DOI: http://dx.doi.org/10.18684/BSAA(15)11-21

¹Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia. Grupo de Investigación en Fisiología y Etología Animal - Procesos Biotecnológicos Aplicados a la Producción Animal (FISE-PROBIOTEC). Ph.D en Ingeniería de Alimentos. Pasto, Colombia.

²Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia. Grupo de Investigación en Fisiología y Etología Animal - Procesos Biotecnológicos Aplicados a la Producción Animal (FISE-PROBIOTEC). Zootecnista. Pasto, Colombia.

Correspondencia: henryjugam@gmail.com

Recibido para evaluación: 17 de agosto de 2016 Aprobado para publicación: 1 de Marzo de 2017.

RESUMEN

Los problemas sanitarios principalmente la falta de una farmacología específica, afectan los parámetros productivos y la rentabilidad de las producciones de cuy (Cavia porcellus) en el departamento de Nariño. Razón por la cual, se plantean nuevas alternativas que promueven una producción más limpia mediante el uso de probióticos de bacterias ácido lácticas (BAL). Por lo tanto, se evaluó el efecto in vivo de la administración de L. plantarum en cuyes como alternativa al uso de antibióticos, en dos tipos de dieta comerciales. Se determinaron péptidos por HPLC en el sobrenadante, resistencia a pH básicos, análisis de los parámetros zootécnicos, pruebas de laboratorio (cuadro hemático, química sanguínea, parcial de orina y coprológico) antes y después de la administración a los animales seleccionados; además, se analizó la eficacia de su colonización mediante pruebas de histopatología, histoquímica, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido. La ganancia de peso (GPT) y la conversión alimenticia (CA) presentaron diferencias estadísticamente significativas entre dietas. También diferentes grados de severidad y tipo de lesiones en los tejidos intestinales. Se observaron bacterias adheridas a la vellosidad con la tinción de Gram y la microscopia electrónica de barrido. El Ácido peryódico de Schiff (PAS) fue positivo para todos los tratamientos y la inmunomarcación fue leve, moderada o fuerte dependiendo del segmento intestinal.

PALABRAS CLAVE:Farmacológicos, Bacterias lácticas, Lactobacillus plantarum

ABSTRACT

Health problems mainly the lack of a specific pharmacology, affect the production parameters and the profitability of productions guinea pig in the department of Nariño. Which is why, new alternatives that promote cleaner production through the use of probiotic lactic acid bacteria (LAB) are raised. Therefore, the in vivo effect of L. plantarum administration in guinea pigs of alternative to antibiotics in two different diets was assessed. peptides by HPLC was determined in the supernatant, resistance to basic pH, analysis of zootechnical parameters, laboratory tests (Table hematic, blood chemistry, partial urine and stool) before and after administration to the further selected animals was analyzed effectiveness by colonization tests histopathology, histochemistry, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. GPT and CA statistically significant differences between diets. Also different degrees of severity and type of injury in the intestinal tissues adherent bacteria was observed hairiness with Gram staining and scanning electron microscopy. The PAS was positive for all treatments and immunostaining was mild, moderate or severe depending on the intestinal segment.

KEY WORDS:Pharmacological, Lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum.

RESUMO

Problemas de saúde, principalmente, a falta de uma farmacologia específica, afetam os parâmetros de produção e a rentabilidade das produções cuy no departamento de Nariño. Eé por isso, novas alternativas que promovam a produção mais limpa por meio do uso de bactérias lácticas probióticas (BAL) são levantadas. Portanto, foi avaliado o efeito in vivo da administração de L. plantarum em cobaias de alternativa aos antibióticos em duas dietas diferentes. péptidos por HPLC foi determinado no sobrenadante, foi analisada a resistência a pH básico, a análise de parâmetros zootécnicos, testes laboratoriais (Quadro hemático, química do sangue, urina e fezes parcial) antes e após a administração aos animais mais seleccionados eficácia por meio de testes de colonização histopatologia, histoquímica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura. GPT e CA diferenças estatisticamente significativas entre as dietas. Também diferentes graus de gravidade e do tipo de les ão nos tecidos intestinais. bactéria aderente foi observada pilosidade com coloração de Gram e microscopia eletrônica de varredura. O PAS foi positivo para todos os tratamentos e imunocoloração era ligeira, moderada ou grave, dependendo do segmento intestinal.

