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INTRODUCCIÓN
Los productos alimenticios están frecuentemente propensos a la contaminación causada por agentes patógenos, algunos de ellos generados durante el almacenamiento, el transporte o el procesamiento después de la cosecha, lo que trae consigo pérdidas significativas en la calidad, cantidad y composición de nutrientes, con la consecuente reducción del valor en el mercado. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, los casos registrados de pérdidas de alimentos en mal estado en los que se incluyen cereales, granos, nueces, frutas, verduras, carnes y especias, se reportan en cifras equivalentes a toneladas métricas de alimentos cada año (1).
Gran cantidad de bacterias patógenas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, en reservorios acuáticos y animales, los cuales son una importante fuente de patógenos (2). Entre otros Escherichia coli ha sido identificado como el principal agente etiológico responsable de los brotes de enfermedades transmitidas por alimentos; esta bacteria está asociada a enfermedades gastrointestinales producto del consumo de alimentos contaminados tanto en origen como en proceso por falta de higiene e inadecuadas prácticas de procesamiento y conservación (2).
La Organización Mundial de la Salud, afirma que las enfermedades transmitidas por el agua y los alimentos presentan un problema creciente y generalizado de salud pública, se estima que afecta a 1 de cada 3 personas al año en todo el mundo, y dan lugar a 2,2 millones de muertes afectando mayoritariamente a la población infantil, desencadenando así el problema de salud pública más extendido mundialmente (3).
No obstante, con el fin de garantizar la seguridad alimentaria, existe la necesidad de generar medidas de control eficaces con conservantes antimicrobianos, que garanticen la inactivación bacteriana y que a su vez no generen efectos secundarios por su consumo; los métodos de conservación de alimentos que estén exentos de productos químicos pero que presenten compuestos antimicrobianos seguros y eficaces abren paso a numerosos estudios con productos naturales, como es el caso de los aceites esenciales de plantas, ya que los conservantes químicos, aunque controlan el desarrollo microbiano, generan gran debate por los efectos secundarios en la salud humana. En este contexto, en los últimos años los aceites esenciales naturales se han convertido en un tema de investigación en beneficio de la industria alimentaria puesto que han demostrado una importante actividad bacteriana frente a microorganismos Gram positivos y Gram negativos (4).
Los aceites esenciales son líquidos aceitosos aromáticos que se obtienen por diferentes métodos de extracción, a partir de material vegetal (flores, tallos, raíces, hojas, frutos, y semillas), algunos de ellos indican actividad antibacteriana y antifúngica, evaluadas como una fuente potencial de nuevos compuestos antimicrobianos y una alternativas para la preservación de alimentos (5).
La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales se encuentra relacionada con la composición química, por ejemplo, frutos cítricos cuentan con un promedio de 40 compuestos, los cuales se ven influenciados por métodos específicos de cultivo, extracción y separación; los aceites esenciales de cítricos se encuentran principalmente en la cáscara de la fruta, su extracción es económicamente sostenible, ya que la cáscara constituye una pérdida para la industria de jugos de frutas; en consecuencia, el interés de estos como agentes antimicrobianos y conservantes en los alimentos abre una posible alternativa para sustituir los conservantes y antibióticos convencionales (6).
Algunas de las aplicaciones en cuanto a inhibición microbiana a partir de aceites esenciales, han demostrado eficacia frente a varios patógenos comunes en la industria alimentaria, dentro de los cuales se encuentran: E. coli, Salmonella typhimurium, S. aureus, Campylobacter, Enterococcus fecalis, Vibrio parahemolyticus, Listeria monocytogenes, y otros (7).
Los aceites de frutos cítricos han sido evaluados como posibles alternativas a los antimicrobianos basados en productos químicos, es así como su estudio es relativamente hace poco, haciendo énfasis en los componentes que lo constituyen, en especial en el quimiotipo limoneno, el cual ejerce un amplio espectro en actividad antimicrobiana, demostrando ser eficaz frente a S. aureus, L. monocytogenes, S. entérica y Saccharomyces bayanus. (8).
El objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad inhibitoria de tres aceites esenciales de eucalipto, cáscara de limón y mandarína en bacterias ATCC Escherichia coli y Staphylococcus aureus a través del método de micro dilución en caldo colorimétrico.
MÉTODO
Formulación de la emulsión
Los aceites esenciales de Eucalipto (Eucalyptus), cáscara de limón (Citrus limón) y mandarina (Citrus Reticulata) se obtuvieron mediante el método de hidrodestilación y las variables de la operación fueron: densidad de lecho (Diámetro de recipiente 30 cm), relación agua a material vegetal de 5:1, temperatura promedio de 90 ± 0,30C y un tiempo aproximado de 2,5 horas para cada extracción. El proceso se realizó en lotes de 400 g de material vegetal hasta alcanzar 10 mL de aceite; las muestras se sometieron a análisis de densidad, índice de refracción e índice de acidez de acuerdo a las normas NTC 336 y NTC 218, posteriormente se almacenaron a temperatura promedio de 4 ± 0,50C.
La composición de los aceites esenciales se efectuó con la ayuda de un cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas marca Shimadzu QP2010S, provisto de columna J&W Scientific DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) y detector Selectivo de masas, en modo de operación full scan; interface a 280°C; inyector split/splitless a 250°C Inyección split 1:50; fase móvil Helio UAP a flujo de 1,0 mL/min.
Inicialmente, se inyectó 1,0 μL de aceite esencial (dilución al 10% en diclorometano grado HPLC). Luego se procedió a la identificación tentativa de los compuestos mediante comparación de los espectros de masas utilizando las bases de datos ADAMS 2004 y NIST. Para el cálculo de los índices de retención lineales se utilizó una mezcla de n-alcanos.
Las emulsiones se elaboraron a partir de la mezcla del aceite esencial más un medio de cultivo líquido (caldo infusión cerebro corazón BHI) el cual permitía el crecimiento de bacterias Gram positivas y Gram negativas, como tensoactivo o emulsionante se utilizó Tween 20. Las variables de operación en la preparación de la emulsión como la temperatura, velocidad y tiempo de agitación fueron constantes, variando únicamente la proporción del aceite respecto al Tween 20 de la siguiente forma: 1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; la unidad muestral fue de 3 mL con ensayos por triplicado. La emulsión resultante se observó al microscopio con un objetivo de imagen de 40x y 100x, verificando su estabilidad termodinámica durante 48 horas con el fin de evidenciar defectos tales como la sedimentación, coalescencia y floculación durante el almacenamiento (10).
Para determinar las concentraciones de estudio de los aceites esenciales, se realizó un intervalo de datos con límites inferior y superior para Staphylococcus aureus entre 2 y 9,2 µL/mL, y con Escherichia coli en intervalo de 2 y 14,6 µL/mL.
Microorganismos y condiciones de crecimiento
La capacidad de inhibición bacteriana de los aceites esenciales de Eucalipto, cascara de limón y mandarina se evaluó frente a cepas de Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923), las cuales fueron proporcionadas por el Instituto Departamental de Salud de Nariño y se mantuvieron almacenadas a temperatura de refrigeración previa a su activación.
Para la activación bacteriana se realizaron inóculos adicionando 10 µL de cada bacteria en 10 mL del medio de cultivo líquido de infusión de cerebro y corazón (BHI), se incubaron durante 24 horas a 37°C y se estandarizó a una población de Mc Farland de 0,5 que equivale a 1,5 x 10 8 UFC /mL (11).
