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INTRODUCCIÓN
Las especies de Ganoderma son hongos basidiomycetes degradantes de la madera con cuerpos fructíferos duros (Boh et al., 2007). Ganoderma lucidum también conocido como Reishi o Lingzhi es una especie de la clase Agaricomycetes, que pertenece a la familia Ganodermataceae del orden Polyphorales (Pinya et al., 2019), esta especie es rica en compuestos bioactivos con potencial medicinal, principalmente triterpenoides, polisacáridos, nucleótidos, esteroides, ácidos grasos, proteínas y glicopéptidos (Cör et al., 2018).
Las especies de Ganoderma no están clasificadas como hongos comestibles, ya que tienen un sabor amargo y dureza en sus cuerpos fructíferos y no tienen la textura carnosa característica de los hongos comestibles, pero su importante valor económico se debe a sus propiedades medicinales (Hapuarachchi et al., 2018). Actualmente, G. lucidum es utilizado como materia prima para la producción de alimentos funcionales (Uddin et al., 2019) y de las diferentes partes de su cuerpo fructífero, micelio o esporas se pueden encontrar en el mercado, diversos productos, tales como cápsulas blandas, inyecciones, tabletas, bebidas (Liu & Zhang, 2018), polvo, té (Sangeetha et al., 2019), extractos, suplementos dietéticos (Wu et al., 2017), café, productos de esporas, jarabes, pastas de dientes, jabones y lociones, también se comercializan alimentos y suplementos farmacológicos que mejoran el sistema inmunológico y mejoran las funciones metabólicas (Hapuarachchi et al., 2018). Recientemente, los efectos farmacológicos del género Ganoderma han atraído una atención considerable por parte de la comunidad científica mundial (Zhao et al., 2019), en especial por el contenido de polisacáridos y triterpenoides de G. lucidum, que han sido reconocidos como una fuente natural prometedora de compuestos inmunomoduladores, anticancerígenos y antioxidantes (Liu & Zhang, 2019) además, numerosos autores han evidenciado que los triterpenos y polisacáridos son los principales componentes fisiológicamente activos de G. lucidum (Hu et al., 2018) y se ha demostrado que los extractos de G. lucidum en varios solventes son eliminadores de radicales libres, anti-diabéticos y antioxidantes (Sharif et al., 2017).
Los efectos de eliminación de radicales libres por G. lucidum están relacionados con su mecanismo terapéutico para prevenir y tratar enfermedades, como bronquitis crónica, hipertensión, hiperlipidemia, diabetes, hepatitis, patología tumoral y envejecimiento. Por lo tanto, la función principal de los productos de G. lucidum es inhibir las especies reactivas de oxígeno (ROS) (Lin & Deng, 2019) mediante la actividad de varios de sus compuestos como los fenólicos (Oludemi et al., 2018). Por consiguiente, el objetivo de esta investigación fue evaluar el contenido de polifenoles totales de extractos etanólicos y acuosos del cuerpo fructífero deshidratado y molido de Ganoderma lucidum que fue conservado en refrigeración por un periodo de seis años, así como la determinación de grupos funcionales estructurales mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR); lo anterior para la evaluación de la estabilidad química de bioactivos presentes en G. lucidum.
MÉTODO
Localización
El trabajo se realizó en el laboratorio e invernadero del Grupo de Investigación en Biotecnología Agroindustrial y Ambiental (BIOTA) de la Universidad de Nariño en la ciudad de San Juan de Pasto, Colombia, ubicada a una altura de 2.527 m.s.n.m, con una temperatura promedio de 12 °C, y precipitación anual de 1.059 mm (IDEAM Pasto).
Material fúngico
Se emplearon basidiomas de Ganoderma lucidum (cepa WC806 UPenn) deshidratados, molidos y conservados en refrigeración, obtenidos del cultivo en el invernadero del Grupo BIOTA (año 2014), en sustrato lignocelulósico con la siguiente composición en base seca: 78 % aserrín de Pandala talaumanariñensis, 20 % paja de Avena sativa, 1 % de sacarosa y 1 % de CaCO3, siendo la humedad de los sustratos de cultivo del 70 %.
Preparación de los extractos
Los extractos se prepararon de acuerdo a la metodología de Santillán et al. (2017). Para la obtención de los extractos etanólicos (EE) se adicionaron 2 g de muestra seca del basidioma en polvo, en 100 mL de etanol al 90 % durante 24 h con agitación magnética en oscuri dad y temperatura ambiente, se filtró y aforó a 100 mL con etanol al 90 %. Los extractos acuosos (EA) se prepararon agregando 2 g de muestra seca del basidioma en polvo, en 100 mL de agua destilada en ebullición, de igual forma se filtró y aforó a 100 mL con agua destilada. Se prepararon tres muestras por cada extracto que fueron simbolizadas como EEn (n=1,2 o 3) y EAn (n=1,2 o 3), las cuales cada una fueron evaluadas por triplicado.