PALAVRAS-CHAVE:Farmacológicos, Bacterias lácticas, Lactobacillus plantarum

INTRODUCCIÓN

Los probióticos son alternativas al uso de antimicrobianos, y se caracterizan por ser un producto natural y sin riesgo para la salud del consumidor [1]. Se ha observado que modulan la respuesta inmune a nivel de la mucosa intestinal y a nivel sistémico, corrigen la disbiosis intestinal y ejercen un efecto antimicrobiano en patógenos entéricos [2]. Los probióticos también han mejorado la producción de mucinas en las células epiteliales del intestino, que sirven como una barrera antibacteriana que impiden la unión de patógenos [3], soportan las condiciones gastrointestinales [4], y mejoran parámetros productivos [5].

Por lo tanto, esta investigación tiene como objetivo determinar el efecto in vivo de la administración de L. plantarum en cuyes en fase de levante.

MÉTODO

Localización

La investigación se realizó en el Laboratorio del Grupo de Investigación FISE – PROBIOTEC Universidad de Nariño y en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Caldas.

Microorganismo utilizado

Se usó la cepa Lactobacillus plantarum ATCC® 8014 [6].

Cultivo del inóculo de L. plantarum

Según la metodología de Crueger y Crueger [7], y se ajustó mediante Guerrero citado por Montes et al [8].

Identificación de péptidos en el sobrenadante y ácido láctico en carne mediante HPLC – DAD

Según las especificaciones de Jurado et al., [9].

Cinética de fermentación

Para realizar los inóculos se tuvo en cuenta los resultados obtenidos por Jurado et al., [9].

Resistencia a diferentes pH

Se ajustó a valores de 7, 9 y 10 con NaOH, las muestras se incubaron a 37°C por 12 h y se hizo recuento de unidades formadoras de colonia (UFC) viables en placa.

Ensayo in vivo

Se usaron 24 cuyes machos destetos, de línea mejorada de la Universidad de Nariño. Se adaptaron por 5 días y se realizó el ensayo por 45 días (fase de levante).

Los tratamientos fueron: T1, Alimento balanceado, forraje y administración de agua destilada estéril (placebo); T2, alimento balanceado, forraje y administración de L. plantarum; T3, forraje y agua destilada estéril. T4, forraje y L. plantarum.

Administración del inóculo

Se suministraron 5 mL/animal/día mediante gotero en dos tomas (2,5 mL), la primera a las 8:00 am y la segunda a las 6:00 pm. Las dietas fueron: Dieta con alimento balanceado (300 g de forraje y 35 g de alimento balanceado); Dieta solo con forraje (350 g de forraje).

Se utilizó una concentración de L. plantarum mayor a 109 UFC/g. Además, se realizó semanalmente conteo de UFC y tinción de Gram para verificar su pureza.

Determinación de parámetros zootécnicos

Consumo de materia seca (CMS). Se determinó por diferencia entre el alimento ofrecido y el alimento rechazado en un periodo de 24 horas.

Ganancia de peso (GP). Se determinó por la diferencia entre el peso final menos el peso inicial.

Conversión alimenticia (CA). Se determinó mediante las razón entre el consumo de materia seca (forraje y balanceado) y la ganancia de peso.

Pruebas de laboratorio. Se efectuó cuadro hemático, química sanguínea: BUN (nitrógeno ureico en sangre) y creatinina, parcial de orina y coprológico. La toma de muestra de sangre fue por punción intracardiaca, la orina por cistocentesis y las heces directamente del colon al momento del sacrificio.

Evaluación microscópica de tejidos

Sacrificio. El sacrificio de los animales se realizó mediante dislocación cervical.

Técnica de muestreo y toma de muestras. El muestreo se efectuó de acuerdo con la Técnica de Necropsia en Cuyes [10]. Las muestras del tracto gastrointestinal y órganos se colocaron en formol buferado al 10% para su fijación durante 24 h, luego se realizaron cortes de duodeno, yeyuno e íleon y fueron ubicados en cassettes para inclusión de tejidos debidamente rotulados, para ser procesados mediante la técnica de inclusión en parafina y coloración de Hematoxilina y Eosina (H/E). La descripción y evaluación histológica se hizo en el microscopio con los objetivos 4X, 10X y 40X. Para la evaluación se tuvo en cuenta los criterios de Jubb et al., [11].

