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INTRODUCCIÓN
El café en el departamento del Cauca es uno de los pilares económicos de la región, porque cuenta con casi 93.000 hectáreas aptas para producción, siendo uno de los principales productores de café de calidad en Colombia. Igualmente, el café caucano es apetecido por su consistencia y homogeneidad (Ceballos and López, 2019). Se ha reconocido la importancia de mantener un estricto control del estado de salud de los sembradíos de café, para mejorar su calidad. Se ha utilizado la clorofila como un indicador confiable del estado fisiológico de los cultivos y de la productividad primaria de los ecosistemas, permitiendo identificar posibles inconvenientes mediante técnicas espectrofotométricas (De Souza et al., 2019). Además, se utiliza como medida indirecta para estimar la biomasa de las comunidades vegetales (Grossmann et al., 2018).
Las imágenes multiespectrales son una alternativa para estimar el contenido de clorofila (LCC, por sus siglas en inglés, Leaf Chlorophyll Content) de forma remota y no invasiva mediante índices de vegetación (IV). Los IV son valores numéricos calculados a partir de la reflectancia de las bandas espectrales, cuya función es medir distintas variables (clorofila, biomasa, producción fotosintética). Estas técnicas espectrales permiten una mayor resolución espacial y pueden beneficiar el proceso de gestión de los cultivos (De la Casa et al., 2018).
La determinación del vigor de los cultivos se basa en la cantidad de clorofila de sus hojas (Grossmann et al., 2018). Usando imágenes multiespectrales, se han desarrollado sistemas predictivos para determinar el LCC en caña de azúcar (Paredes et al., 2017) y el maíz (González et al., 2017). Respecto al café, se han desarrollado sistemas de estimación para determinar características como el contenido de nitrógeno (Chemura et al., 2018b), el estrés hídrico (Chemura et al., 2017) y el contenido de clorofila (Chemura et al., 2018a; Widjaja Putra and Soni, 2018). Estos estudios utilizan el espectro electromagnético para determinar indirectamente el pigmento, ya sea, mediante imágenes hiperespectrales o imágenes RGB. Una de las principales limitaciones de estas investigaciones es la frecuencia de las capturas de las imágenes satelitales, además de la baja resolución espacial para los cultivos pequeños (Choi et al., 2005). La utilización de imágenes RGB suele presentar inconsistencias en la determinación de los IV, por su limitación espectral (Hunt et al., 2011). Ninguno de los estudios reportados hasta la fecha sobre cultivos de café de la especie Coffea arabica confronta los índices espectrales con medidas de estimación de clorofila en laboratorio. Por lo tanto, de la variedad de índices espectrales propuestos en la literatura, no se conoce cuáles son los mejores estimadores para esta especie vegetal.
Definir los mejores índices de vegetación para cada cultivo constituye un reto importante. Se han encontrado correlaciones alrededor de ρ=0,66 entre IV en el espectro del infrarrojo visible e infrarrojo cercano (VIS-NIR) con el LCC, en una variedad de Sangiovese (Caruso et al., 2017). También, se ha estimado la relación entre el LCC e IV para Musa AAA Simmonds mediante imágenes satelitales. Los resultados sugieren que los coeficientes de correlación más altos fueron con TCARI y MCARI (Pardo, 2015). Aunque se encontraron coeficientes de correlación altos entre el LCC y los IV en varias especies vegetales, concretamente en cultivos de café de la especie Coffea arabica. Las investigaciones halladas sugieren que no se han identificado los IV con mayor coeficiente de correlación, con respecto a la estimación de LCC en laboratorio mediante espectrofotometría VIS-NIR (Chemura et al., 2018a; Widjaja Putra and Soni, 2018).
