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INTRODUCCIÓN
El cacao (Theobroma cacao L.) es un árbol nativo de las regiones tropicales húmedas de la parte norte de Suramérica y de Centroamérica (Motamayor et al., 2002). Posee numerosos componentes bioactivos como polifenoles, que son potentes antioxidantes para la salud humana; metilxantinas y componentes precursores de aroma, en menor proporción (Perea-Villamil et al., 2009; Pico-Hernández et al., 2019; Villamizar-Jaimes & López-Giraldo, 2017). La producción de cacao es una práctica agrícola que origina productos de exportación importantes para economías en desarrollo de países en África, Asia, Oceanía, Latinoamérica y el Caribe (Jiménez Tobón, 2015), sin embargo, la mayoría del cacao colombiano y, por ende, sus productos derivados como el chocolate, poseen concentraciones elevadas de cadmio.
El cadmio (Cd) es un metal pesado clasificado como contaminante ambiental, proveniente de residuos tanto de fuentes naturales como de prácticas industriales y de agricultura (Hernández-Martínez & Navarro-Blasco, 2012; Satarug et al., 2017; Alves et al., 2018). Como los metales pesados están presenten en productos alimenticios de consumo humano y animal, el contenido de Cd es un criterio indispensable a la hora de evaluar los niveles de toxicidad de los alimentos (Alexander et al., 2009; Zhuravlev et al., 2015; Satarug et al., 2017). Se ha determinado su presencia en granos y en productos derivados del cacao, en la mayoría de los casos, la concentración en los granos cultivados en diferentes regiones de Latinoamérica supera el límite que estipula la Unión Europea (1,0 mg/kg) (European Food Safety Authority, 2011).
Se ha encontrado su presencia en granos de cacao producido en sistemas agroforestales y como de monocultivo, sin diferencias significativas en el contenido (Gramlich et al., 2017). También realizaron la cuantificación con valores promedio superiores al máximo permitido por las normas europeas con 0,9 mg/kg (Chavez et al., 2015; Arévalo-Gardini et al., 2017; Gramlich et al., 2018).
En Colombia, no hay una legislación para el control del Cd en el cacao (Jiménez-Tobón, 2015), pese a esto, altos contenidos podrían limitar la exportación del grano a clientes de la unión europea quienes aprecian los granos de cacao producidos por sus cualidades de fino y de aroma (International Cocoa Organization, 2019). Algunos reportaron concentraciones de 4,05 mg/kg en chocolates amargos (con 65 % de cacao) comprados en supermercados colombianos, valores muy superiores añ límite permitido por la Unión Europea (0,8 mg/kg) (Echeverry & Reyes, 2016). Sin embargo, algunos productos de chocolate pueden tener concentraciones menores, como por ejemplo el chocolate de mesa en polvo y granulado proveniente de Chiquinquirá, Colombia, que se determinó por voltamperometría diferencial de pulso de redisolución anódica arrojando entre 0,214 y 0,260 mg/kg (Chaparro-Acuña et al., 2017; Lo Dico et al., 2018).
Aunque se ha determinado la cantidad total de Cd en diferentes matrices (Chandra et al., 2014; Zhuang et al., 2016; Bhat et al., 2018), es importante destacar el papel de su bioaccesibilidad, que se define como la cantidad de sustancia que está disuelta en la parte digestiva y aprovechable para absorción (Peixoto et al., 2016), por lo que algunas investigaciones se han enfocado en el estudio de la bioaccesibilidad de los metales pesados para diversas matrices de alimentos, como por ejemplo, los factores que afectan la bioaccesibilidad del Cd en bebidas achocolatadas donde encontraron que ésta varía según el tipo de muestra, siendo mayor en la formulación light con aproximadamente 11 % (Peixoto et al., 2016; Francisco et al., 2018). También se encontró que, en concentraciones de sales biliares mayores, la bioaccesibilidad del Cd aumenta 3 veces más y, tanto el pH como la presencia de lipasa en la digestión gastrointestinal in vitro, no varía significativamente la bioaccesibilidad del Cd (Peixoto et al., 2016). Barraza y colaboradores determinaron la bioaccesibilidad gástrica humana en grano de cacao crudo y en licor de cacao y obtuvieron valores entre el 90 y 100 % en las digestiones gástricas in vitro para grano y licor de cacao (Barraza et al., 2017).
Algunos autores determinaron la bioaccesibilidad de otros compuestos en productos de cacao, resaltando la selectividad de algunos compuestos en la digestión pancreática (Mounicou et al., 2003), sin embargo, esto no sucede con el Cd, donde pueden predominar altos valores de bioaccesibilidad en las fases de digestión, especialmente en la gástrica (Gültekin-Özgüven et al., 2016; Toro-Uribe et al., 2019).
