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INTRODUCCIÓN
El arroz es un cereal considerado como uno de los principales alimentos de la canasta familiar en áreas densamente pobladas aportando aproximadamente el 20% del suministro de energía alimentaria en el mundo (Baranoa, 2010; (Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la Alimentación, FAO, 2013). Para mantener el rendimiento y la productividad del cultivo de arroz, se hace necesaria la aplicación de fertilizantes químicos, los cuales aportan a los suelos nutrientes que son requeridos para promover a la planta un desarrollo óptimo y un buen rendimiento en la producción de las cosechas (Hassan, 2017), sin embargo, muchos de estos fertilizantes químicos están ocasionando problemas ambientales (Izquierdo, 2017). Como alternativa para sustituir los fertilizantes químicos, actualmente se está haciendo énfasis en la aplicación de microorganismos que tienen la capacidad de proteger a la planta contra patógenos y promover el crecimiento vegetal, como por ejemplo las bacterias endófitas (Izquierdo, 2017).
Las bacterias endófitas son consideradas grupos de simbiontes que habitan en los tejidos vegetal sin causar síntomas de enfermedad a su hospedero (Kandel et al., 2017). Contribuyen a la salud de la planta mediante la secreción de factores reguladores de crecimiento, producción de fitohormonas y metabolitos microbianos, lo que permite la disminución del estrés nutricional y patogénico en la planta (Porras and Bayman, 2011; Kandel et al., 2017). Las bacterias endófitas son consideradas una gran herramienta biotecnológica debido a la capacidad que tienen para fijar nitrógeno, solubilizar fosfato y producir sideróforos lo que ha favorecido la producción y rendimiento de los cultivos (Sahoo et al., 2017).
Estudios han demostrado que estos microorganismos endófitos asociados al arroz pertenecen a los géneros Agrobacterium, Bacillus, Chryseobacterium, Flavobacterium, y Pseudomonas (Moronta, 2015), los cuales presentan diferentes mecanismos para proteger la planta contra cualquier patógenos. La producción de bioinoculantes a partir de los géneros anteriormente mencionados se ha convertido en una alternativa para disminuir los costos de producción y sustituir los agroquímicos que afectan de manera significativa la microbiota del suelo (Ortiz et al., 2018; Valdez et al., 2020). Teniendo en cuenta los beneficios de las bacterias endófitas anteriormente mencionadas, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar in vitro la capacidad promotora de crecimiento vegetal de bacterias endófitas aisladas de diferentes tejidos de variedades de arroz.
MÉTODO
Área de estudio
La investigación se realizó en la granja experimental la Victoria del Fondo Nacional del Arroz, localizado en el municipio de Mocarí-Córdoba-Colombia con coordenadas 08°47′25″ de la Longitud Norte 75°51′38″ de longitud Oeste con respecto al Meridiano de Greenwich, con una temperatura promedia de 29 °C, humedad relativa de 80 %, precipitación anual promedia de 1200 mm y altura de 20 m s.n.m.
Muestreo del material vegetal
Se recolectaron de forma aleatoria, en forma de zig-zag, 10 plantas completas (raíz, tallo, hojas, inflorescencia) de las variedades de arroz identificadas como 2000, Tana, 473 y 67 en la granja experimental la Victoria del Fondo Nacional del Arroz. Las muestras fueron rotuladas con su respectiva variedad y fecha de recolecta, almacenadas y conservadas en cajas de icopor a 4 °C para su transporte al laboratorio de investigaciones microbiológicas de la Universidad de Sucre y procesada dentro de las 24 horas después de la recolecta.
Aislamiento de bacterias endófitas
El material vegetal fue separado en sus diferentes tejidos con el fin de realizar el proceso desinfección (Pérez et al., 2010), luego de lo cual se pesó 1 g de cada tejido y fue macerado en un mortero de porcelana con caldo peptona hasta obtener una mezcla homogénea. De cada homogenizado se realizaron diluciones seriadas las cuales fueron sembradas en superficie en medio de cultivo R2A y se incubaron a 28 °C por 72 horas. La densidad poblacional de bacterias endófitas por tejido, UFC/g de tejido, se estimó por conteo directo en placas en donde se seleccionaron las colonias que se distinguían en cuanto a forma, aspecto de la superficie, color y tamaño. Los aislados seleccionados se purificaron y fueron mantenidos en agar R2A (Singh and Dubey, 2018).
Actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias endófitas in vitro
Fijación biológica de nitrógeno. Las bacterias fueron colocadas con un asa bacteriana en el medio selectivo agar Burk carente de fuente de nitrógeno como evaluador de la actividad fijadora de nitrógeno, el cual utiliza una fuente combinada de carbono que permite recuperar una mayor cantidad de microorganismos con posible actividad fijadora seleccionando solo aquellos que presenten el sistema enzimático que les permite reducir el nitrógeno atmosférico y utilizarlo en su metabolismo. El medio de cultivo fue incubado durante 7 días a 30°C. Los resultados fueron observados según el crecimiento de la bacteria en el medio (Walitang et al., 2017; Sarsaiya et al., 2019).
Solubilización de fosfato. La determinación de solubilización de fosfato fue mediante la inoculación de colonias en el medio de cultivo sólido NBRID incubado durante 7 días a 30°C. La aparición de halos claros alrededor de las colonias es considerada como indicador positivo para la solubilización fosfato (Walitang et al., 2017).
Producción de sideróforos. La producción de sideróforos se determinó mediante el medio cromo azurol-S (CAS) (Schwyn and Neilands, 1987). La habilidad de la bacteria para producir sideróforos fue evidenciada por la formación de un halo transparente alrededor de las colonias.
Identificación molecular de bacterias endófitas con actividad promotora de crecimiento vegetal
La extracción de ADN de bacterias endófitas con actividad positiva para la fijación de nitrógeno, solubilización de fosfato y producción de sideróforos, se realizó mediante la amplificación del gen 16S RNAr, se utilizaron 5 juegos de oligonucleotidos específicos: FBLS342 y R1392, para la clase firmicutes; F948β y R1492 para la clase beta-proteobacteria; FD2 y RP1 para la clase gamma-proteobacteria; F243 y R1492 para la clase actinobacteria; F203 y R1492 para la clase alfa-proteobacteria (Oliveira et al., 2013; Pandey et al., 2018). Los productos amplificados se purificaron y fueron enviados a secuenciación a la empresa Macrogen. Las secuencias obtenidas, se compararon con las almacenadas en el Genbank. El alineamiento de las bases se realizó en el programa Clustal W, las inferencias filogenéticas fueron obtenidas por método Neighbor Joining basado en el modelo kimura-2-parámetro con prueba bootstrap 1.000 réplicas con el programa MEGA X.
Análisis estadístico
Se aplicó un diseño en bloque con arreglo factorial para las diferencias entre la densidad poblacional (UFC/g de tejido) de bacterias endófitas en función a variedad y tipo de tejido. Se utilizó la prueba de rango múltiple (Tukey) para establecer diferencias significativas (p<0,05), entre comunidades de bacterias endófitas (UFC/g de tejidos) con relación a variedad y tipo de tejido colonizado. Los datos fueron analizados en el programa InfoStat versión gratis.
RESULTADOS
Aislamiento de bacterias endófitas
Se aislaron 107 morfotipos de bacterias endófitas de cuatro variedades de arroz identificadas como Fedearroz 2000 (F2000), Fedearroz Tana (FTana), Fedearroz 437 (F437) y Fedearroz 67 (F67). El análisis de varianza entre densidad poblacional de bacterias endófitas por variedad y tipo de tejido mostró diferencias significativas (p<0,05), mientras que la prueba múltiple de rango Tukey para las poblaciones de bacterias endófitas mostró significancia en cuanto a cantidad de estas bacterias por variedades de arroz analizada. Las variedades con mayores densidades se presentaron para la variedad F2000 (1,37x104 UFC/g de tejido) seguida de F473 (1,2x104 UFC/ g de tejido); la menor densidad de bacterias fue para la variedad FTana y F67, las cuales presentaron densidades de (1,0x104 y 9,7x103 UFC/g de tejido), respectivamente (figura 1).
Los valores encontrados en este estudio son mayores para la variedad Fedearroz 2000. Otros estudios han registrado valores menores de densidades de bacterias endófitas de 2,07x1010 UFC/g para la variedad Fedearroz 473 y de 1;56x1010 UFC/g de raíz para Fedearroz 2000. la densidad poblacional de bacterias endófitas asociadas a diferentes especies vegetales depende de la especie de bacteria y el genotipo de la planta hospedera, además del estado de desarrollo de la planta, la densidad del inóculo, las condiciones ambientales y la época del año (Singh and Dubey, 2018).
