS

Desarrollo de la construcción semi-sintética del gen Cry 1Ac

La revisión bibliográfica se realizo en bases de datos de artículos disponibles vía electrónica de acceso público y en las 62 bases de datos disponibles para el personal de la Universidad Nacional de Colombia. Como resultado de estas búsqueda se encontraron 9 genes cry1Ac de interés, cuyas secuencias fueron empleadas para realizar los alineamientos y determinar una secuencia consenso. La obtención de las secuencias de los genes que resultaron de la revisión de literatura, se hizo en las bases de datos: GeneBank del Centro Nacional de Información en Biotecnología de Estados Unidos(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); EMBL-Bank del Laboratorio Europeo de Biología Molecular y el Instituto Europeo de bioinformática (EMBL-EBI)(http://www.ebi.ac.uk/), y DDBJ  el banco de datos de ADN del Japón(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)[25,22].

Identificadas y definidas las secuencias de los genes Cry1Ac, se realizaron los alineamientos de las secuencias nucleotídicas de los genes seleccionados mediante el programa Clustal W del paquete bioinformático Lasergene: MegAlign, que permite comparar las secuencias entre sí, e identificar diferencias entre ellas, determinando el lugar y el nivel de conservación entre las secuencias alineadas [23,24,25,31].

Unavez alineadas y comparadas las secuencias se estableció la secuencia consenso mediante el paquete bioinformático Lasergene: SeqMan.La secuencia consenso porta la información de la región codificante del gen de interés, y sobre ella se realizaron posteriormente comparaciones con otras secuencias reportadas en las bases de datos, mediante la herramienta BLAST del software DNAsisy dela plataformaNCBI. Esto se hizo para asegurar que no existieran diferencias significativas entre la secuencia consensoobtenida y otras secuencias reportadas para el gen Cry1Ac. Se empleó un bit score alto y un e-value menor al nivel de significancia empleado que fue de 0,05[31,32].

Para el desarrollo de la construcción del casete de expresión se decidió emplear el promotor de la Ubiquitina de maíz y el terminador de la Nopalina sintetasa de Agrobacterium [33].Las secuencias nucleotídicas del promotor y el terminador se buscaron en las bases de datos: GeneBank, EMBL-Bank y DDBJ  [24,34].

Determinadas la secuencias tanto del gen de interés como del promotor y el terminador se procedió a la construcción del casete de expresión, mediante el ensamble de las secuencias, promotor de la Ubiquitina de maíz: secuencia consenso cry1Ac): terminador de la Nopalina sintetasa de Agrobacterium, obteniéndose así la secuencia del gen siemi-sintetico Cry1AcIGP[24,25,32]. Esto se hizo con el programa Lasergene: SeqBuilder.

Finalmente para terminar con la construcción del gen semisintético, denominado Cry1AcIGP a partir de aquí, se realizó un mapa de restricción sobre la secuencia completa empleando el programa BioEdit.Una vez se conoció este mapa se escogieron los sitos de restricción más apropiados para ser introducidos dentro de la construcción, con el fin de facilitar su manipulación[31,32]. Ello se efectuó  mediante el programa DNA 2.0 Gene designer.

Una vez introducida esta modificación final a la secuencia se obtuvo la construcción definitiva del gen semisintético Cry1AcIGP(Figura 1).

Análisis de la proteína CryIGP

Según la predicción para péptido señal, basada en “redes neuronales”, hay valores suficientemente altos de score, como para considerar la presencia de péptido señal. En la predicción hecha con los modelos escondidos de Markov, se determino que la probabilidad de encontrar péptido señal en la proteína CryIGP es de 0.39, y que el punto de clivaje estaría en el aminoácido numero 24. Adicionalmente la herramienta compute pI/Mw permitió el cálculo teórico del punto isoeléctrico y el peso molecular de la proteína CryIGP los cuales son: pI/Mw: 5,47 / 72985,07 [39,40,41]. Con base en estos datos se puede afirmar que la proteína CryIGP, posee péptido señal.

En el perfil de hidrofobicidad los picos más altos muestran las zonas de la proteína que tienden a ser hidrofóbicos. En la grafica resultante (datos no mostrados),  no se muestra una tendencia de la proteína a estar en la membrana celular, ya que presenta tanto picos negativos como positivos.

La predicción trans-membranal realizada con TMHMM es más precisa para el análisis, ya que esta no muestra la tendencia de los aminoácidos, sino que arroja la probabilidad de encontrar la proteína, dentro, entre o fuera de la superficie celular. Según la grafica lo más probable es que la proteína sea extracelular, además que la probabilidad de encontrar hélices trans-membranales es de 0,4, es la predicción basada en las regiones de la proteína que abarcan la membrana y su orientación en esta misma [42]. Es posible afirmar de acuerdo con estos resultados que el ánimo terminal se encuentre al exterior de la membrana y que en la secuencia  se hallan 3 hélices trans-membranales. 

El análisis de la estructura secundaria de la proteína CryIGP, arrojo un  porcentaje de 36,09% para un alfa hélice en la posición 262; un porcentaje de 20,39% para una cadena extendida en la posición 148; una lamina beta con un porcentaje de 8,40% en la posición 61 y por ultimo “random coil” en la posición 255 con un  porcentaje de 35,12%. Las hélices hidrofóbicas y anfipaticas sugieren que este dominio puede ser responsable para la formación de poros en el epitelio intestinal del organismo susceptible [43]. Adicionalmente al comparar los sitios conservados de la proteína CryIGP, con los reportados para otras proteínas Cry, esta presenta varios dominios para endotoxinas, en especial un dominio de unión  a la galactosa.

