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INTRODUCCIÓN
La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, estimó que la producción mundial de pescado fue de 179 millones de toneladas de los cuales aproximadamente el 87 % se destinó para consumo humano. Esto indica que, para muchos países, en especial aquellos con menor desarrollo, el pescado es considerado la base de su seguridad alimentaria (FAO, 2020).
El Departamento de Nariño (Colombia), registró una producción de 2.585 ton/año de trucha arcoíris (Burbano-Gallardo et al., 2021), concentrada en un 70 % en el Lago Guamuez (Suárez et al., 2020), constituyendo la base económica y nutricional de la mayoría de las familias rurales. No obstante, tras la captura de la trucha, la postproducción es realizada con precario nivel tecnológico lo cual conlleva un enorme riesgo para la salud del consumidor debido a la baja calidad e inocuidad del producto.
La pérdida y desperdicio de carnes y productos de origen animal a lo largo de la cadena de suministro fue de un 12 % a nivel mundial (FAO, 2019). El pescado es una fuente rica en macro y micronutrientes como proteínas (19-23 %), ácidos grasos esenciales (4-7 %), vitaminas y minerales (Central Lechera Asturiana, 2021). La riqueza composicional sumada a unas inadecuadas prácticas de sacrificio, manipulación, almacenamiento y distribución, contribuyen a la reducción de la calidad (Domínguez et al., 2019), y al incremento de la pérdida y desperdicio de este alimento.
El carácter altamente perecedero del pescado y las inadecuadas prácticas de postproducción son determinantes en la incidencia y prevalencia de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). La Organización Mundial de la Salud estableció que, durante los últimos tres años, 600 millones de personas fueron afectadas por ETA y aproximadamente 420.000 individuos (el 30% fueron niños menores de 5 años), murieron a causa de la ingesta de alimentos contaminados por microorganismos (WHO, 2021).
Las plantas producen metabolitos secundarios con promisoria bioactividad, los cuales pueden ser utilizados para evitar ETA. Los aceites esenciales han sido utilizados para contrarrestar algunos brotes transmitidos por productos cárnicos, considerados de alto riesgo para la salud (Al-Hijazeen, 2022). Además, los AE pueden mejorar los atributos sensoriales y nutricionales de los alimentos; exhiben propiedades terapéuticas como agentes antioxidantes y antiinflamatorios y limitan el crecimiento de bacterias como Pseudomonas spp, Lactobacillus spp., Staphylococcus spp., Escherichia spp. y Salmonella spp.,entre otras (Putnik et al., 2019).
No obstante la bioactividad de determinados analitos puede afectarse de acuerdo con el método de obtención. La extracción con fluidos supercriticos es una técnica ecoeficiente debido al uso de solventes gras (generally recognized as safe), tiempo de extracción y consumo de energía reducidos. Además aumenta la pureza del aceite, la conservación del aroma y la selectividad de los compuestos bioactivos (Suárez-Montenegro et al., 2021).
Más de 20 especies de orégano y productos derivados de romero han demostrado propiedades conservantes en alimentos, aplicables en la industria pesquera (Al-Hijazeen, 2022), debido prinicipalmente a algunas actividades funcionales atribuidas a los monoterpenos (presentes en un 95%), y sesquiterpenos (entre 2-5 %) (Dupas et al., 2020).
Este estudio investigó el efecto antimicrobiano y bactericida ejercido por los aceites esenciales de romero (Rosmarinus officinalis L.) y orégano silvestre (Lippia origanoides H.B.K.), extraídos con fluidos supercríticos, frente a bacterias patógenas aisladas de filetes de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), responsables de ETA. Con estos hallazgos se pretende contribuir a la búsqueda de alternativas para la conservación de productos cárnicos a través del uso de ingredientes naturales de alta disponibilidad y bajo costo, en reemplazo de los tradicionales aditivos químicos.