Concentración mínima inhibitoria mediante micro dilución en caja de Elisa
Se empleó una caja de elisa de 96 pozos con una capacidad en cada pozo de 200 µL. Inicialmente se montaron dos controles, estos correspondían a un control positivo (medio de cultivo y bacteria), y aun negativo igual al primero más los antibióticos que contrarrestan la resistencia de la bacteria (Staphylococcus aureus con oxácilina 5 µg/mL y para Escherichia coli ampicilina 2 - 8 mg/mL) (9). Los pozos donde varía la concentración de aceite tuvieron un volumen final de 120 µL, de los cuales 10 µL corresponden al inóculo bacteriano más 100 µL de cada emulsión, posteriormente las cajas se incubaron a 35°C durante 20 horas. Como indicador colorimétrico de inhibición se empleó MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) (M2128-100MG Sigma aldrich), el cual se adicionó a cada pozo, incubando durante una hora a 37ºC y observando cambios de turbidez para determinar si se presentó concentración mínima inhibitoria. Las experiencias se realizaron por triplicado
La concentración mínima bactericida se determinó inoculando 10 µL de muestra de un pozo que no presentó cambio de color en agar Muller Hilton y se incubó a 37°C durante 18 horas para confirmar la ausencia de bacterias viables en caja Petri por triplicado.
Análisis estadístico
Se realizó con la ayuda del programa Statgraphics Centurión XVII. Los resultados se expresan en promedios con su desviación estándar, las diferencias estadísticas se compararon a un valor P˂0,05 con análisis de varianza y prueba de múltiples rangos de Tukey. Los resultados de inhibición bacteriana se realizaron con un diseño completamente al azar con dos factores y las diferencias significativas se compararon con la prueba de kruskall Wallis a un valor P˂0,05.
RESULTADOS
Características físicas y químicas
En el cuadro 1 se puede observar que la densidad de los aceites presentó diferencias significativas, el mayor valor fue para el aceite de eucalipto, mientras que limón y mandarina muestran valores similares. En lo referente al índice de refracción no se observan diferencias significativas en los tres tipos de aceites. Por otra parte, el índice de acidez indicó diferencias significativas para el aceite de eucalipto comparado con los aceites de mandarina y limón, ya que estos dos últimos presentan valores similares.
Composición de aceites
Como se puede observar en el cuadro 2, en los aceites de limón y mandarina existen compuestos comunes los cuales corresponden a limoneno, terpineno, octanal y mirceno.
En mandarina es importante destacar los quimiotipos linalool (dimethyl-2,7-octadien-6-ol.) y timol (2-isopropil-5-metilfenol) ampliamente estudiados por sus propiedades antibacterianas y antifúngicas. Por otra parte en el aceite de eucalipto son importantes los terpenos eucaliptol (1,8 cineol) y pineno. Estudios realizados por varios investigadores reportan que el efecto antimicrobiano de los compuestos obedece a un efecto sinergista y no a las propiedades aisladas de uno de ellos.
Cuadro 2 Compuestos principales de aceites esenciales
Nota: Se referencian los compuestos con valores superiores al 1%
Emulsiones
En los ensayos realizados se determinó que la relación 1:1 entre aceite esencial y Tween 20 mostró estabilidad hasta 48 horas durante las cuales se realizó el seguimiento; como parámetro adicional, se midió el tamaño promedio de gota el cual se mantuvo entre un rango de 40 a 63 micras durante el tiempo, como se puede observar en la figura 1.
Concentración mínima inhibitoria CMI
En la figura 2 se presenta los resultados de la prueba de inhibición bacteriana a través de microdilución en caja de Elisa. Imagen de Izquierda indica ensayos con aceite esencial de limón y mandarina en la bacteria E.coli; imagen central muestra resultados de S. aureus con mandarina y eucalipto; imagen derecha corresponde a S. aureus y E.coli con limón y eucalipto en su orden. Los pozos donde no se observa ningún cambio de color indican la ausencia de bacterias viables.
En el cuadro 3 se resume la concentración mínima de inhibición CMI y la concentración mínima bactericida CMB de cada aceite esencial frente a las bacterias patógenas, el aceite esencial de eucalipto y mandarina indican la menor CMI y CMB frente a Staphylococcus aureus (6,8 µL/mL). Respecto a la bacteria patógena Escherichia coli esta muestra susceptibilidad a los tres aceites, siendo menor para eucalipto y mandarina con valores de CMI y CMB de 13,2 µL/mL. En esta investigación la concentración mínima inhibitoria CMI y la concentración mínima bactericida CMB coincidieron en el mismo valor. Las figuras 3 y 4 muestran los resultados de CMB para las bacterias de estudio.