Existen diversos trabajos de investigación en torno a la concentración total de Cd en cacao y sus productos; no obstante, son pocos los trabajos de investigación que estudian la bioaccesibilidad del cadmio en función de los componentes de la matriz, tal es el caso de las matrices como bebida de chocolate en polvo o en grano de cacao.
Por lo anterior, este trabajo se enfocó en el estudio y evaluación del efecto de los componentes principales, comúnmente usados en las formulaciones en chocolate (concentración inicial de cadmio, licor de cacao, azúcar y leche), sobre la bioaccesibilidad de cadmio por medio de digestión gastrointestinal in vitro.
MÉTODO
Reactivos y muestras
Las muestras de cacao fermentado y seco se obtuvieron del centro de acopio de cacao en el municipio de San Vicente de Chucurí, uno de los mayores productores en el Departamento de Santander. De allí, se seleccionaron de 6 a 10 muestras, con concentraciones de Cd entre 1 y 10 mg/kg y a una altitud entre 550 y 1400 m.s.n.m. También, se utilizaron como ingredientes de la preparación leche en polvo y azúcar refinada de marca comercial, libre de Cd. Los reactivos para el procedimiento de digestión gastrointestinal in vitro y la cuantificación de Cd fueron pepsina de mucosa gástrica porcina, pancreatina de páncreas porcino, soluciones estándar de sales biliares, carbonato de amonio y ácido nítrico concentrado; todos marca Merck, mientras que el agua usada en el desarrollo de la investigación fue ultrapura (0,056 μS/cm) tipo 1.
Diseño experimental para el efecto de los factores
Las coberturas de chocolate para las digestiones gastrointestinales in vitro se fabricaron basado en la Resolución 1511 del INVIMA (Ministerio de la Protección Social, 2011), aplicando un diseño 24 más puntos centrales, con cuatro factores que describen los componentes principales de la formulación de cacao (Cuadro 1), con un total de 96 experimentos, teniendo el valor de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd como variable de respuesta. El diseño de experimentos se ejecutó y se analizó mediante el software Statistica.
Preparación de las formulaciones
Para la elaboración del licor de cacao, se tostaron los granos de cacao fermentados y secos a una temperatura de 120 °C durante 20 min. Luego, se retiró la cascarilla del grano de manera manual y se realizó una premolienda durante 2 min a 4 °C. Por último, se refinó el polvo de cacao resultante hasta obtener el licor. Una vez determinadas las cantidades de los ingredientes de las formulaciones por medio de los puntos del diseño experimental, se mezclaron manualmente las proporciones de licor de cacao, leche y azúcar y se refinaron hasta obtener una consistencia líquida y uniforme. Se suprimieron las etapss de atemperado y moldeado dado que solo afectan a la textura del producto.
Cuantificación de Cd total
Se cuantificó el contenido de Cd total presente en las coberturas de chocolate con base en el procedimiento propuesto por Echeverry y Reyes (2016). Se calcinaron aproximadamente 3 g de la muestra en una mufla a 600 °C durante 4 horas. Luego, se disolvieron en 10 mL de HCl 6 N y se llevaron a ebullición por 5 min. Por último, se filtró el contenido con papel filtro, se adicionaron 3 gotas de HNO3 al 65 %, y se aforó a 25 mL. Las soluciones resultantes se analizaron por Espectrometría de Absorción Atómica (AAS) en llama utilizando un equipo PinAAcle 400 Perkin-Elmer provisto de gas de combustión aire-acetileno a una presión de 2,5 Pa y un flujo de 1 L/min. La absorbancia de las muestras se leyó directamente a una longitud de onda de 254 nm.
Digestión gastrointestinal in vitro
Los ensayos de digestión gastrointestinal in vitro se desarrollaron siguiendo el procedimiento descrito por Minekus et al. (2014) con modificaciones. Para la digestión gastrointestinal in vitro, se prepararon soluciones estándar electrolíticas (Cuadro 2) que simularon los fluidos de la digestión gástrica y digestión pancreática usando NaOH 1 M y HCl 6 M para ajustar y mantener el pH de las soluciones.