En este trabajo se investiga si los IV, medidos en imágenes multiespectrales, se correlacionan estadísticamente con el LCC medido en laboratorio, para la especie Coffea arabica de la variedad Castillo, ya que a la fecha no se conocen estudios similares para esta especie vegetal. El trabajo hace énfasis en el estudio de contenido localizado de clorofila en distintas zonas de las hojas, para encontrar si hay diferencia del contenido entre hojas sanas y enfermas. El resultado principal es que no solamente se encuentra correlación estadística entre IV y LCC, sino que, además, la variabilidad de los indicadores IV concuerda con la variabilidad de la clorofila medida, y ésta es marcadamente diferente entre hojas sanas y enfermas. Este resultado permitiría en trabajos futuros, establecer un método para inferir el estado de salud de las hojas de esta variedad a partir del método estudiado.
MÉTODO
Arreglo experimental
El arreglo experimental fue completamente al azar. Se seleccionaron hojas sanas y enfermas para analizar y correlacionar estadísticamente el LCC con los IV estimados, usando imágenes multiespectrales. Las unidades experimentales de la investigación fueron hojas de café de la especie Coffea arabica, la edad aproximada de los cafetos es de tres años, fueron tomadas del parque tecnológico del café (Tecnicafé) con coordenadas geográficas 2°35'11.6"N y 76°33'11.2"W, en el Departamento del Cauca (Colombia), la altura aproximada del cultivo es de 1862 m.s.n.m. y una temperatura ambiente de 12 a 18 ºC (Ordoñez-Fernández and Montoya-Bonilla, 2017).
Para los datos obtenidos, se realizó un análisis estadístico preliminar: eliminación de valores atípicos, preprocesado de datos y análisis descriptivo. Se realizó la prueba de Shapiro-Wilk (González-Estrada and Cosmes, 2019) como prueba de normalidad. Se efectuaron pruebas de correlación de Spearman (Song et al., 2018), para determinar la dependencia entre las variables de respuesta (LCC e IV). Utilizando la ecuación 1, se calculó el Coeficiente de Variación (CV) para las medidas de LCC e IV para determinar la uniformidad de la distribución de clorofila en las hojas sanas y enfermas (cloróticas). Para establecer si la distribución de la clorofila era significativamente diferente entre las hojas sanas y las enfermas, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney (Fong and Huang, 2019).
Siendo σ la desviación típica y x la media de la muestra.
Contenido de clorofila mediante espectrofotometría de laboratorio
Se empleó el espectrofotómetro GENESYS™ 20 para determinar la cantidad de pigmento fotosintético en las hojas de café, siguiendo el procedimiento sugerido por Arnon (Arnon, 1949). Este consistió en moler el tejido vegetal en acetona y realizar el proceso de centrifugación. Después, se tomaron 50 mg de muestra de tejido vegetal y se agregaron 15 mL de acetona al 90 %, luego, la muestra se maceró y se aforó a 6,5 mL con el mismo solvente. Se evitó tomar muestras que contuvieran la nervadura principal y se eligieron aquellas con el menor número de ramificaciones secundarias en las hojas. Posteriormente, se midió la absorbancia (E) de las muestras a longitudes de onda 644 nm, 661 nm, 664 nm y 647 nm, luego se estimó el contenido de clorofila a / y clorofila b / de cada muestra en µg/mL, mediante las ecuaciones 2 y 3 (Jeffrey and Humphrey, 1975).
Determinación de índices de vegetación mediante imágenes multiespectrales
Para la obtención de las imágenes multiespectrales se utilizó la cámara MicaSense Red-Edge®, que captura cinco bandas del espectro electromagnético: azul 475 nm, verde 560 nm, rojo 668 nm, rojo-borde 717 nm y NIR 840 nm. A partir de las bandas espectrales se calcularon 14 IV (Cuadro 1).