Cuadro 3 Resultados de CMI y CMB para S. aureus y E. Coli
Nota: letras minúsculas diferentes en filas representan diferencias significativas de los tratamientos con la bacteria, prueba de kruskall Wallis a P˂0,05.
Figura 3 Concentración mínima bactericida CMB de aceites esenciales de eucalipto, limón y mandarina en cultivo de Staphylococcus aureus.
Figura 4 Concentración mínima bactericida CMB de aceites esenciales de eucalipto, limón y mandarina en cultivo de E. coli.
El principal problema a la hora de determinar la eficiencia de los aceites esenciales en cuanto a las propiedades antibacterianas es su naturaleza hidrófoba que los hace insolubles en medios a base de agua. En este sentido, con el fin de obtener una mezcla homogénea del antibacteriano y el medio de dilución, se resuelve elaborando una emulsión que permita la coexistencia de sus componentes los cuales generalmente son sustancias hidrófilas e hidrofóbas más tensoactivos tales como Tween 20 o 80 solo o en combinación con acetona, polietilenglicol o etanol (12).
Las emulsiones de aceite en agua son vehículos importantes para el suministro de compuestos hidrófobos en una gama de productos alimenticios, nutracéuticos, cosméticos y fármacos (13).
De la investigación realizada, la metodología basada en la preparación de mezclas de aceites esenciales y el medio de cultivo líquido, genera una alternativa para preparar nuevas formulaciones a escalas pequeñas, en este caso de un compuesto antimicrobiano que podría ser adoptado para reemplazar o incluso reducir al mínimo la dependencia excesiva de los agentes antibacterianos químicos, cuyos efectos secundarios están bien establecidos (13).
Los resultados obtenidos de la concentración mínima inhibitoria no son diferentes a otros estudios que se han realizado en cuanto a inhibición bacteriana, ya que se ha demostrado que las bacterias Gram positivas son más susceptibles a diferentes tipos de aceites esenciales que las bacterias Gram negativas, esto se evidencia claramente en el resultado obtenido con la bacteria Staphylococcus aureus como bacteria Gram positiva; Escherichia coli fue más resistente frente a las concentraciones propuestas, sin embargo los aceites esenciales de eucalipto y mandarina lograron inhibir el crecimiento de esta como de otras bacterias Gram negativas (14).
La tendencia de consumo actual está inclinada hacia el reemplazo de los conservantes químicos por alternativas naturales que brinden seguridad alimentaria, en este sentido se propone la utilización de los aceites esenciales de plantas y frutos cítricos como una solución para mejorar los métodos de conservación de alimentos en la industria alimentaria.
Los aceites esenciales de los cítricos se extraen de la piel de las frutas frescas, por lo tanto constituyen un subproducto de la industria alimentaria, y la utilización de estos como agentes antimicrobianos contra bacterias patógenas no solo proporcionan una alternativa de conservante natural, sino que también maximiza el uso de los recursos existentes y minimiza los efectos adversos de los subproductos en el medio ambiente.
Es conocido que un aceite esencial es una mezcla de numerosos componentes y su bioactividad se relaciona con su composición y las interacciones entre sus componentes, las cuales desempeñan un papel importante en cuanto al efecto bactericida, partiendo de esto, numerosos estudios cromatográficos obtenidos en varios ensayos, confirman que el componente más abundante en los cítricos como la naranja, limón y mandarina es el limoneno, monoterpeno que representa el 65 al 97% del aceite, dependiendo de varios factores, principalmente del método de extracción, el tiempo de la recolección del material vegetal, y sobre todo, el origen geográfico del aceite; para el caso del eucalipto como principal componente se destaca el eucaliptol (15).