MÉTODO
Extracción de aceites esenciales
Esta investigación aplicó la extracción con CO2 supercrítico debido a la naturaleza lipofílica de los AE. Se utilizó un equipo SFE-500 marca Waters con celda de 500 mL, bomba de alta presión, dos separadores, tiempo de extracción de 150 minutos y flujo de CO2 de 30 g/min. Para evaluar el efecto de las variables presión (entre 150 y 300 bar) y temperatura (entre 40 y 60 °C) en el rendimiento global (Ec. 1), se aplicó un diseño experimental 22 con cuatro repeticiones por tratamiento y un criterio de significancia p< 0,05. El rendimiento se optimizó mediante un modelo central compuesto rotacional con metodología de superficie de respuesta. Se utilizaron lotes de 150 g de material vegetal seco al que se le determinó la humedad de acuerdo con la Norma Internacional AOAC (Official Methods of Analysis). El material se trituró en un molino industrial (TRF 400 Súper, Brasil) y se tamizó hasta un diámetro promedio de partícula de 0,6 mm. Indice de refracción y densidad se calcularon de acuerdo con las normas NTC 289 y 336, respectivamente (ICONTEC, 2019, 2016). Los AE se almacenaron a 4±0,5 °C.
Composición de los aceites esenciales
La composición química se determinó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas utilizando un cromatógrafo Shimadzu QP2010S, columna J&W Scientific DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm); detector selectivo de masas, modo full scan; interface a 280 °C; inyector a 250 °C, modo split 1:50; fase móvil Helio UAP a flujo de 1,0 mL/min. La identificación tentativa de los compuestos se logró mediante comparación de los espectros de masas, utilizando las bases de datos ADAMS 2004 y NIST. Se utilizó una mezcla de n-alcanos para calcular los índices de retención lineal.
Formulación de emulsiones
Se preparó una mezcla de aceite esencial y medio de cultivo bacteriano caldo de soja tripticaseína (TSB) de acuerdo con (Argote-Vega et al., 2017). Los rangos de concentración (μg de AE/mL de emulsión) estudiados fueron de 890 a 64080 para AER y de 930 a 66960 para AEO.
Aislamiento e identificación de microorganismos
Se tomó una muestra aleatoria (Ec.2) de 45 ejemplares de trucha en tres expendios de El Encano-Nariño, con un nivel de confianza del 95 % y margen del error del 5 % (Sucasaire, 2022). Las muestras se transportaron hasta la Universidad de Nariño en bolsas estériles de polietileno a 4 °C.
Donde:
n= tamaño de muestra
N= población
Z= nivel de confianza
p= proporción del fenómeno en estudio en la población de referencia
q= proporción de la población de referencia que no presenta el fenómeno en estudio
d= precisión absoluta
El aislamiento de las bacterias se realizó mediante frotis de la superficie externa de cada ejemplar, inmersión en un tubo de ensayo con agua peptonada buferada estéril e incubación (37 °C, 24 h). Posteriormente, se prepararon diluciones seriadas 10-2 a 10-6, se sembraron en medios de cultivo agar sangre y MacConkey e incubación (37 °C, 24-48 h). Las bacterias purificadas y aisladas, se preservaron con glicerol-Fisher Chemical® al 15 % v/v y medio de cultivo tioglicolato a -20 °C. Para la identificación inicialmente se realizó la tinción de gram y test de catalasa. Luego, las cepas se cultivaron en medio agar soya tripticasa con 5 % de sangre de carnero e incubación (35 °C, 18-24 h); seguidamente, se inocularon las tarjetas y los páneles del sistema automatizado Phoenix® (Becton Dickinson, nivel de confianza del 99 %) con colonias de un cultivo puro estandarizado a 0,5 de MacFarland e incubación a 35 °C (Fagundo-Sierra et al., 2007).
Actividad antimicrobiana y bactericida de los aceites esenciales de romero y orégano
Preparación del inóculo. Para garantizar viabilidad celular, las cepas se activaron en TSB suplementado al 0,1% de glucosa e incubación (37 °C, 24 h). Luego de 24 horas de crecimiento, las células se centrifugaron (5 min, 6000 rpm) y se lavaron tres veces con PBS (50 mM, pH 7). Las células se resuspendieron en TSB hasta obtener inóculos estandarizados a 0,5 de densidad óptica (aproximadamente 5 x 108 células/mL escala Mcfarland).