La metodología utilizada para la toma de imágenes multiespectrales consistió en extraer las hojas del cultivo y realizar la toma fotográfica entre las 10 am a 12 m, a una altura de 1,0 m. El procesado de las imágenes transformó la intensidad de los píxeles obtenidos en radiancia y luego en reflectancia utilizando un panel de calibración. Este proceso se realizó usando un algoritmo de calibración radiométrica y geométrica desarrollado en Python. Usando las imágenes de reflectancia, para cada uno de los 14 IV, se calculó el índice de vegetación para cada píxel, conformando una imagen para cada uno. Sobre la imagen del índice de vegetación, se seleccionó una región de interés en las hojas y mediante un histograma de frecuencias se calculó la moda para conocer el valor más frecuente en la región de interés. Luego, se recopilaron los datos de la moda y el valor promedio para los 14 índices de vegetación.
Mapeo de clorofila en zonas localizadas de la hoja de café
Se analizó la distribución de la clorofila en hojas de café de la especie Coffea arabica en puntos localizados. Para esto, se seleccionaron diez hojas, de las cuales cinco estaban en estado fisiológico sano (lote de hojas sanas) y las cinco restantes correspondían a hojas enfermas (lote de hojas cloróticas) (Figura 1).
Posteriormente, se realizó espectrofotometría de laboratorio para encontrar el LCC (μg/mL). Específicamente, cada una de las 10 hojas se dividió en seis zonas con un peso equivalente de 50 mg, de modo que se obtuvieron 60 muestras. Después, se extrajo la clorofila de estas zonas con el protocolo propuesto en (Arnon, 1949). Luego, se determinó la cantidad de pigmento en cada zona. Antes de procesar las hojas, se calcularon los IV a partir de las imágenes multiespectrales con el procedimiento descrito en el apartado anterior.
Finalmente, obtenido el LCC para cada una de las 60 muestras y los IV en las mismas zonas, se hallaron los coeficientes de correlación entre LCC e IV. Además, los datos se agruparon entre hojas sanas y enfermas, para determinar la correlación estadística entre LCC y los IV en cada uno de los dos grupos.
RESULTADOS
En esta sección se presentan los resultados del análisis inferencial del CV de los IV y el LCC, además, se analiza su grado de dependencia. El análisis de correlación se realizó en dos etapas: sin distinción en el estado de salud de las hojas y luego dividiendo las muestras entre hojas sanas y enfermas. Las pruebas de normalidad ( González-Estrada and Cosmes, 2019) aplicadas a los datos de las variables de respuesta revelaron que su distribución es no normal, por tanto, se realizaron pruebas no paramétricas de correlación (Spearman (ρ)).
Correlación entre LCC e IV
En la Figura 2, se expone la correlación estadística entre los 14 IV y el LCC para la clorofila a y b, en las 60 muestras tomadas, sin diferenciar el estado salud de las hojas. Se encontró que la mayor correlación entre el LCC y los IV es para el índice GARI (0,94 Chl a y 0,93 Chl b).
Correlación entre índices de vegetación
El índice NDVI es utilizado por su polifuncionalidad y buenos resultados en distintos ambientes (Rani et al., 2018), siendo un buen punto de partida para comparar distintos IV. El coeficiente de correlación entre el índice NDVI y los índices NDRE y GNDVI fueron bajos (ρ=0,39 y ρ=0,61 respectivamente).
Los índices CI green y GNDVI tuvieron la misma correlación con el índice NDVI, esto se debe a que utilizan la misma relación matemática, la única diferencia es que CI green tiene un valor de corrección para efectos atmosféricos, que en este caso particular no afecta por la corta distancia entre hoja y cámara.
Otros índices con altas correlaciones con el NDVI son ARVI y ARVI2 (ρ=0,96 y ρ=0,99 respectivamente), estos utilizan las bandas NIR y red, con corrección por efectos atmosféricos (Bhatnagar et al., 2018), que en este caso no presentan ninguna mejora significativa. La correlación entre los índices NDVI y NLI es ρ=0,95, este último utiliza las mismas bandas espectrales que el índice NDVI (NIR y red), pero con la diferencia que utiliza el cuadrado de la reflectancia en NIR, para minimizar los efectos de la inclinación de las hojas y el brillo del suelo (Goel and Qin, 1994). Los índices GNDVI, IPVI, GARI, NLI, ARVI, ARVI 2 y GRNDVI tienen en común la utilización de al menos una banda del VIS y el NIR, lo que genera redundancia de información (Cross et al., 2019). Los coeficientes de correlación entre estos índices y el LCC estuvieron en un rango de 0,64 a 0,94. La utilización de estas bandas se debe a que son las regiones de mayor absorción y reflectancia de la clorofila, permitiendo que estos índices sean robustos ante diversas condiciones (Ihuoma and Madramootoo, 2020). Finalmente, la correlación entre los IV fue positiva para todos, exceptuando el índice GLI respecto al GNDVI, NDRE y CI green.