Tinciones especiales. Las tinciones diferenciales fueron: Tinción de Gram para bacterias Gram positivas y/o negativas; Ácido peryódico de Schiff (PAS) para detección de glucógeno y carbohidratos. Estas láminas se realizaron en la Corporación Patológica Veterinaria - Corpavet®, en la ciudad de Bogotá, Colombia.

Inmunohistoquímica. Para precisar los hallazgos se emplearon marcadores histoquímicos: CD45, CD3 y CD79a.

Microscopia electrónica de barrido. Las muestras de los segmentos conservadas en alcohol al 90° fueron analizadas en el Laboratorio de Microscopia electrónica de la Universidad de Caldas, utilizando el protocolo para el procesamiento de este tipo de muestras definido por dicho Laboratorio.

Análisis estadístico. Las variables CMS, GP y CA fueron analizadas mediante análisis de varianza con el procedimiento PROC GLM del paquete SAS [12]. El peso inicial se incluyó como covariable para CMS. La comparación de medias se realizó con el procedimiento LSMEANS a un nivel de significancia del 5%.

Para la caracterización histológica del tracto gastrointestinal se empleó estadística descriptiva (tablas de frecuencia) y registro fotográfico de todo el proceso.

RESULTADOS

La muestra coincidió con el estándar en el pico 6 con un tiempo de retención de 11,95 min, que corresponde al péptido VAL-TIR-VAL, con concentración de 0,60 mg/mL (Figura 1).

Figura 1

Resistencia a pH 7, 9 y 10

Se observaron crecimientos hasta diluciones de 1012 a pH 7 y 9, con valores de 6x1012 y 4x1013 UFC/100 mL respectivamente. Mientras que a pH 10 solo se observó crecimientos hasta la dilución 107 con valor de 6x107 UFC/100 mL.

La resistencia a medios básicos es una característica importantes en la determinación de una BAL probiótico, puesto que necesita llegar al final del intestino delgado y ciego para ejercer efecto inmunomodulador del epitelio intestinal [13].

Ensayos de desafío in vivo

Durante el suministro del inóculo y el agua, no se observó reacciones adversas en los animales y tampoco se presentaron problemas respiratorios por bronco aspiración.

Parámetros zootécnicos. En el cuadro 1 se observa los parámetros productivos obtenidos.

Cuadro 1

Consumo de Materia Seca. No hubo diferencias (p>0,05) entre dietas; siendo similar al obtenido por Guevara y Carcelén en cuyes machos de 28 días de edad con suministro de Lactobacillus y levadura. De acuerdo con Sáez-Lara et al. [15], el suministro de probióticos no afecta el consumo, mostrando que no altera las funciones digestivas.

Ganancia de peso y Conversión Alimenticia. Se observa que los tratamientos T3 y T4 ganaron menor peso, este comportamiento responde al suministro de suplemento; dado que estos no fueron suplementados; por otra parte, la administración del probiótico no muestra un efecto sobre la variable debido a que también se presentó una disminución en la ganancia de peso del tratamiento con suministro de L. plantarum. Al respecto Torres et al [16], mencionan que el probiótico no tiene un efecto sobre la ganancia de peso en mascotas o cepas de experimentación. La conversión alimenticia mostró similar comportamiento.

Los resultados del hematograma se observan en el cuadro 2. Se encontraron valores mayores de hematocrito que el intervalo de referencia, a excepción del tratamiento 2, el cual se encuentra dentro del rango. Por el contrario, los valores de leucocitos fueron menores que los de referencia a excepción del tratamiento 3. Para plaquetas únicamente los valores de los tratamientos 2 y 4 son bajos, los demás se encuentran dentro del rango de referencia.

Cuadro 2

Los valores para proteínas totales se hallan dentro de los valores normales a excepción del tratamiento 5, los cuales son altos. Para los neutrófilos de segunda línea se obtuvieron valores bajos solamente para el tratamiento 3, los demás resultados se encuentran en el rango normal. Para linfocitos los valores fueron normales a excepción de los resultados del tratamiento 3 el cual fue alto. Los resultados para monocitos fueron bajos en comparación con los de referencia para todos los tratamientos a excepción del 4. Los basófilos fueron normales en todas las muestras evaluadas. Finalmente los valores encontrados para linfocitos absolutos fueron menores al rango de referencia.

Química sanguínea: BUN – Creatinina. En el cuadro 3 se indican los resultados de BUN y creatinina de los cuyes estudio.

