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INTRODUCCIÓN
En los últimos años el consumo de la berenjena se ha incrementado, constituyéndose entre las hortalizas la más apetecida por su riqueza en fenoles en la pulpa y alta cantidad de antocianinas en la piel del fruto (Niño et al., 2017). A nivel mundial se reporta un área cosechada de 1,847,787 ha y una producción de 55,197,878 t; China continental es el primer productor con 35,555,562 t seguido de India, Egipto y Turquía según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, 2021). En el 2018 en Colombia, se establecieron 601,32 ha con una producción de 4603,78 t., y un rendimiento promedio de 11,75 t, destacándose los departamentos de Córdoba, Magdalena y Sucre con producciones de 1307,78 t, 1260 t, 1144 t, respectivamente de acuerdo con la Red de Información y Comunicación del Sector Agropecuario Colombiano (Agronet, 2021).
La región de Caribe de Colombia cuenta con las variedades de berenjena C015 y C029, liberadas por Agrosavia, después de la acción participativa de los productores, quienes la escogieron por características de altos rendimientos, mayor número de frutos por planta y coloración lila atractivas en ese momento para el mercado (Martínez et al., 2020). Estas cualidades no son ajenas a problemas fitosanitarios ya que los productores reportan y asocian sintomatologías fungosas a la marchitez causada por Fusarium spp y Sclerotium spp., originándose en la etapa productiva del cultivo, además se resalta que el manejo es realizado por pequeños productores con limitaciones económicas (Martínez et al., 2019).
Las especies deFusariumson las causantes de la marchitez vascular en diversos cultivos, y generan importantes pérdidas económicas (Garrido and Vilela, 2019). La enfermedad se identifica morfológicamente por plantas marchitas con hojas de color amarillo (Cha et al., 2016; Khan et al., 2017), ya que Fusarium ingresa a la epidermis de la raíz, luego se disemina a través del tejido vascular y habita en los vasos del xilema de la planta provocando su obstrucción (Singh et al., 2017), seguido de un crecimiento que provoca la formación de tejidos descoloridos que evolucionan hacia manchas necróticas de color marrón a negro (Hermann and Lecomte, 2019). y posterior colonización conduciendo al desarrollo de la enfermedad ocasionando epinastía foliar, aclaramiento de las nervaduras, el marchitamiento, defoliación, y eventualmente preceden a la muerte de la planta (Di et al., 2016; Joshi, 2018). El manejo de la marchitez por Fusarium spp con agrotóxicos no ha sido exitoso, aunque el uso de químicos continúa siendo la alternativa empleada por los productores (Martínez et al., 2020). Por tanto, el uso preventivo con productos biológicos es uno de las más recomendados, porque generan mayor tolerancia a estrés biótico y abiótico (Schirawski and Perlin, 2018), les brindan a las plantas mayor absorción de nutrientes, protección contra plagas y enfermedades (Stringlis et al., 2018)
Una alternativa a la anterior situación es el uso del género Trichoderma el cual contiene una mezcla de compuestos que puede ser utilizada para control biológico (Marques et al., 2018); se encuentra de forma natural en la mayoría de los suelos de uso agrícola, teniendo una gran capacidad de adaptarse a diferentes ambientes, alta capacidad reproductiva, habilidad para colonizar raíces, plasticidad ecológica, efecto estimulante sobre los cultivos, actúa como inductor de resistencia sistémica en la planta y tiene la capacidad de parasitar una amplia gama de hongos patógenos de plantas (Villar et al., 2019; Cucu et al., 2020), además es de fácil manipulación (Sanabria, 2020; Thakur, 2021). Otras de sus características son los mecanismos involucrados en el antagonismo como antibiosis, competencia por espacio y nutrientes, y micoparásitismo (Bhujbal et al., 2021)
El objetivo de este trabajo fue identificar cepas nativas del género Trichoderma, con capacidad biocontroladora sobre Fusarium spp, causante de la marchitez vascular de la berenjena en el departamento de Córdoba, Colombia.
MÉTODO
La investigación se realizó en la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Córdoba, ubicada en el Municipio de Montería, Córdoba, Colombia (coordenadas decimales: 8.79179, -75.86050) a 14 m.s.n.m., 8°44' N y 75° 53' W con respecto al Meridiano de Greenwich, con precipitación anual promedio de 1.346 mm, humedad relativa del 84 %, temperatura promedio anual de 27,4 ºC y brillo solar anual de 2.108,2 h, tipo de clima sabana tropical húmeda (Aw) clasificación Koppen (Beck et al., 2018).