La prueba múltiple de rango Tukey para la densidad de bacterias endófitas en función a tipo de tejido mostró una mayor colonización en raíces 2,2x104 UFC/g de tejido y tallo con 2,12x104 UFC/g de tejido; mientras la menor cantidad de bacterias endófitas fueron aisladas en hojas y panículas con valores de 1,1x103 y 7,2x102 UFC/g de tejido, respectivamente (figura 2).
El tejido mayor colonizado fue la raíz en cada una de las variedades en estudio. Además, la presencia de endófitos está descrita para todos los tejidos de la planta, existiendo un mayor número en la raíz, disminuyendo a medida que asciende por el tallo hasta llegar a las hojas y por último a frutos o inflorescencias (Porras and Bayman, 2011; Sahoo et al., 2017). La razón principal de que haya mayor colonización en la raíz que en otras partes de la planta, se debe a que esta zona está en contacto directo con el suelo. Así mismo, los exudados liberados por las raíces atraen a una gran diversidad de microorganismos que pueden colonizar los espacios radiculares (Sahoo et al., 2017).
Actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias endófitas in vitro
En la figura 3 se muestran los resultados del ensayo in vitro de actividad cualitativa de solubilización de fosfato en agar NBRID, fijación de nitrógeno en agar Burk y producción de sideróforos en medio cromo azurol-S (CAS). Los resultados del ensayo mostraron 22 asilados de bacterias endófitas con capacidad de promoción de crecimiento, en 11 de los cuales se observó cualitativamente tuvieron la capacidad de solubilizar fosfato; 6 de producir sideróforos y 5 de fijar nitrógeno.
(Figura 3. Promoción de crecimiento in vitro de bacterias endófitas aisladas de tejidos de variedades de arroz. A) solubilización de fosfato, (B) fijación de nitrógeno y (C) producción de sideróforos.
El crecimiento de las bacterias endófitas en medio Burk sugiere que tienen la capacidad de producir la enzima nitrogenasa, complejo enzimático que cataliza la reducción de nitrógeno en amonio (Omomowo et al., 2019; Fadiji et al., 2020). La combinación de bacterias fijadoras de nitrógeno y hongos formadores de micorrizas se ha convertido en una estrategia para sustituir el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados. Así mismo, la combinación de microorganismos diazotróficos y hongos del género Trichoderma pueden aumentar la longitud de las hojas, grosor del tallo y longitud de las raíces lo que favorece un mejor rendimiento y mayor producción en cultivos (Khalaf et al., 2018; Montejo et al., 2018).
Así mismo, las bacterias endófitas tienen la capacidad de solubilizar fosfato gracias a la producción de enzimas como las fosfatasas que cumplen la función de disponer el fósforo en el suelo y ser asimilable para la planta favoreciendo su crecimiento (Saeid et al., 2018). Las enzimas que tienen la capacidad de solubilizar fosfatos como las fosfatasas y lipasas se han convertido en herramientas biotecnológicas que permiten mejorar rendimiento, los cuales se han visto resultados significativos en cultivos de papa, maíz y arroz (Suleman et al., 2018).
La producción de sideróforos a partir de las bacterias endófitas cumple un papel importante en la protección de la planta, ya que el sideróforo captura los iones de hierro y no dejarlo a disposición a los organismos patógenos (Xiao et al., 2017). Hasta el momento, la mayor cantidad de estudios están basados en la aplicación de sideróforos para combatir enfermedades que afectan a cultivos de interés económico ha estado relacionado con productos obtenidos a partir de Pseudomonas fluorescens, debido a que la producción de sideróforos (pioverdinas o piocianinas) por parte de este microorganismo tiene un claro efecto inhibitorio en el crecimiento del micelio de Colletotrichum lindemuthianum y Colletotrichum gloesporioides (Priyanka et al., 2017). Diversos estudios referencian que los géneros Bacillus, Pantoea, Pseudomonas y Burkholderia tienen la capacidad de promover el crecimiento vegetal in vitro demostrando que pueden ser utilizados como inoculante para el cultivo de arándano (Ortiz et al., 2018).