Ensayo de inhibición. Este se realizó en caja de Elisa de 96 pozos y volumen de 350 µL. Como control negativo, a cierto número de pozos se adicionó sólo la cepa y TSB, mientras que aquellos con solo medio de crecimiento TSB fueron utilizados como control de esterilidad. La inhibición microbiana se evaluó adicionando en cada pozo 200 µL de la cepa activada, a una concentración de 0,5 de absorbancia, y 100 µL de la emulsión del aceite esencial. La estimación de la inhibición se realizó adicionado a cada pozos, 20 µL de solución al 0,1 % de TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio) e incubación (37 °C, 1 h). El color rojo indica las cepas metabólicamente activas.
Análisis estadístico. Los datos se analizaron con el programa Statgraphics Centurión XVII y los resultados representan el promedio ± la desviación estándar. Las diferencias estadísticas se compararon con análisis de varianza y test de múltiples rangos de Tukey a un valor p˂0,05. Las pruebas in vitro de inhibición bacteriana se evaluaron mediante un diseño completamente al azar con dos factores y las diferencias significativas se compararon con la prueba de kruskall Wallis a valor p˂0,05.
RESULTADOS
Características físicoquímicas
Los resultados de las pruebas fisicoquímicas de los AE estudiados (cuadro 1), arrojaron que ninguna de las variables presenta diferencias significativas entre ellas. El diseño de superficie de respuesta indica que el mayor rendimiento en AER (2,42 %) se obtuvo a 60 °C y 300 bar, mientras que el de AEO (2,05 %) fue a 50 °C y 225 bar (Fig. 1A y 1B).
Cuadro 1 Características físicoquímicas y rendimiento de los AE extraídos con fluídos supercríticos.
La diferencia en el rendimiento entre los AE puede ser atribuida a la temperatura de extracción. En condición supercrítica, la temperatura promueve un incremento de la difusividad y el poder de solvatación del CO2 incrementando la solubilidad del analito (Bueno, 2020). Además, el CO2 supercrítico se alcanza a baja temperatura (31,1 °C) siendo idóneo para la extracción de compuestos termolábiles. La presión influye favorablemente en el rendimiento puesto que a mayor presión se consigue una mayor solubilidad de los analitos; no obstante su selectividad disminuye (Suárez-Montenegro et al., 2021). Otros autores recomiendan presiones bajas, mientras que otros optan por presiones altas, para lograr mayor transferencia de masa y liberación de aceite, sin embargo, es necesario tener varios separadores para realizar el fraccionamiento de los compuestos coextraídos (Győri et al., 2019; Yousefi et al., 2019). Además, se deben considerar otros factores en el rendimiento como el uso de cosolventes, flujo de CO2, tiempo y método de extracción y pretratamiento aplicado al material vegetal, entre otros.
Algunos estudios reportaron un rendimiento de 2,53 % de AER con extracción supercrítica (172,4 bar, 40 °C) comparado con hidrodestilación (0,35 %) y destilación (2,35 %), en 90 minutos de extracción (Conde-Hernández et al., 2017), mientras que (Baj et al., 2018), consiguieron un rendimiento de 13,40 %, de AEO a 40 °C, 100 bar y flujo de cosolvente etanol (8 g/min), indicando la importancia de la inclusión de cosolvente para incrementar tanto el espectro de polaridad de los compuestos extraídos como el rendimiento global. Otra investigación sugiere que el rendimiento de los aceites no alcanza a superar el 5 % y depende de las características hidrofóbicas de las moléculas y la utilización de solventes orgánicos (Giacometti et al., 2018).