Contenido de polifenoles totales
La cuantificación de polifenoles tota les se realizó por el método de Folin Ciocalteu (F-C), utilizando Na2CO3 al 20 % p/v como buffer, la curva de calibración se elaboró utilizando una solución de ácido gálico a 1000 ppm y, a partir de esta solución, se prepararon soluciones de 50, 100, 300, 500 y 700 ppm de ácido gálico (GA) en agua destilada tipo II. En un matraz se agregó 1 mL de muestra, 1 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 4 mL de solución de Na2CO3 y se aforó a 10 mL con agua destilada, se calentó a 50 ºC en baño María por 10 min y se midió la absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro marca Thermo scientific genesys 10 UV (Santillán et al., 2017). Las muestras se analizaron de igual forma sustituyendo el patrón GA por 1 mL del extracto a evaluar. El resultado promedio de las lecturas se expresó en mg equiva lentes de ácido gálico por gramo de muestra (mg GAE/g).
Espectros FTIR
G. lucidum en polvo fue mezclado uniformemente con cristal KBr, la mezcla se presionó manualmente hasta formar la tableta y la medición se realizó en un espectrofotómetro IR Affinity 1S. El espectro FTIR es generalmente aceptable cuando se logra una transmisión del 60 al 70 % (Choong et al., 2013).
RESULTADOS
Al realizar la evaluación del contenido de polifenoles totales, según el ANOVA unidireccional, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p= 0,1217) entre la media del contenido de polifenoles totales (mg GAE/g) y el tipo de extracto, con un nivel del 95,0 % de confianza. En la figura 1 se observa que no existen dichas diferencias, no obstante, la concentración de polifenoles totales de G. lucidum en los extractos acuosos (EA) fue más alta frente a los extractos etanólicos (EE), tal como se evidencia en el Cuadro 1.
Figura 1 Gráfico de medias de polifenoles totales expresado en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra.
Los resultados encontrados en este estudio para los extractos acuosos fueron superiores a los de otras investigaciones. Rašeta et al. (2016) determinaron el contenido de polifenoles totales en extractos acuosos de cuerpos fructíferos de G. applanatum de 21,07 ± 0,42 mg GAE/g y 11,38 ± 0,67 mg GAE/g para G. lucidum. En cuanto a extractos alcohólicos de hongos del género Ganoderma, se reportan valores mayores a los de la presente investigación. Mishra et al. (2014) reportaron un valor de 28,27 mg GAE/g en peso seco en extractos metanólicos de G. lucidum, mientras que Huerta et al. (2016) reportaron 49,15 ± 0.17 mg GAE/g en extractos etanólicos de G. curtisii.
El tipo de solvente tiene una influencia significativa en la dinámica del proceso de extracción y la composición química del extracto (Veljović et al., 2019). Pese a no encontrar diferencias estadísticamente significativas según el tipo de solvente empleado en este estudio, se evidenció una mayor concentración de polifenoles totales en los extractos con agua caliente, contrariamente a que los polifenoles son más solubles en disolventes orgánicos polares como el etanol y metanol (Sudheer et al., 2019). Esto apunta a que en los extractos acuosos obtenidos se pudieron arrastrar otros compuestos como los polisacáridos, comúnmente asociados a los polifenoles, ya que los macrohongos poseen triterpenos y polisacáridos en sus estructuras especializadas para la formación de esporas (Santillán et al., 2017), siendo estos últimos altamente solubles en agua caliente (Veljović et al., 2019).
La actividad antioxidante en basidiomicetes se ha relacionado con la presen cia de compuestos de bajo peso molecular (polifenoles), pero también se atribuye al contenido de triterpenos y poli sacáridos de alto peso molecular (Santillán et al., 2017). Lo anterior indica que, tanto el disolvente uti lizado como la temperatura, influyen en la extracción de polifenoles como de otros compuestos del basidioma de G. lucidum y de esta forma la actividad antioxidante en extractos acuosos del hongo, puede ser mayor en comparación con su valor en extractos puros. Lee y Lim (2019) encontraron valores más altos en el contenido de polifenoles totales en extractos acuosos de G. lucidum (33,1 ± 1,9 mg GAE/g) que en el extracto de polisacáridos de G. lucidum (5,8 ± 0,6 mg GAE/g), dada la pérdida de compuestos activos como consecuencia del proceso de purificación.
Por otra parte, el aumento del contenido de polifenoles totales en el extracto obtenido por ebullición en agua del cuerpo fructífero de G. lucidum, responde a la liberación de compuestos fenólicos, además del arrastre de compuestos insolubles, dada la descomposición celular y de enzimas oxidativas por el efecto térmico, por lo cual, para la preservación del contenido fenólico es recomendable que el proceso de extracción bajo condiciones de ebullición acuosa se realice por un tiempo inferior a cinco minutos (Minh et al., 2019).