Los resultados obtenidos en cuanto a inhibición bacteriana tienen similitud con otros estudios realizados, ya que los aceites esenciales de cáscara de mandarina y eucalipto demostraron mayor eficacia bactericida frente a las bacterias estudiadas; sin embargo es importante tener en cuenta que la susceptibilidad de los microorganismos a los aceites esenciales se debe a diversos factores entre los cuales se destaca principalmente la composición del aceite esencial y la propia especie microbiana, es importante resaltar que la variabilidad en la composición química de los aceites esenciales puede cambiar de acuerdo a diferentes situaciones tales como: ambientales (clima, estaciones y posición geográfica), variaciones genéticas, el estado nutricional de la planta, el tiempo de la cosecha y el método de extracción (16).
Los aceites esenciales de las pruebas demostraron actividad antimicrobiana contra las bacterias transmitidas por alimentos, sin embargo S. aureus fue la bacteria más susceptible, mientras que E. coli mostró mayor resistencia. Algunos autores afirman que la mayor resistencia en las bacterias Gram-negativas podría atribuirse a las diferencias en la membrana celular de estos grupos de bacterias, de esta manera la membrana externa de las bacterias Gram-negativas tiene superficies altamente hidrofílicas, mientras que los extremos lipofílicos de la membrana celular de las bacterias Gram-positivas pueden facilitar la penetración por un compuesto hidrófobo (17).
El modo de acción de los aceites esenciales ha sido ampliamente estudiado, sin embargo no se tiene total claridad de ello, en algunos estudios se ha propuesto que la acción antimicrobiana de los aceites esenciales se puede atribuir a su capacidad de penetrar a través de membranas bacterianas y así interrumpir las propiedades funcionales de esta, interactuando con los organélos que constituyen el citoplasma de la celula bacteriana e interferir en el metabolismo celular (17).
Una de las características importantes de los aceites esenciales y sus componentes es la hidrofobicidad, ya que permite separar los lípidos de la membrana celular bacteriana y así hacerla más permeable. La interacción de los componentes de los aceites esenciales con membranas celulares microbianas permite la inhibición del crecimiento de algunas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, por ejemplo en el primer grupo se destacan Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus las cuales son más susceptibles a los aceites esenciales que las bacterias Gram-negativas como Escherichia coli y Salmonella Enteritidis, que son más resistentes a la acción de los aceites esenciales debido a que poseen una pared celular exterior hidrofílica, que ayuda a prevenir la penetración de compuestos hidrofóbicos (18).
Por otra parte la naturaleza fenólica de los aceites esenciales también provoca una respuesta antimicrobiana frente a bacterias patógenas; los compuestos fenólicos interrumpen la membrana celular e inhiben las propiedades funcionales de la célula provocando la muerte celular, de la misma manera los compuestos fenólicos pueden alterar la permeabilidad celular microbiana, dañar las membranas citoplasmáticas, interferir con la energía celular en el sistema de generación de ATP e interrumpir la fuerza motriz de protones, con la permeabilidad alterada de la membrana citoplasmática se puede provocar la muerte celular (19).
CONCLUSIONES
El presente estudio permitió comparar la actividad antimicrobiana de tres tipos de aceites esenciales mediante el método de microdilución en caldo colorimétrico, la emulsión se obtuvo con una proporción 1:1 de aceite esencial y Tween 20 estable en 48 horas y con un diámetro de gota entre 40 y 63 micras.
Las concentraciones mínimas inhibitorias CMI y bactericidas CMB fueron: Staphylococcus aureus, con eucalipto y mandarina 6,8 µL/ml, limón 7,6 µL/ml. Con la bacteria Escherichia coli, eucalipto y mandarina 13,2 µL/mL y limón 14,6 µL/mL. Los resultados demostraron que los aceites esenciales de eucalipto, cascara de limón y mandarina tienen capacidad inhibitoria para las bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
Por último, el estudio señala el interés acerca del aprovechamiento de los productos de desecho de la industria de jugos y frutas, maximizando el uso de los recursos existentes y minimizar los efectos adversos de los subproductos en el medio ambiente.
