Cuadro 2

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador PTC 100 Programmable Termal Controller (MJ. Research, Inc), en el laboratorio de molecular. La desnaturalización inicial fue a 95°C durante 5 min; desnaturalización a 95°C por 30 seg, hibridación a una temperatura de 50°C (cebador AG y CA), 55°C (cebador CCA-TG-CT) y 58 °C (cebador GT-CGA) durante 45 seg, una extensión de 72°C por 2 min, 37 ciclos desde la desnaturalización a extensión y por último una extensión a 72°C durante 7 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida 37:1 (acrilamida: bisacrilamida) al 7% a 150v por 1 h en una cámara pequeña de DNA Sequencing System, FB-SEQ-3545 de Fisher Biotechnologies. La tinción se realizó usando sales de plata.

Análisis Estadístico

Se generó una matriz binaria de ausencia (cero) y presencia (uno). La similitud genética entre los individuos se calculó utilizando el coeficiente de similitud de Nei y Li (1979) [12]. El análisis de agrupamiento se realizó por el método UPGMA y se generó un dendrograma utilizando el paquete estadístico NTSYS (Numerical Taxonomy System for personal Computer, versión 2.02 PC). Para evaluar la diversidad genética se estimó la heterocigosidad insesgada y el porcentaje de loci polimórficos utilizando el paquete estadístico TFPGA (Tools For Population Genetic Analices, versión 1.3, 1997). Se determinó el F estadístico insesgado con un intervalo de confianza del 95%. Para el Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) se utilizó el programa GenAlEx 6.41.

RESULTADOS

El análisis mediante el coeficiente de Nei-Li (1979) [13], a un nivel de similitud de 0,50, diferenció a los ecotipos en cinco grupos (Figura 1).

El dendrograma muestra que las agrupaciones corresponden al sitio en donde fueron colectados los ecotipos, y además, se puede observar las relaciones que existen entre los cultivares de Rubus glaucus y los silvestres Rubus spp, lo cual refleja un pequeño flujo de genes como resultado quizás del mecanismo de reproducción.

Sin embargo, dentro de cada sitio de colecta las especies cultivadas presentaron valores de similitud comprendidos entre 0,60 a 0,80, resultados que concuerdan con los obtenidos por Morillo et al. (2005) [3], quienes evaluaron 36 ecotipos de Rubus spp y encontraron un valor de similitud de 0,60 entre los individuos pertenecientes a Rubus glaucus. Resultados que contrastan con los obtenidos por Marulanda et al. (2012) [5], quienes encontraron valores de similitud mayores al 95% en cultivares de mora (R. glaucus). La variación en la especie Rubus glaucus, ya sido reportada y puede deberse a su sistema de reproducción así como a la forma como se diseminan sus semillas, la cual normalmente la realizan los pájaros, su nivel de alogamia, la selección de materiales silvestres por parte de los agricultores por características como sanidad, tamaño y número de frutos, sabor, etc [3]. También se puede observar que algunos materiales de R. glaucus, no tienen relación aparente con el origen geográfico de los genotipos [3].

Estudios en Rubus Europeas concluyen que la variabilidad está influenciada por el sistema de reproducción de las plantas, por el efecto de la polinización cruzada entre las especies de Rubus poliploides, lo cual influye en la calidad de la semilla [4].

Los siete cebadores RAMs utilizados para la caracterización molecular de los ecotipos de Rubus, generaron una matriz de 3549 entradas y se obtuvieron 169 bandas, de cuales 160 reflejan el 95% de polimorfismo. El número de bandas por cebador varió de 16 para el ACA y 27 para el CGA, con pesos moleculares entre 300 y 1400 Kb. Al compararlos con los resultados obtenidos en otros trabajos de diversidad genética en donde se han utilizado estos marcadores microsatélites aleatorios Mandarina [14], cacao [15], mora [3] como también en otros estudios moleculares de Rubus [4,5] el número de bandas encontrado en este estudio se considera adecuado para estimar los parámetros genéticos.