En el alineamiento múltiple de proteínas, se encontraron varias proteínas Cry con un “E-valué” del 0,0 % (Figura 2), lo que indica que no se presenta ninguna diferencia en comparación con la proteína CryIGP.

El cuadro1 muestra los mejores resultados del alineamiento múltiple de la proteína.  Blastx es un algoritmo que permite comparar una secuencia de nucleótidos con la base de datos para secuencias de aminoácidos para buscar homologías [46]. La evaluación de estos alineamientos se realizo con la matriz de substitución blosum62. Esta matriz evalúa los alineamientos y calcula el bitscore y el e-value de cada alineamiento. Los alineamientos con un valor de bitscore alto y e-value pequeño, representan homologías  significativas estadísticamente, confirmando la veracidad del alineamiento. Todos los alineamientos presentes en el cuadro 1  tienen un e-value igual a cero. Esto indica que la probabilidad de encontrar dicho alineamiento al azar es cero y que estos alineamientos reflejan verdaderas homologías.

En el modelamiento 3-D por “threading”, se obtuvieron cinco resultados posibles, el que presento mayor score fue de 0,47 (datos no mostrados), mientras que los sitios de unión se establecieron en los aminoácidosGLN:160  ASN:161  TYR:162  GLN:163  VAL:164 ARG:218TRP:219   ASN:221  THR:222  GLY:223   LEU:224   GLU:225   ARG:226 TRP:228 [26,27,28].

Para evaluar la calidad de la estructura 3D modelada, se realizo una evaluación de la posición espacial de los residuos que forman la proteína, mediante el servidor Rampage Ramachandran. Este servidor se basa en los ángulos de torsión para cada residuo en la estructura de la proteína. Los enlaces peptidicos tienden a ser planos con dos organizaciones espaciales permitidas, trans= 1800 y cis= 00. Según la grafica de Ramachandran, la distribución de más del 98% de los aminoácidos se encuentra en regiones favorables, esto es un indicio de la calidad estereoquímica del modelo analizado [29].

Matemáticamente, el gráfico de Ramachandran es la visualización de una función. La glicina tiene un átomo de hidrógeno, con un pequeño radio de van der Waals, en lugar de un grupo metilo en la posición ß. Por lo tanto, es menos restringido y esto se puede comprobar en el gráfico de Ramachandran de glicina para que el área permitida sea considerablemente mayor. En contraste, el gráfico de Ramachandran de prolina muestra sólo un número muy limitado de combinaciones posibles de ψ y φ.

A pesar del cambio en la estructura de las proteínas como resultado de la evolución, existen patrones de organización en los residuos de las proteínas, entonces la estructura de las proteínas puede ser identificada mediante la detección de estos patrones conservados. La matriz de alineamiento a distancias DALI, rompe la estructura en hexapeptidos y calcula una matriz de distancia evaluando los patrones de contacto entre fragmentos sucesivos [48,49].

En la figura 2  se muestra 3 alineamientos a distancia usando la matriz DALI, donde la estructura 3D de la proteína CryIGP fue comparada con 3 proteínas Cry(CryIA, CryIIIA y Cry3bb). Se encontró que las proteínas comparten las mismas características o tienen similares características en aproximadamente las mismas posiciones, como también puede decirse que tienen similares plegamientos con bucles de longitud similar conectando sus elementos de estructura secundaria.

CONCLUSIONES

Se obtuvo una versión semisintética del gene Cry1Ac, con modificaciones en su secuencia, resultantes tanto de la obtención de la secuencia consenso como de la optimización por uso codónico del arroz. Esta versión, aquí denominada Cry1AcIGP,  difiere mínimo un 12% con respecto a secuencia reportadasanteriormente.

El modelamiento molecular y bioinformático permite no solamente predecir la estructura tridimensional de la proteína CryIGP, sino también definir su función. Los dominios y sitios conservados indican su naturaleza de endotoxina con propiedades  insecticidas y a su vez su gran parecido con proteínas producidas por la bacteria gram negativa Bacillus thurigensis.

Con el análisis de la estructura primaria, se confirmo que esta es una proteína extracelular, la cual actúa como toxina en diferentes grupos de insectos. El análisis de la estructura secundaria, permitió identificar los dominios conservados, los cuales permiten predecir su función y papel como toxina. Los análisis de alineamiento múltiple, confirmaron la relación de la proteína Cry IGP, con otras endotoxinas reportadas, como también una muestra significativa de la diversidad de esta proteína en la naturaleza.

Es clave realizar el estudio detallado, mediante el uso de herramientas bioinformáticas, de la estructura de las proteínas resultantes de genes semisinteticos, lo cual permitirá determinar de una forma presuntiva el buen diseño y expresión del gen.

AGRADECIMIENTOS

Al Biólogo Alejandro Rodríguez por su valiosa asesoría y colaboración para el desarrollo de este trabajo. Al convenio firmado por  FEDEARROZ y la Universidad Nacional de Colombia para el desarrollo de sistema de ingeniería genética para cultivares colombianos de arroz, que financiaron este trabajo.

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