Coeficiente de variación en las medidas de índices de vegetación
El análisis del CV para hojas sanas y enfermas reveló variaciones en la distribución del LCC en las hojas de café. Los CV de las hojas en estado degenerativo fue mayor que el de las hojas sanas (Figura 3), esto sugiere que la degradación de la clorofila no es uniforme. Además, se encontró que los valores de CV altos (superiores al 30 % para hojas enfermas) están relacionados con coeficientes de correlación más altos entre LCC e IV. Lo contrario ocurrió con CV bajos (menores al 17 % y para hojas sanas), que presentaron menores coeficientes de correlación entre la estimación del LCC e los IV. La prueba U de Mann-Whitney reveló que el CV del grupo de hojas sanas es significativamente diferente al CV del grupo de hojas enfermas (p<0,05). Esto sugiere que la distribución de clorofila en hojas enfermas no es uniforme y puede ser ocasionado por factores que originan la degradación del pigmento de forma anisotrópica, tales como traumatismos, sustancias químicas o agentes infecciosos (Kuai et al., 2018). Esta degradación está relacionada con una pérdida progresiva de la integridad de la membrana que produce inflamación del citoplasma de las células, desencadenando la liberación progresiva de componentes celulares que se refleja en un color no uniforme (Van Breusegem and Dat, 2006).
Figura 3 Representación de la diferencia entre coeficientes de variación (%) entre hojas sanas y enfermas
Las hojas con mayor CV de clorofila (Figura 3) obtuvieron valores mayores de correlación entre el índice NDVI y el LCC (ρ=0,89 entre LCC para Chl a y NDVI para hojas enfermas que presentan un CV=82,6 %, y ρ=0,74 para las hojas sanas que presentan un CV=12,5 %).
Correlación LCC-IV para hojas sanas y enfermas
El Cuadro 2 muestra el coeficiente de correlación (ρ) entre el LCC a y b con los IV. Se encontró que la estimación de Chl a medida en laboratorio para las hojas sanas tuvo el mayor coeficiente de correlación con el índice GARI (ρ=0,88), seguido por los índices NDVI e IPVI (0,74). Mientras que, para la Chl a del lote de hojas enfermas, el índice que mejor estimó este pigmento fue el NDVI (0,89), seguido del índice NLI (ρ=0,87) y el índice IPVI (ρ=0,82). El índice GRNDVI tuvo un desempeño similar para la medición de / en el lote de hojas sanas y enfermas. La clorofila a en las plantas de café cumple un papel importante, ya que, ayuda en la recolección de luz en las antenas de la planta, y en la transformación de luz solar a energía química en los fotosistemas I y II (Marcheafave et al., 2019).
Los resultados exponen que los coeficientes de correlación son más altos para la mayoría de los índices con respecto a Chl b, asimismo, el índice NDVI presenta los mejores coeficientes de correlación en hojas sanas y enfermas (0,84 y 0,89). Sin embargo, el índice GARI presenta los mejores coeficientes de correlación sin diferenciar por lotes de hojas (ρ=0,93).