Se seleccionaron tres lotes comerciales de berenjena pertenecientes a los municipios de San Carlos, Cereté y Montería del departamento de Córdoba. En cada lote se tomaron diez muestras de suelo sobre el cual se encontraban plantas vigorosas de apariencia sana, con el fin de colectar cepas de Trichoderma spp; igualmente se tomaron diez plantas con síntomas característicos de la marchitez para aislar las cepas del patógeno Fusarium spp., las cuales fueron almacenadas individualmente en bolsas plásticas. Las muestras de suelo y el material vegetal fueron procesadas en el Laboratorio de Fitopatología en la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Córdoba.
Aislamiento de cepas de Trichoderma
Mediante la metodología de diluciones seriadas (French and Hebert, 1980), de cada muestra de suelo se tomó un mililitro de las diluciones 102 a 106 y se depositaron en cajas de Petri, con el medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA), con cuatro repeticiones; luego se incubaron a 24 °C durante ocho días, con un fotoperiodo diario de luz-oscuridad (12/12 h). Los hongos que formaron colonias de color verde fueron purificados en PDA (Bissett, 1991). Las características evaluadas de las colonias fueron (color, textura, crecimiento, pigmentación, tamaño de las esporas, forma, fiálides, conidióforos, presencia o no de clamidosporas) típicas para el género Trichoderma (Bissett, 1991). Se obtuvieron cinco aislados, los cuales fueron rotulados con un código compuesto por la inicial del género encontrado, seguido de la inicial del municipio donde se colectó la muestra y el número de la colecta.
Aislamiento de cepas de Fusarium
Se utilizó la metodología propuesta por French and Hebert, (1980) para aislar hongos fitopatógenos de tallos y raíces mediante cortes de raíces y tallos afectados, los cuales fueron desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio al 1 % durante cinco minutos, luego fueron lavados tres veces con agua destilada esterilizada, se secaron en papel toalla para eliminar los excesos de agua y se sembraron en medio PDA. Los aislados de color blanco o rosado fueron transferidos a PDA, hasta obtener colonias puras, las cuales fueron identificados morfológicamente como Fusarium spp., mediante la clave de Barnett and Hunter (1988). Se obtuvieron cinco cepas las cuales fueron rotuladas con un código compuesto por la inicial del género encontrado, seguido de la inicial del municipio donde se colectó la muestra y el número de la colecta.
Determinación del antagonismo In vitro
La capacidad antagónica de los cinco aislados nativos de Trichoderma spp., sobre los cinco aislados de Fusarium spp., causantes de la marchitez vascular en berenjena, se estableció empleando la técnica de Cultivo Dual (Andrade, 2019; Sanabria, 2020). El experimento se estableció en condiciones de laboratorio con un fotoperiodo de luz de 12 horas durante ocho días a 27 °C. Los tratamientos se distribuyeron bajo un diseño completamente al azar con cinco repeticiones. Se utilizó como testigo cada cepa de Fusarium sin la presencia de la cepa antagonista. Las evaluaciones se realizaron cada 24 horas, midiendo el crecimiento radial del antagonista y del patógeno, y el crecimiento de la colonia del patógeno sin antagonismo (figura 1).
Figura 1 En secuencia se evidencia antagonismo in vitro de Trichoderma spp. Vs Fusarium spp en cultivo dual, seguido de una placa petri con crecimiento de las cepas sin antagonismo.
La eficiencia del biocontrol se realizó con la siguiente fórmula adaptada por Aquino et al., 2008:
Dónde: EB = Eficiencia del biocontrol; CPT = Crecimiento del patógeno sin el antagonista; CPA = Crecimiento del patógeno con el antagonista.
Evaluación del antagonismo en casa de malla
Seleccionada la cepa Trichoderma spp TC05 por mayor eficiencia y por la capacidad de inhibir entre 73-91 % el crecimiento micelial de los cinco aislados de Fusarium spp., fue empleado en el experimento de control de la marchitez vascular (MV) en plantas de berenjena establecido en casa de malla.
Se establecieron varios experimentos con plantas de tres a cuatro hojas verdaderas, en materas de 1,5 kg bajo un diseño completamente al azar con cinco tratamientos y nueve repeticiones. Los tratamientos se realizaron de forma preventiva, depositando 10 mL de la cepa Trichoderma spp. TC05 en varias dosis y una cepa comercial de Trichoderma spp (T. harzianum, T. koningi y T. viridae) en la rizosfera de las plantas, descritos así: T1= TC05 1x108 UFC mL-1; T2= TC05 1x107 UFC mL-1; T3= TC05 1x106 UFC mL-1; T4= Trichoderma spp comercial 1x108 UFC mL-1; T5= control, inoculado con agua. Diez días después se inoculó el patógeno Fusarium spp. FS02, por ser la cepa que presentó en el ensayo anterior la mayor severidad, mediante heridas en el cuello de la raíz y en las raíces, depositando 10 mL de la solución del hongo activo en una concentración de 1x106 UFC mL-1.