El porcentaje de loci polimórficos para los siete cebadores estuvo en un rango comprendido entre el 62% (ACA) y el 98% (CT), con una heterocigosidad promedio esperada de 0,20 a 0,8 para los cebadores ACA y CT, respectivamente. El cebador CCA fue el que mayor aporte hizo a la variación genética encontrada, con un Fst de 0,53 (Cuadro 3), lo cual significa que puede ser útil para lograr una diferenciación entre los ecotipos del género Rubus. Para la población total, el porcentaje de loci polimórficos y la heterocigosidad promedio esperada (He) fueron de 88% y 0,29, en su orden. El coeficiente de diferenciación genética (Fst) obtenido al evaluar los ecotipos de Rubus, con los siete marcadores microsatélites RAMs fue de 0,29 con una desviación estándar de 0,03 (Cuadro 3). Según Wright (1978) [16], valores mayores de 0,25 muestran una gran diferenciación genética, la cual está asociada con el nivel de estructuración de la población que tiende a estabilizarse. Lo anterior significa que aunque las poblaciones de mora por el tipo de propagación por parte de los agricultores, tiende a la homogeneidad, se encontró variabilidad genética la cual debe ser conservada e incorporada en programas de mejoramiento genético.

Cuadro 3

En estudios de caracterización de la diversidad genética en Rubus spp, con microsatélites codominantes, se han obtenido altos porcentajes de loci polimórficos y altos valores de heterocigosidad, por ejemplo Marulanda et al. (2012) [4], usando 20 SSRs caracterizaron 44 genotipos de Rubus glaucus colombianos, colectados en ocho departamentos diferentes. Las poblaciones del Valle del Cauca, Quindío, Caldas y Risaralda mostraron los valores más altos (He= 0,50, 0,49, 0,47 y 0,45, respectivamente). Resultados similares a los encontrados en ste estudio fueron reportados por Somayeh et al. (2014) [17], quienes evaluaron un total de 65 muestras de Rubus que fueron colectadas en diferentes altitudes en el región Norte de Irán, encontrando que los valores de heterocigosidad esperada estaban comprendidos entre 0,14 a 0,29. Lee et al.(2015) [18], desarrollaron nuevos marcadores microsatélites a partir de de Rubus coreanus y probaron su transferibilidad a otras especies de Rubus, encontrando valores promedios de heterocigosidad observada y esperada de 0,56 y 0,54. Los anteriores estudios ponen de manifiesto la gran diversidad genética del género Rubus lo cual se refleja por su gran plasticidad fenotípica y molecular.

Estudios de caracterización molecular con microsatélites aleatorios RAMs de la colección de mora, Rubus spp, de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, encontraron valores de heterocigosidad promedio de 0,31, lo que revela el gran polimorfismo genético, que puede estar asociado con la naturaleza alógama de la especie, la cual tiende a favorecer la conservación de un alto porcentaje de heterocigotos, así como también a la presenca de algunas accesiones silvestres (R. urticifolius) [3].

La diferenciación entre poblaciones, esta determinada por el índice de fijación (Fst) el cual puede variar de 0 a 1. Valores cercanos a cero indican un gran número de heterocigotos mientras que valores más altos indican un mayor número de homocigotos. El valor de Fst fue de 0,29 que según Wright (1978) [16], muestra gran diferenciación genética y ayuda a entender la dinámica espacio-temporal de las especies de mora (Rubus spp) así como la estructura de cruzamientos entre ellas. Estudios de diversidad genética en especies silvestres y cultivadas de Rubus en Colombia, realizados por Marulanda et al. (2012) [4], ponen de manifiesto la alta diferenciación genética entre las especies evaluadas, además resulta muy interesante conocer como los patrones reproductivos de estas plantas afectan su variabilidad genética. El análisis de Varianza Molecular (AMOVA) para los ecotipos de Rubus evaluados mostró que la variación obedece a diferencias de los individuos dentro de cada uno de los grupos conformados,que correpondió a una varianza del 77% dentro de grupos. Esta alta variación podría indicar la existencia de niveles de subdivisión y jerarquización mayores a los considerados en este estudio y el 23% restante se debió al componente de varianza genética entre grupos, la cual fue significativa (P≤ 0,001) (Cuadro 4) indicando que existe diferenciación genética molecular entre los grupos formados, que debe ser aprovechada dentro de los programas de mejoramiento genético de la especie. Resultados similares se han obtenido en estudios realizados en moras en el país por Morillo et al. (2005) [3], Marulanda et al, (2009, 2012) [4,10].