Composición de aceites
El cuadro 2, indica los principales metabolitos encontrados en los aceites estudiados. Esta investigación determinó que en AER predominaron alcanfor (26,95 %) y trans-cariofileno (22,80 %), lo cual está está en línea con lo reportado por (Baj et al., 2018; Giacometti et al., 2018), quienes encontraron α y β-pineno, 1,8-cineol, eucaliptol, β-cariofileno y alcanfor como principales compuestos terpénicos en romero. En relación al AEO, este estudio encontró que el timol es el compuesto más abundante (76,25 %), valor comparable con lo reportado por (Acosta et al., 2019) quienes obtuvieron un 83 % de este compuesto así como p-cimeno, mirceno, γ-terpineno y carvacrol, en menor proporción. Las variaciones en la abundancia de los compuestos se debe aspectos de tipo climático y geográfico de cultivo, a las partes de la planta, a las condiciones de secado y de extracción, así como a los métodos analíticos aplicados (Achour et al., 2018).
Estudio de las emulsiones
La composición y microestructura de las emulsiones se encuentra influenciada por fenómenos de transferencia de masa, gradientes en la presión osmótica, temperatura y pH (Rasia et al., 2019). Los ensayos determinaron que la relación 1:2 entre AE y Tween 20, mostró estabilidad hasta 48 horas con un diámetro de partícula comprendido entre 4,233 a 8,205 micras. Las características fisicoquímicas de la emulsión fueron: pH = 7,13 ±0,3; IR = 1,1540 ± 0,04 y densidad = 1,661 ± 0,11 g/cm3. Estudios previos de este grupo dterminaron similares características para emulsiones formadas a partir de aceite de eucalipto, mandarina y limón, para un diámetro de partícula entre 40 y 63 micras y una relación aceite/Tween 20 de 1:1 (Argote-Vega et al., 2017).
Microorganismos Identificados en trucha arcoiris
Se aislaron 135 cepas, 90 gram positivas (coagulasa y catalasas positivas) y 45 gram negativas. Con el método Phoenix® (Becton Dickinson) se logró identificar dos bacterias patógenas, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus, del total de las muestras analizadas. S. aureus representa un alto riesgo en productos acuáticos (Rong et al., 2017), debido a su capacidad para formar biopelículas, definidas como “un consorcio multicelular con estructura tridimensional formado sobre una superficie biológica o abiótica” (Ou et al., 2020). Esta bacteria se deposita en diferentes superficies de procesamiento de alimentos, constituyendo un grave foco de ETA debido a la secreción α-hemolisina asociada con la intoxicación alimentaria, las patogénesis y resistencia a biocidas. B. cereus es una bacteria capaz de adaptarse fácilmente en diferentes entornos para liberar potentes toxinas como cereulida, hemolisina BL, enterotoxina no hemolítica y citotoxina K, promoviendo un alto número de intoxicaciones alimentarias (Jovanovic et al., 2021).
Esta investigación sugiere que la presencia de estas bacterias en los filetes de trucha puede estar asociada a factores como un inadecuado sacrificio; utilización de agua proveniente del Lago Guamuéz sin ningún tratamiento de potabilización; inadecuadas operaciones de postproducción, contaminación cruzada, escasos refrigeradores para almacenamiento o ruptura de la cadena de frío, entre otros.
El cuadro 3 indica los resultados frente a la susceptibilidad antimicrobiana de las bacterias, expresada como resistencia (R) o sensibilidad (S) frente a diez agentes antimicrobianos.
Cuadro 3 Antibiograma de S. Aureus y B. Cereus aisladas de trucha arco iris.
Los números representan los halos de inhibición en mm, de acuerdo a la técnica de Kirby Bauer
Esta investigación encontró que S. aureus aislada de la trucha arcoiris ejerció una mayor resistencia a penicilina, cefalexina y oxacilina, mientras que presentó sensibilidad a amoxicilina, ceftriaxona, tetraciclina y ciprofloxacina, principalmente. Esto se encuentra en línea con lo reportado por Ou et al., (2020) quienes hallaron que un 12,1 % de la contaminación general de alimentos de origen animal porS. aureus, se manifestó en productos acuáticos. El estudio también concluyó que un 90,3 % de los aislamientos de S. aureus presentaron resistencia a al menos un agente antimicrobiano, un 39,4 % a múltiples fármacos y un 64,8 % de los aislados tenían una fuerte capacidad de formación de biopelículas. B. cereus presentó una resistencia a prácticamente todos los antibióticos probados, siendo sensible solo a ceftriaxona y a Ampicilina (Ou et al., 2020). Otra investigación encontró similares resultados de resistencia de B. cereus a los antibióticos de tipo β-lactámicos como penicilina, cefalosporinas y combinación de amoxicilina/ácido clavulánico y ampicilina, obtenidos de diferentes tipos de alimentos. Dicho estudio también reportó que la mayoría de las cepas de B. cereus exhibieron una sensibilidad superior al 90 % para ciprofloxacina, cloranfenicol, amikacina y eritromicina (Fiedler et al., 2019).