Identificación molecular de bacterias endófitas con actividad promotora de crecimiento vegetal
El análisis filogenético del gen 16S ARNr para bacterias endófitas con actividad de promotora de crecimiento vegetal (figura 4), muestra que 11 especies de bacterias mostraron alta similitud con secuencias almacenadas en banco de datos de GenBank, corresponde a las especies de Bacillus thuringiensis y B. cereus pertenecientes a la clase Firmicutes. En este análisis, los morfotipos T4M6F2000LIM, P3M6F473LIM, aislado de tallo de la variedad Fedearroz 2000 y de panícula de la variedad Fedearroz 473, fue identificado como B. thuringiensis, mostrando in vitro capacidad de solubilizar fosfatos y producción de sideróforos. Los aislados correspondiente a P1M3F473LIM, R1M4F2000LIM, R5M5FTANALIM, T2M5F2000LIM, P2M4F473LIM, T1M5F2000LIM, T1M3FTANALIM, H1M3F2000LIM y R2M5F67LIM obtenidos de panícula, hoja, raíz y tallo, de la variedad Fedearroz 2000, F473, F67 y FTana fueron identificados como B. cereus, mostrando actividad de fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos y producción de sideróforos.
Figura 4 Dendograma de Neighbor-Joining a partir de las secuencias gen 16S ARNr de bacterias endófitas. H: hoja; P: panícula; T: tallo; R: raíz; M: morfotipo; F: variedad Fedearroz; LIM: Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas Universidad de Sucre.
B. thuringiensis ha sido reportada como bacteria endófita con capacidad de solubilizar fosfato y producir sideróforos que puede mejorar la calidad de la producción de sectores agrícolas (Djenane et al., 2017). Además, esta bacteria produce una variedad de metabolitos, entre los cuales se encuentra las bacteriocinas, antibióticos y enzimas extracelulares (como proteasas y quitinasas), compuestos claves para la supresión de patógenos (Martínez et al., 2020). B. thuringiensis tienen la capacidad de proteger a la planta Brassica campestris L. (Brassicaceae) contra la enfermedad llamada esclerotinosis causada por Sclerotinia sclerotiorum. Los resultados obtenidos indicaron que la diversidad de cepas de B. thuringiensis son eficaces para el control biológico contra S. sclerotiorum y para controlar insectos y nematodos que ocasionan graves problemas en cultivos de interés económico (Crickmore et al., 2020; Wang et al., 2020).
B. cereus es reportada como bacteria endófita asociada a plantas de arroz como potencial agente promotor de crecimiento (Ortiz et al., 2019; Khaskheli et al., 2020). Es una bacteria endófita asociada a cultivo de papa la cual ha mostrado resultados positivos en los ensayos de fijación de nitrógeno y tiene la capacidad de biorremediación en cultivos de arroz que presenten contaminación por cadmio. A su vez, favorece el crecimiento de la planta mediante la producción de Ácido Indol Acético (IAA) (Walitang et al., 2017; Wang et al., 2019).
El género Bacillus se caracteriza por presentar actividad de fijar nitrógeno, y especies de este género han sido reportadas como endófitos resistentes a cadmio en Solanum nigrum L. (Solanaceae) y níquel en Oryza sativa L. (Poaceae) (Singh and Dubey, 2018). Generalmente, los miembros de este género han sido aislados de un gran número de especies silvestres de interés comercial como la papa (Wang et al., 2019), trigo, arroz y caña de azúcar (Hassan, 2017). A su vez, se realizan aislamientos de estas bacterias a partir de suelo rizosféricos o no rizosféricos del mismo cultivo donde se va a evaluar su potencial como promotor de crecimiento. Su actividad promotora de crecimiento está asociada principalmente por la producción de AIA, solubilizar fosfatos y producir sideróforos generando incrementos en la porción radicular y aérea de las plantas (Bhat et al., 2020).
CONCLUSIONES
La especie Bacillus cereus y B. thuringiensis tienen la capacidad de promover el crecimiento vegetal in vitro mediante la producción de sideróforos, solubilización de fosfato y fijación de nitrógeno. Estas dos especies pueden ser aplicadas en campo con el fin de aumentar la producción y rendimiento de los cultivos, lo que las convierte en una herramienta biotecnología para sustituir la aplicación de agroquímicos los cuales hasta la fecha están generando problemas en el ambiente y salud humana.