Cuadro 3

El rango de referencia fue determinando según Washington y Van Hoosier [17]. El valor de creatinina (mg/dL) del tratamiento 1 se halla dentro del rango referenciado, mientras que los resultados de los demás tratamientos fueron menores al rango de referencia.

Con respecto al BUN (mg/dL) los resultados para todos los tratamientos fueron altos en comparación con los valores de referencia.

Orina. Los valores de referencia se relacionan según los estudios realizados por Bishop et al [18]. El aspecto macroscópico de la orina para todas las muestras fueron normales. Con respecto al análisis fisicoquímico, los resultados para proteínas, pH y densidad se encuentran dentro del rango de referencia.

Coprológico. El aspecto macroscópico del coprológico fue de color marrón oscuro, consistencia líquida y la presencia de moco, esta última característica se debió a que la muestra fue tomada directamente del colon.

El análisis microscópico identificó quistes de Isospora sp., se apreciaron en los tratamientos 1 y 2; quistes y trofozoitos de Balantidium coli en el tratamiento 3; se identificaron trofozoitos ciliados en una muestra de los tratamientos 2 y 3. Los leucocitos se observaron entre 1-3 por campo en los tratamientos 2 y 3 y 0-1 leucocitos por campo en los tratamientos 1 y 4. Se apreció una cruz para levaduras en todas las muestras a excepción del tratamiento 1. Finalmente se presentaron dos cruces para bacterias solamente en el tratamiento 4.

Evaluación microscópica de tejidos

La descripción general de las lesiones encontradas en las láminas de hematoxilina y eosina de cada uno de los segmentos y su respectivo porcentaje se aprecian en la Figura 2.

Los resultados señalados anteriormente permiten inferir que el tratamiento 1 y 3 (controles dentro de cada dieta), evidencian hallazgos, que pudieron ser generados probablemente por el suministro continuo de agua debido a que estos animales no están acostumbrados a tomar agua de forma directa, además no es parte de la dieta normal que les brindan en el lugar de origen. La necesidad de agua de bebida en los cuyes está supeditada al tipo de alimentación que reciben. Si se suministra un forraje suculento, la necesidad de agua es suplida [19].

Por otro parte, los tratamientos 2 y 4 presentaron diferentes tipos de lesiones y distintos grados de severidad, con mayor porcentaje en el tratamiento 4. Esto posiblemente se deba a diferencias en la constitución de las dietas, sobre todo por el alimento balanceado suministrado, el cual presenta coccidiostatos y promotores de crecimiento en su composición. Es posible que exista un desequilibrio de las bacterias protectoras y patógenas a lo largo del intestino llamado disbiosis, la cual puede ser generada por los componentes del alimento antes mencionados, sobre todo por la administración de antibióticos [20].

Los hallazgos encontrados en el análisis de las láminas de hematoxilina y eosina no podrían ser atribuidos únicamente a la bacteria láctica sino tal vez a la interacción con el medio de crecimiento PRO en el cual se encontraban o proliferaban bacterias patógenas. La composición del medio PRO pudo generar lesiones, ya que sus ingredientes no corresponden a la dieta normal de esta especie y probablemente causaron irritación en los tejidos del intestino, igualmente que el agua suministrada.

En las Figura 3 se aprecia el segmento duodeno con leve enteritis necrótica crónica mononuclear,observado en el tratamiento 2.

Figura 3

En la Figura 4 se aprecia el segmento yeyuno con moderada enteritis necrótica aguda mononuclear en el tratamiento 4

Figura 4

En las Figura 5 se aprecia el segmento yeyuno con severa enteritis necrótica aguda mononuclear para el tratamiento 4.

Figura 5

Evaluación de láminas de histoquímica

Tinción de Gram. En la Figura 6 se aprecia duodeno del tratamiento 3 (A) y yeyuno del tratamiento 4 (B). Según la morfología el círculo rojo representa a las bacterias Gram negativas (patógenas) y con circulo negro bacterias Gram positivas (bacterias lácticas).

Figura 6

La tinción de Gram permitió observar la presencia de bacterias que posiblemente puedan corresponder a Gram positivas o negativas con morfología bacilar o de cocos adheridas a la vellosidad y libres en el lumen; las que están adheridas posiblemente estén implicadas en las lesiones y las otras representen una contaminación.