Para la digestión gástrica in vitro, se pesaron aproximadamente 5 g de cada formulación de chocolate y se mezclaron con 7,5 mL de SFG, se adicionaron 1,6 mL de solución de pepsina porcina de 25000 U/mL (se disolvió la pepsina en SFG), 5 µL de CaCl2 0,3 M y 0,8 mL de HCl 1 M para llegar a pH 3,0. Todo el procedimiento se realizó durante 2 horas con agitación constante, controlando la temperatura entre 36 y 37 °C y un valor de pH entre 2,9 y 3,1. Para la digestión pancreática in vitro, se adicionaron 11 mL de SFP a la solución resultante de la anterior digestión, luego se adicionaron 5 mL de solución de pancreatina de 800 U/mL (se disolvió la pancreatina con SFP), 2,5 mL de bilis al 0,5 %, 40 µL de CaCl2 0,3 M, 0,8 mL de NaOH 1 M para llegar a pH 7,0 y 0,3 mL de agua. El procedimiento tuvo una duración de 2 horas con agitación constante, controlando la temperatura entre 36 y 37 °C y un valor de pH entre 6,9 y 7,1.
La determinación del contenido de Cd bioaccesible se basó en la metodología propuesta por Barraza et al. (2017) con modificaciones: se adicionó la solución resultante de la digestión pancreática a un tubo cónico de 50 mL y se centrifugó a 4000 rpm por 10 min. Luego, se adicionó el sobrenadante a un vaso precipitado de 100 mL, se aagregaron 5 gotas de HNO3 al 65 %, se agitó un poco hasta observar un precipitado y se filtró el contenido con papel filtro recogiendo el filtrado en un balón aforado de 50 mL. Por último, se aforó la solución a 50 mL y se analizó por AAS en llama utilizando como gas de combustión aire-acetileno a las mismas condiciones descritas para la cuantificación de cadmio total.
Determinación de la bioaccesibilidad del Cd
Se determinó la bioaccesibilidad del Cd (% Cdbio) a partir de la Ecuación 1:
Donde [Cd bioaccesible] corresponde al contenido de Cd presente en la solución resultante de la digestión gastrointestinal sobre la cantidad de la formulación de chocolate utilizada en la digestión; y [Cd total] que es la concentración del Cd total de la formulación de chocolate.
Correlación de bioaccesibilidad de cadmio con componentes de formulaciones
Para determinar la correlación entre los componentes en las formulaciones de chocolate y la bioaccesibilidad de Cd, se usó un ANOVA a los resultados obtenidos. También, se evaluó por medio de superficie de respuesta, diagramas de Pareto y correlación de datos predichos con observados. Se realizó un ajuste de la ecuación que describió el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd en función de los factores evaluados que fueron significativos (cacao, azúcar, leche en polvo y concentración de Cd en cacao).
Los datos obtenidos se ajustaron a un modelo matemático de efectos lineales con interacciones como se presenta en la Ecuación 2.
Donde Y es el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd, Xn es el coeficiente de cada variable y A, B, C y D son las variables de cantidad de cacao, leche en polvo, azúcar y concentración de Cd en cacao respectivamente.
Finalmente, se procedió a determinar las concentraciones de los componentes de la formulación de chocolate que posea menor valor en la bioaccesibilidad de Cd.
RESULTADOS
Los resultados mostraron que el valor promedio del porcentaje de bioaccesibilidad de Cd fue de 19,61 % que y los valores máximo y mínimo fueron de 32,56 y 7,22 % respectivamente (Cuadro 3).
Estos valores muestran la influencia de la formulación sobre el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd; por tal motivo, es importante determinar las cantidades de cacao, leche y azúcar, y la concentración de Cd en el cacao adecuadas para la elaboración de formulaciones de chocolate con menores valores de porcentaje de bioaccesibilidad.
Se aplicó un ANOVA a los valores obtenidos con la ecuación 2 para comparar la significancia de las variables en el modelo (Cuadro 4). Al comparar el valor p de cada variable se puede apreciar que solo la interacción BD, que corresponde a la cantidad de leche y a concentración de Cd en el cacao, no tiene efecto significativo (valor p>0,05). Asimismo, se observa que las variables correspondientes a la cantidad de cacao y de leche son las que mayor influencia posee en el modelo inicial propuesto, debido a su valor F.
Los efectos estandarizados del modelo inicial se pueden observar en el diagrama de Pareto (Figura 1) en el que se visualiza que las variables cantidad de cacao y de leche son las de mayor inciden en el modelo. Sin embargo, la cantidad de cacao (que posee la mayor influencia) tiene un efecto negativo en el porcentaje bioaccesibilidad de Cd, mientras que la cantidad de leche y la concentración de Cd en cacao posee un efecto positivo, observándose en el signo negativo y positivo de cada efecto estandarizado, respectivamente (Figura 1).