Cuadro 4

Sedighi et al.(2015), [6], concluyeron que la variabilidad genética en Rubus está determinada por el sistema de propagación de las plantas y demostraron que hay un efecto de la polinización cruzada entre las especies poliploides de Rubus. Este tipo de cruzamientos influencia positivamente la calidad de la semilla y del fruto, mientras incrementa los niveles de ploidía y la proximidad taxonómica. Las formas silvestres se encuentran usualmente en sitios donde las especies de Rubus son cultivadas, particularmente en los claros de bosques, orillas de carreteras y en laderas. Tanto formas cultivadas como silvestres tienen un potencial para interactuar de diferentes maneras. Los cultivares pueden influenciar la diversidad genética de las poblaciones naturales a través de la transferencia de genes por el polen y las poblaciones silvestres son una fuente potencial de material genético para los programas de mejoramiento.

Los resultados encontrados en este y en otros estudios de diversidad genética en el género Rubus se ven influenciados por el sistema de reproducción tan complejo que presentan las especies. Marmolejo [19], estudió el modo reproductivo de ocho ecotipos de mora de Castilla de la colección de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira, encontrando que estos son apomícticos facultativos, lo cual es debido a su origen alotetraploide con alta homeología cromosómica, observándose un tipo de apomixis llamado aposporia. Además realizó una evaluación de la variabilidad genética con cuatro cebadores RAMs en cinco progenies de medios hermanos de los ocho ecotipos y en todos se registró variabilidad genética y algunas plantas presentaron el mismo patrón, éstas probablemente pueden provenir de apomixis. Concluyendo que de acuerdo al tipo de apomixis observada,la sexualidad, al alta viabilidad polínica, la variabilidad genética y la importancia del polen para la formación de infrutescencias y semillas, se determinó que los ocho ecotiposd se reproducen por la vía sexual y por aposporia pseudogámica un proceoso característico de las moras apomícticas.

La caracterización del estado de los recursos fitogenéticos de las especies de R. glaucus y especies silvestres relacionadas proporciona un lineamiento para los programas de conservación y mejoramiento, a la vez que promueven el desarrollo de esta especie en el país. Colombia es uno de los países con la mayor oferta de suelo y clima del mundo para el cultivo de frutas tropicales durante todo el año desde el nivel del mar hasta los 2800 metros de altitud. Esto constituye gran parte de las ventajas comparativas y competitivas que tiene el país para desarrollar la fruticultura, especialmente en el departamento de Boyacá. Por lo anterior, cultivos como la mora son una alternativa económicamente rentable para la región, siempre y cuando se cuente con la disponibilidad de materiales genéticos con buenas características organolépticas, que respondan a las exigencias del mercado.

CONCLUSIONES

La evaluación de la diversidad genética de los ecotipos de mora en el Departamento de Boyacá formó agrupaciones de acuerdo al sitio geográfico en donde estos fueron colectados.

Los valores de loci polimórficos y heterocigosidad fueron más bajos que los reportados en otros estudios de caracterización molecular con microsatélites en especies del género Rubus. Se encontró que la variabilidad genética observada se debe a la diferenciación dentro de cada uno de los grupos formados lo cual sugiere niveles de jerarquización o una subdivisión mayor a la considerada en este estudio.

Por lo anterior, la variabilidad genética encontrada en la zona de estudio es baja, por lo cual es necesario implementar estrategias que conduzcan a aumentar la variación en esta especie sin embargo hay diversidad que debe ser conservada y aprovechada para la identificación de materiales adaptados a la región.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración de los laboratorios de investigación en Biología Molecular de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.

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