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los aceites esenciales de romero y orégano silvestre
El cuadro 4 muestra los resultados de las CMI y CMB de los AE frente a las cepas patógenas estudiadas.
Cuadro 4 CMI y CMB de los aceites esenciales de romero y orégano en las bacterias aisladas en este estudio.
Letras minúsculas diferentes en columnas representan diferencias significativas de los tratamientos con los aceites esenciales frente a la bacteria estudiada, prueba de kruskall Wallis a p˂0,05.
Los resultados mostraron una mejor respuesta del AER frente a la inhibición de S. aureus, representada en una CMI menor en un 23,4 % con respecto al AEO. La CMB exhibida por el AER frente a esta bacteria patógena es 45,3 % menor en comparación con el AEO, lo cual sugiere un significativo efecto bactericida del aceite esencial de romero.
El comportamiento de los aceites estudiados contra B. cereus fue contrario al exhibido en S. aureus debido a que el AEO demostró un mayor efecto antimicrobiano y bactericida con concentraciones 21,6 % y 7,1 % menores, respectivamente, en comparación con el AER.
Similares estudios del aceite de romero probado en bacterias E. coli O157:H7 y L. monocytogenes determinaron un efecto inhibidor a concentración de 200 y 270 μg/mL, respectivamente, representando valores más bajos que los descritos en esta investigación, para S. aureus y B. cereus (Santomauro et al., 2018). En relación al AEO, algunos estudios reportaron inhibición para B.subtilis y S. aureus a 313 y 640 μg/mL, respectivamente, con una CMB ≥ 2560 μg/mL (Boskovic et al., 2015). El efecto antimicrobiano y antioxidante se encuentra asociado a los compuestos carvacrol y timol, cuya eficiencia se corroboró frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigabacillus y Bacillus enteritidis (Leal et al., 2019). Algunos investigadores atribuyen propiedades terapéuticas de estos aceites contra el cáncer, oxidación, diabetes, inflamaciones, hongos y depresión, debido a la presencia de algunos metabolitos presentes en los aceites esenciales como los fenoles, flavonoides y terpenos (Sueishi et al., 2018).
Los mecanismos de inhibición de los aceites esenciales son aún desconocidos, sin embargo algunos estudios lo atribuyen a la interacción electrostática, cambios en la permeabilidad de la membrana debido a la naturaleza hidrofóbica de los compuestos e interrupción súbita de las funciones principales del metabolismo celular, relacionado con la síntesis de proteínas y otras funciones vitales del patógeno. De igual forma se observa mayor eficiencia de los quimiotipos en bacterias grampositivas que en gramnegativas, debido a las diferencias estructurales de la membrana celular (Pisoschi et al., 2018).
CONCLUSIONES
La extracción con fluídos supercríticos aplicada en este estudio permitió la obtención de aceites esenciales libres de solventes, siendo una técnica adecuada para la obtención de compuestos naturales con aplicación alimentaria. La investigación reveló que tanto el rendimiento como la bioactividad de los compuestos de interés presentes en los aceites esenciales de romero y orégano silvestre, se encuentran influenciados por los parámetros de extracción como la temperatura, la presión y el tipo de solvente. Este estudio sugiere que los compuestos terpénicos encontrados en los aceites esenciales de romero y orégano podrían ejercer un efecto antimicrobiano contra las bacterias patógenas S. aureus y B. cereus aisladas de la trucha arcoiris en una relación dosis-respuesta.