Figura 1 Diagrama de Pareto con los valores absolutos de los efectos estandarizados estimados para el modelo inicial planteado en la ecuación. Las variables A, B, C y D corresponden a cantidad de cacao, leche en polvo, azúcar y concentración de Cd en cacao respectivamente.
Efecto de la cantidad de cacao
Según los resultados, la cantidad de cacao en la formulación de chocolate aporta en el contenido de Cd total, por lo tanto, a mayor cantidad de cacao utilizado, mayor contenido de Cd total. Siguiendo la misma lógica, se esperaría que, a mayor cantidad de cacao, mayor contenido de Cd en la fase bioaccesible después de la digestión gastrointestinal; sin embargo, este efecto es contrario. Una de las razones por las que se presenta este efecto es por la presencia de grasa en el cacao: la presencia de componentes no polares (grasa) impide la liberación de metales y moléculas polares en la fase polar y disminuye la probabilidad de ser bioaccesibles después de la digestión gastrointestinal (Martini et al., 2018). Además, en la digestión pancreática hay presencia de bilis, que contribuye a la disolución y degradación de las grasas y, por ende, puede producir compuestos más pequeños que pueden atrapar metales o moléculas polares de menor tamaño en forma de micelas o complejos insolubles en la digestión. Esto disminuye la cantidad de Cd libre en la solución restante de la digestión y disminuye la concentración de Cd bioaccesible después de la digestión gastrointestinal (Peixoto et al., 2016; Barraza et al., 2017).
Efecto de la cantidad de leche
Teniendo en cuenta la cantidad de leche en polvo que se utilizó para la elaboración del producto, a medida que este valor incrementa, el porcentaje de bioaccesibilidad también incrementa. Se corroboró que la leche en polvo no contribuye al contenido de Cd total a la formulación, sin embargo, el contenido de aminoácidos polares y de ácidos orgánicos es elevado. La presencia de un componente polar de gran proporción en las formulaciones de chocolate como la leche y, sumado a esto, el alto contenido de acidez presente en ella ayuda a liberar más iones de Cd2+ en la fase polar y aumentar la probabilidad de ser bioaccesible después de la digestión gastrointestinal (Cobbett & Goldsbrough, 2002).
Efecto de la cantidad de azúcar
A medida que la cantidad de azúcar usada en las formulaciones se incrementó, teniendo constantes las demás variables de la formulación, el porcentaje de bioaccesibilidad disminuyó. Aunque el efecto de la cantidad de azúcar es pequeño en comparación con el efecto de las otras variables (Figura 1), ésta es una variable significativa en el modelo inicial, lo que puede ser atribuido a la formación de complejos de Cd insolubles con la sacarosa y otros endulzantes en la fase intestinal de la digestión, reduciendo la concentración de Cd bioaccesible y, por ende, el porcentaje de bioaccesibilidad de Cd (Peixoto et al., 2016).
Efecto de la concentración de Cd en el cacao
Al incrementar la concentración de Cd en el cacao, el porcentaje de bioaccesibilidad también incrementa, debido a que la matriz posee mayor cantidad de Cd que puede ser solubilizada y ser bioaccesible en las digestiones gastrointestinales.
Modelo matemático
De acuerdo con lo anterior, los datos se ajustaron a un nuevo modelo corregido de efectos lineales con interacciones, eliminando la interacción BD (cantidad de leche y [Cd] en cacao) la cual no fue significativa (Ecuación 3):
El modelo ajustado permitió explicar el comportamiento de los datos experimentales en un 94,01 %, observándose una tendencia lineal entre los datos experimentales y los obtenidos con el modelo ajustado (Figura 2).
Figura 2 Valores observados con respecto a valores predichos con el modelo ajustado para el porcentaje bioaccesibilidad. de Cd.
En la superficie de respuesta se puede observar una tendencia de los datos similares a la reportada en la gráfica de Pareto, con una disminución del porcentaje bioaccesibilidad Cd cuando la cantidad de cacao aumenta, y un aumento en el porcentaje bioaccesibilidad cuando las cantidades de leche aumentan (Figura 3).
Valor mínimo de bioaccesibilidad
Una vez obtenido el modelo matemático para describir el comportamiento del porcentaje bioaccesibilidad de Cd en las formulaciones de chocolate, se obtuvieron los valores de las variables que corresponden a formulaciones con el valor mínimo de bioaccesibilidad de Cd de 7,07 %, donde se obtuvo una formulación con 7 g de cacao, 0 g de leche y 2 g de azúcar, utilizando un cacao de 1,23 mg/kg de Cd. Así mismo, otros valores mínimos se obtuvieron para formulaciones de chocolate con otras concentraciones de Cd en el cacao y mayor cantidad (Cuadro 5). También, se obtuvo el valor experimental de la formulación de chocolate propuesta por el modelo ajustado, obteniéndose un error de 2,08 %.