Transcurridos 45 días después de la inoculación, fue realizado un muestreo destructivo donde las plantas fueron extraídas cuidadosamente y lavadas sus raíces para retirar restos del sustrato; luego rotuladas y llevadas al laboratorio de Fitopatología de la Universidad de Córdoba, donde con un bisturí se hicieron cortes longitudinales de los tallos y raíces, finalmente, para dar cumplimiento con el postulado de Koch, las plantas que presentaron IDV, fueron llevadas a cámaras húmedas durante 72 horas y obteniendo un reaislamiento del patógeno Fusarium spp. Los tratamientos fueron evaluados calculando la variable de índice de la enfermedad (IE) con la siguiente formula (Bletsos et al., 1999):
Dónde: IEF = índice externo de la enfermedad IEF; IDV = índice de la decoloración vascular.
Empleando escala ajustada de Bletsos, (1999) fueron medidos los IEF con escala de 1 a 6 (Cuadro 1) dependiendo de los síntomas externos y el IDV con escala de 1 a 4 (Cuadro 2) dependiendo de los síntomas internos en la planta.
Cuadro 1 Índice de la enfermedad foliar (IEF) y/o índice de infección o severidad para marchitez (Bletsos et al., 1999).
La severidad fue clasificada ajustando escala propuesta por Bletsos (1999) en cinco grupos de acuerdo al índice de la enfermedad IE, donde: valor de 1, plantas aparentemente sanas; valor de 2, suave clorosis en hojas bajeras; valor de 3 a 4, suave clorosis en el follaje y decoloración vascular en las raíces; valor de 5 a 6, defoliación y decoloración vascular en el cuello de la raíz; valor de 7 a 9, síntomas de marchitez y decoloración vascular ascendente en el tallo entre el cuello de la raíz y la parte apical (figura 2).
Análisis estadístico
Los datos de crecimiento radial y eficiencia de biocontrol fueron sometidos a un análisis de varianza (ANAVA) desde las 24 hasta las 192 horas, donde al final del confrontamiento se realizó una prueba de medias de Tukey (p=0,05) para los efectos independientes del patógeno y el antagonista, y una tabla de doble entrada de la interacción para determinar el comportamiento de las cepas de Fusarium spp. frente a las cepas del antagonista Trichoderma spp.
RESULTADOS
Aislados de cepas de Trichoderma spp y Fusarium spp
Fueron aisladas cinco cepas de Trichoderma spp. con la siguiente distribución, en Montería dos: TM01 y TM04; en Cereté dos: TC02 y TC05 y una en San Carlos: TS03. En los lotes comerciales, de las plantas con síntomas de MV también fueron aislados cinco cepas patogénicas de Fusarium spp, una en Montería: FM01; dos en Cereté: FC03 y FC04 y dos en San Carlos: FS02 y FS05. La presencia de Fusarium spp., de acuerdo con Ma et al. (2013) se debe a que este hongo posee un mecanismo de patogenicidad especifico de acuerdo con la especie vegetal donde hospeda, además, puede sobrevivir en el suelo como micelio o esporas, inicia infección en las raíces, en partes de la planta por encima del suelo, a través del aire o el agua.
Efecto antagónico In Vitro
De acuerdo con el análisis de varianza, el efecto inhibitorio de los aislados nativos de Trichoderma spp., sobre las cinco cepas de Fusarium spp., fue observado en los cultivos duales desde las 24 horas después del enfrentamiento. Los resultados del antagonismo a las 192 horas se presentan en la Cuadro 1. La cepa Trichoderma TC05 fue la que mayor eficiencia de biocontrol presentó, entre 73,8 y 91,5 % sobre las cinco cepas de Fusarium spp., seguido de las cepas TM01, TS03, TM04 y TC02 (Cuadro 3). Los resultados concuerdan con Peña and Pavone, (2020) quienes obtuvieron más del 90% de eficiencia con cepas de Trichoderma spp, sobre patógenos del cultivo de pimentón en Venezuela, al igual que los reportados por Samaniego et al. (2018), donde fueron evaluadas cepas nativas de Trichoderma spp. de la provincia Matanzas, Cuba. El aislamiento Fusarium sp FS02 fue la cepa más agresiva In Vitro, debido a que presentó menor inhibición frente a las cinco cepas de Trichoderma.
El mecanismo de biocontrol de la cepa Trichoderma TC05 sobre las diferentes cepas de Fusarium puede explicarse por la alta velocidad de crecimiento micelial, lo que le permite invadir rápidamente las colonias del fitopatógeno, compitiendo por espacio, metabolismo y nutrientes; además, el género Trichoderma tiene la capacidad de inhibir la esporulación y la germinación de esporas de hongos patógenos (Mesa et al., 2019).
Cuadro 3 Efecto en el crecimiento radial de las cepas Trichoderma spp y Fusarium spp., a las 192 horas después de la inoculación en el medio de papa dextrosa agar, en cultivo dual.