La clorofila a y b respecto al GNDVI y NDRE tuvieron valores de correlación bajos en relación con otros índices. Si bien, estos fueron construidos para enfocarse principalmente en la clorofila (García-Cárdenas et al., 2019), tuvieron problemas para detectar valores bajos de concentración del pigmento. Por ejemplo, para las hojas en un estado de clorosis avanzado, se obtuvieron valores altos en los IV que no corresponden con el análisis de clorofila en laboratorio. En este caso, para el lote de hojas enfermas los valores de correlación entre clorofila y los índices GNDVI y NDRE fueron ρ=0,15 y ρ=0,03 respectivamente, mientras que para el lote de hojas sanas las correlaciones aumentaron significativamente en GNDVI (ρ=0,79), y NDRE (ρ=0,86). Los resultados sugieren que, para tejidos vegetales, en hoja de café, con bajo LCC los índices GNDVI y NDRE no son buenos estimadores.
Cuadro 2 Correlación entre contenido de clorofila a e IV diferenciados por lote de hojas sanas y enfermas.
El índice GLI presentó los valores más bajos de correlación (ρ=0,07 clorofila a y ρ=0,14 clorofila b) con respecto al LCC. Esto puede explicarse porque es el único índice que utiliza la reflectancia de la zona verde, roja y azul sin la banda NIR. Si bien la información espectral de los pigmentos se encuentra en la región visible, las técnicas en imágenes RGB tienen un ancho de banda amplio que limita su sensibilidad. Las imágenes en el espectro visible tienden a presentar inconsistencias ante diferentes condiciones ambientales, y su correlación con LCC puede estar sesgada por factores externos a la planta (Ashapure et al., 2019). La ausencia de la banda NIR en este índice limita su uso debido a la pérdida de información con relación a la integridad estructural del mesófilo, que se asocia a estados de estrés en la planta, lo que produce indirectamente una disminución del LCC (Jiménez-Suancha et al., 2015).
El índice GARI presenta las correlaciones más altas respecto a la clorofila (ρ=0,94 Chl a y ρ=0,93 Chl b) sin diferenciar el estado de salud de las hojas. Este índice utiliza cuatro bandas (NIR, verde, azul y rojo) por lo tanto, obtiene más información espectral que los otros índices. Este es sensible a un amplio rango de concentraciones de clorofila, lo cual explica el rendimiento notable en ambos grupos de hojas, cloróticas y sanas (Zheng et al., 2018).
El índice GRNDVI presentó la segunda mayor correlación con respecto a la Chl a y Chl b después del índice GARI, este no utiliza ningún factor de corrección, en cambio, propone utilizar las bondades del NDVI y sumarle la banda verde para ser más sensible a diferentes grados de cobertura vegetal y evitar saturaciones (Qiu et al., 2018). Este índice presento la misma correlación estadística del LCC en Chl a para ambos lotes de hojas (ρ=0,73 y ρ=0,73, Cuadro 2).
Con el objetivo de extender los resultados obtenidos a nivel del dosel del cultivo y aprovechar el carácter no invasivo de la técnica, es necesario hacer un estudio adicional donde se examine el efecto de la estructura de los arbustos de café, y la topografía de la región de estudio, en la dependencia estadística entre los IV y el LCC.
CONCLUSIONES
La investigación demuestra que existen correlaciones mayores a ρ=0,83 entre IV (NDVI, GARI, IPVI, NLI y GRNDVI) y el LCC estimado en laboratorio. Por lo tanto, los IV son indicadores adecuados del contenido de clorofila de forma indirecta, a nivel de hojas de café de la especie Coffea arabica. Además, dadas las altas correlaciones encontradas, puede afirmarse que es posible establecer modelos de regresión para estimar el LCC en hoja a través de índices de vegetación.
Las hojas de café enfermas presentaron distribución no uniforme (distintos coeficientes de variación) del LCC, y los índices de vegetación fueron sensibles a esas variaciones. Los IV que usan información de las bandas VIS y NIR presentaron correlaciones mayores con el LCC de la especie Coffea arabica.
Los resultados obtenidos permiten considerar trabajos futuros para establecer un protocolo basado en indicadores IV, considerando una población de muestras mayor, para inferir el estado de salud de esta variedad vegetal.