Cuadro 5 Puntos experimentales de valor mínimo de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd utilizando cacao de [Cd] conocida.
Estos resultados muestran que las formulaciones de chocolate, para cualquier concentración de Cd del cacao utilizado dentro del intervalo del modelo (Cuadro 1), que poseen menor valor de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd corresponden a chocolate negro o amargo (dark chocolate) donde el alto contenido de grasa puede favorecer a la retención del Cd en la digestión gastrointestinal, y la ausencia de compuestos ácidos, como la leche, puede evitar la liberación del Cd en su forma bioaccesible.
Evaluación del modelo
La evaluación del modelo ajustado se adelantó con formulaciones diferentes a los puntos experimentales utilizados para el modelo, se calculó el error del valor prestablecido por el modelo para 10 formulaciones experimentales donde se obtuvieron errores de 8,84 % en promedio (Cuadro 6).
Cuadro 6 Puntos experimentales de formulaciones de chocolate para la validación del modelo ajustado.
El modelo se ajustó para las variables, sin embargo, el modelo puede aplicarse para grandes cantidades de cacao, leche y azúcar (A, B y C respectivamente) siempre y cuando se mantengan las proporciones estipuladas para este modelo (Cuadro 1). Esta afirmación se sustenta en resultados obtenidos (Cuadro 6) para formulaciones de mayor masa; por ejemplo, para una formulación de 4 kg, los valores experimental y presteblecido de bioaccesibilidad de Cd fueron 15,22 y 13,45 %, respectivamente, diferencia que representa tan solo un 11,64 % de error.
Comparación con otros valores
Los valores obtenidos de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd para esta investigación se compararon con resultados reportados por otros autores (Cuadro 7). Si bien, las matrices utilizadas en los otros trabajos no son las mismas, utilizan como base cacao en los productos elaborados.
Una de las diferencias en el valor de porcentaje de bioaccesibilidad de Cd de este trabajo con el trabajo de Barraza y colaboradores es debido a que solo consideraron la digestión gástrica como procedimiento para determinar la fracción de Cd bioaccesible. Una de las razones de esta consideración es que ellos mencionan la probabilidad de absorción de Cd antes de entrar a la fase pancreática, pero es una hipótesis aún por confirmar (Barraza et al., 2017). También, modificaron las condiciones de la digestión para obtener altos porcentajes de bioaccesibilidad y maximizar los efectos de una posible intoxicación (Barraza et al., 2017).
Los valores de bioaccesibilidad del trabajo de Peixoto y colaboradores son menores a los reportados ya que ellos utilizaron diferentes formulaciones de polvo de bebida, algunas de las cuales con adiciones de compuestos funcionales que contribuyeron a una reducción del porcentaje bioaccesibilidad de Cd. Además, optimizaron la cantidad de bilis y el pH en las digestiones gastrointestinales, incluyendo adiciones de compuestos dietarios como pectina y celulosa, que condujeron a menores valores de bioaccesibilidad de Cd (Peixoto et al., 2016).
CONCLUSIONES
Se obtuvo un modelo matemático para correlacionar el porcentaje de bioaccesibilidad de cadmio con los componentes cacao, leche, azúcar y concentración de Cd total en el cacao; donde explicó el comportamiento de los datos experimentales con los datos prestablecidos en un 94,01 % y la evaluación del modelo mostró errores de 8,84 %, en promedio. En el modelo se encontró efecto significativo en todas las contribuciones lineales, observándose efectos negativos en la cantidad de cacao y azúcar, y efectos positivos en la cantidad de leche y la concentración de Cd en cacao. La contribución lineal de la cantidad de cacao y la cantidad de leche fueron las variables más significativas en el modelo. Se propuso una formulación con 77,8 % de cacao y 22,2 % de azúcar, que corresponde a un chocolate amargo, con un porcentaje de bioaccesibilidad de Cd de 7,07 %. Además, utilizando cacao de concentración de Cd dentro del intervalo del modelo, se propusieron formulaciones que corresponde a chocolate amargo (dark chocolate) que poseen porcentaje de bioaccesibilidad de Cd menores al 11 %. Los presentes resultados orientan al productor y comercializador a conocer las formulaciones de cacao pertinentes a disminuir la exposición y toxicidad de Cd, con granos de cacao que posean alto contenido de Cd provenientes de regiones del Santander.