Trat = Tratamiento; CR = crecimiento radial de cepas de Trichoderma spp.; DC= diferencia de crecimiento; CRF = crecimiento radial de las cepas de Fusarium spp.; EB %= eficiencia de biocontrol. Letras iguales en la columna no difieren significativamente Tukey (p<0,05). Elaboración: autores
Esta alta eficiencia de biocontrol de las cepas de Trichoderma spp., como antagonista de Fusarium spp., generalmente la literatura reporta eficiencia superior al 50 % (Michel et al., 2019).
Efecto del antagonismo en casa de mallas
La cepa nativa de Trichoderma spp. TC05 y la cepa comercial de Trichoderma spp., protegieron eficientemente las plantas de berenjena de la MV, siendo agrupadas en los Índices de la enfermedad IE 1 y 2; mientras que el testigo sin protección se agrupó en los IE 4 y 5 (Cuadro 4). El tratamiento testigo presentó síntomas de la enfermedad como clorosis de forma generalizada, decoloración de color marrón en las raíces, cuello y tallo; además fue el único tratamiento con plantas muertas (55 %), resultado que coincide con los obtenidos por Sentena (2015). Los tratamientos de biocontrol no presentaron decoloración vascular DV, ni MV; sin embargo, algunas plantas presentaron leve clorosis en las 2 hojas bajeras y al hacer cortes longitudinales no hubo DV, lo anterior posiblemente por deficiencia de nitrógeno y ataques de insectos chupadores que se presentaron durante el experimento. Este resultado permitió corroborar el alto grado de patogenicidad que ejerció la cepa Fusarium sp. FS02, cuando no es tratada con la cepa de Trichoderma sp TC05.
Cuadro 4 Índice de la enfermedad y porcentaje de mortalidad de plántulas de berenjena bajo biocontrol de cepas de Trichoderma sp sobra la marchitez vascular por Fusarium spp.
Índice de la enfermedad IE: 1= plantas aparentemente sanas; 2= suave clorosis en hojas bajeras; 3= suave clorosis en el follaje y decoloración vascular en las raíces; 4= decoloración vascular en raíces y en el cuello de la raíz; 5= marchitez y decoloración vascular ascendente, escala ajustada de Bletsos (1999).
La prueba de comparación de rangos para IEF, IDV e IE, muestra que las plantas tratadas con TC05 en las diferentes dosis y con Trichoderma sp comercial, tuvieron el mismo efecto biocontrolador y fueron significativamente diferentes al testigo, sin antagonista (Cuadro 5).
Cuadro 5 Índices de la enfermedad externa IEF, índice de la decoloración vascular IDV e índice de la enfermedad IE en plántulas de berenjena a los 45 días después de inoculadas con Fusarium sp FS02.
+: Concentración indicada en UFC/mL-1. Promedios con igual letra dentro de la misma columna, no difieren estadísticamente según la prueba DMS de Fisher (P< 0,05). Elaboración: autores
El efecto biocontrolador de la cepa Trichoderma sp TC05, concuerdan con lo reportado por varios investigadores que emplearon biopreparados con cepas nativas de Trichoderma spp en el manejo de patógenos fungosos del suelo, en diferentes cultivos (Romero et al., 2017).Los tratamientos con Trichoderma sp TC05 en las tres concentraciones evaluadas, al igual que Trichoderma sp comercial, protegieron eficientemente las plántulas de berenjena contra la MV; además, las plantas protegidas con esta cepa tuvieron un mejor crecimiento y desarrollo expresado en mayor altura de planta AP, Mayor número de hojas presentes NHP y menor número de hojas caídas NHC, comparados con el testigo (Cuadro 6).
Cuadro 6 Altura de planta AP, número de hojas presentes NHP y número de hojas caídas NHC de plántulas de berenjena C015, bajo biocontrol de Trichoderma spp sobre el patógeno Fusarium spp.
+: cada cepa a la concentración indicada en UFC/mL-1. CV: coeficiente de variación; **: Diferencias significativas al 1%. Promedios con igual letra dentro de la misma columna, no difieren estadísticamente según la prueba de Tukey (p<0,05). Elaboración: autores
CONCLUSIONES
El uso del biocontrolador Trichoderma spp. cepa nativa TC05, en condiciones in vitro y en casa de malla demostró su potencial antagónico, esta cepa es una alternativa viable que contrarresta el daño causado por el patógeno Fusarium spp en condiciones de campo, por ser una cepa nativa del Caribe húmedo, por lo tanto, es una opción amigable con el ambiente y el ser humano que permitiría ser una herramienta clave en el manejo integrado de la marchitez vascular en el cultivo de berenjena para los agricultores del departamento de Córdoba, Colombia.