En este estudio, los extractos acuosos del basidioma de G. lucidum se obtuvieron por ebullición durante tres minutos, reportando un valor máximo de 32,44 ± 0,7023 miligramos Equivalente de ácido gálico por gramo de muestra en base seca (mg GAE/g), destacando de esta forma que el agua es un excelente solvente de extracción, no solo por disminuir costos del proceso y la contaminación derivada del uso de solventes orgánicos, sino también por la generación de extractos con elevada concentración de compuestos fenólicos. Esto, es además ventajoso en la preparación de té e infusiones de carácter alimentario, pues asegura el consumo de compuestos bioactivos con actividad antioxidante que hacen parte de G. lucidum y que son beneficiosos para la salud humana (Santa Rosa, 2016).
De hecho, los extractos acuosos en caliente de G. lucidum concentran mejor los polisacáridos y diversos estudios han concluido que estos compuestos son potentes antioxidantes (Wu & Wang, 2009). Además, G. lucidum tiene alta actividad captadora de radicales libres, la cual está asociada a la presencia de compuestos triterpénicos que son utilizados como mecanismo de defensa contra sustancias oxidantes (Wang et al., 2019).
Espectro FTIR de Ganoderma lucidum
En el espectro infrarrojo de G. lucidum (Figura 2) se observan las siguientes bandas: 3372,59 cm-1; 2927,99 cm-1; 1651,09 cm-1, 1563,33 y también se observan varios picos seguidos entre 1500 cm-1 y 1000 cm-1.
El espectro FTIR de este estudio es similar al encontrado por Choong et al. (2013) a partir de un producto comercial con Lingzhi 100 % natural, lo que indica que los compuestos bioactivos de las muestras empleadas en esta investigación se conservaron sin sufrir degradación durante el proceso de refrigeración del polvo de G. lucidum durante 6 años. El espectro FTIR del producto comercial con Lingzhi presentó bandas anchas y fuertes en la región de 3400-3300 cm-1 que pueden asignarse al modo de estiramiento O-H, mientras que el pico a 2925 cm-1 corresponde al estiramiento C-H. Igualmente, se ha reportado el pico a 2923 cm-1 como estiramiento de C-H en extractos crudos de G. lucidum (Sangeetha et al., 2019). En el espectro desde 1750 cm-1 a 1500 cm-1 se encontraron picos que corresponden a amida de proteína, en el que para el producto comercial con Lingzhi se reporta un pico a 1639 cm-1 asignado a la amida I de proteínas y un pico a 1556 cm-1 asignado a la amida II (Choong et al., 2013).
En el espectro FTIR de esta investigación se observa un pico fuerte a 3372,59 cm-1 (Figura 2) que corresponde al estiramiento O-H/C-H del grupo ácido carboxílico. Los grupos alquilo (C-H) y carbonilo (C=O) se observaron a 2927,99 cm-1 y 1651,09 cm-1, respectivamente y los picos en las regiones de 1780-800 cm-1 son correspondientes a amida I, amida II y proteínas.
Bandas entre 1000 y 1100 cm-1 indican la presencia de polisacáridos, más exactamente la banda 1080 cm-1, la cual se asigna al estiramiento de CO en β-glucanos y carbohidratos (Kozarski et al., 2012). En el presente estudio, en el espectro FTIR se observa una banda a 1079,19 cm-1, la cual indicaría la presencia de β-glucano; similar resultado fue encontrado por Ma et al., (2018) en muestras de micelios deGanodermaliofilizadas que presentaron la banda en 1078 cm−1, relacionada al estiramiento de β-glucanos. Además, en la región de 1780-800 cm-1 se puede observar una banda fuerte en 1651,09 cm-1 que podría corresponder a la absorción de compuestos aromáticos, probablemente de los polifenoles. Kozarski et al., (2012) encontraron una banda fuerte en 1635 cm-1 en compuestos aislados de G. lucidum, la cual indicó la presencia de compuestos fenólicos, pese a que esa región es característica de las proteínas, la banda relativamente intensa se superpuso con las vibraciones de estiramiento fenólicas.
CONCLUSIONES
Los resultados de esta investigación indican que no hay diferencia estadísticamente significativa entre el contenido de polifenoles de los extractos acuosos y etanólicos de G. lucidum, sin embargo, los extractos acuosos presentaron mayor contenido de polifenoles totales.
La concentración de polifenoles totales en extractos acuosos y etanólicos de G. lucidum, al igual que las bandas del espectro de absorción FTIR, resultaron comparables con los resultados de otras investigaciones por lo que se verifica la presencia de compuestos polifenólicos y de otros compuestos bioactivos como los polisacáridos (β-glucanos), lo que demuestra que la refrigeración del hongo deshidratado y molido en un periodo de seis años, influye positivamente en la estabilidad química de dichos compuestos.