Tinción con Ácido peryódico de Schiff (PAS). En la Figura 7 se presenta los tejidos de duodeno y yeyuno del tratamiento 1. Las flechas color naranja señalan las células caliciformes encontradas en cada segmento.

Figura 7

Esta tinción fue positiva para todos los tratamientos, la mucina tiene la misma intensidad en todos los segmentos, probablemente la mucina observada sea normal, igual que el número de células caliciformes. Ciro, López y Parra encontraron que la adición de probióticos favorece la producción de mucinas en vellosidades y criptas de íleon [21].

Inmunohistoquímica. Se valoró como leve, moderada, fuerte y negativo cuando no se presentó marcación.

Inmunomarcación con CD45. La marcación fue leve y negativa en algunos tratamientos y segmentos. En la Figura 8 se observa los resultados; A control positivo (nódulo linfático humano) y B leve inmunomarcacion (flechas amarillas) del íleon del tratamiento 4.

Figura 8

Inmunomarcación con CD3. En la Figura 9 se indica la marcación para linfocitos T. Inicialmente la imagen (A) corresponde al control y la (B) al segmento íleon del tratamiento 4 con fuerte inmunomarcación (flechas rojas).

Figura 9

Inmunomarcación con CD79a. En la Figura 10 se indica la imagen (A) el control positivo y la (B) se aprecia fuerte inmunomarcación (flechas rojas) en duodeno del tratamiento 3.

Figura 10

La inmunomarcacion observada puede ser una respuesta al daño tisular generado por las lesiones encontradas en los tejidos, un probable crecimiento bacteriano o una reacción con el medio de cultivo suministrado.

Microscopia electrónica de barrido. En la Figura 11 se muestra distintos aspectos de las vellosidades y la adherencia bacteriana.

Figura 11

Se aprecia una arquitectura normal de la punta de la vellosidad del intestino delgado. Sin embargo se observa un moderado acortamiento de las vellosidades y presencia de múltiples estructuras de forma cocobacilar adheridas. Estos microrganismos que se observan adheridos probablemente puedan ser BAL y/o patógenas, además estos resultados están correlacionados con los obtenidos en el análisis de las láminas de hematoxilina y eosina (identificación de diferentes grados de enteritis) y la tinción de Gram realizada.

Determinación de ácido láctico en la carne mediante cromatografía por gases. Se evidenció la presencia de ácido láctico en la carne de cuyes suplementados con cepas probióticas, con valores de 0,99 y 1,62 mg/g de carne; mientras que en los animales control no fue detectado. Se reportan estudios sobre la importancia de la adicción de ácido láctico producido por las bacterias en la conservación de la carne [22-23]. Los compuestos antimicrobianos pueden ayudar a reducir la adición de preservantes químicos y disminuir la intensidad del tratamiento térmico [24-25].

Otros hallazgos

En la Figura 12 se presenta la morfología del parasito Balantidium coli en el tratamiento 3. el cual fue observado durante el análisis de las láminas de Hematoxilina y Eosina imagen (A) y la tinción de Gram realizada imagen (B) sobre todo en el colon.

Figura 12

El Balantidium es reconocido en el tejido por el gran tamaño, la forma ovoide, un macronúcleo denso, curvado o en forma de riñón y la presencia de cilios sobre la superficie [26-27]. Es un parásito normal de la flora intestinal del cerdo (reservorio principal), primates, ratas y el cuy [28].

Este parásito se idéntificó en los tratamientos 1 y 3 los cuales no recibieron Lactobacillus plantarum. Esto permite inferir que posiblemente, los tratamientos con probiótico ejercieron una acción inhibitoria en el crecimiento de este tipo de parásitos, sin embargo para establecer su efecto se debe realizar un estudio específico, evaluando el efecto de inoculaciones probióticas sobre este agente patógeno.

CONCLUSIONES

Este estudio es la primera investigación hecha en cuyes en el departamento de Nariño, convirtiéndose en la base para posteriores estudios que amplíen los conocimientos sobre esta especie. Los parámetros zootécnicos no fueron influenciados por la administración del probiótico. Los resultados de las tinciones especiales y la inmunohistoquímica permiten inferir que el inóculo suministrado a los cuyes causó lesiones en el tejido intestinal, con mayor prevalencia en el yeyuno atribuidas a la interacción con el medio de crecimiento PRO en el cual se encontraban o la proliferación de bacterias patógenas

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