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Revista Ciencias de la Salud

Print version ISSN 1692-7273On-line version ISSN 2145-4507

Rev. Cienc. Salud vol.3 no.2 Bogotá July/Dec. 2005

 

Muerte celular: blanco terapéutico en neurodegeneración y sepsis

Apoptosis: Therapeutic target in neurodegeneration and sepsis

Gonzalo Arboleda*, Luisa M. Matheus†

* MD, MSc, PhD,, Instituto de Ciencias Básicas, Facultad de Medicina, Universidad del Rosario. Correo electrónico: gonzalo.arboledabu@urosario.edu.co
† BSc, MSc, PhD, Instituto de Ciencias Básicas, Facultad de Medicina, Universidad del Rosario. Correo electrónico: luisa.matheus@urosario.edu.co

Recibido: mayo de 2005. Aceptado: agosto de 2005.


Resumen

La apoptosis celular se considera el principal mecanismo fisiopatológico asociado a la pérdida neuronal en las enfermedades neurodegenerativas. También durante la fase aguda de sepsis en que se presenta disfunción orgánica, se ha encontrado que existe un incremento en la tasa apoptótica del endotelio parenquimal y microvascular. De tal forma que las estrategias para prevenir la apoptosis (anti-apoptóticas) representan una valiosa herramienta para prevenir y/o retardar la aparición de la sintomatología en estos desórdenes, los cuales ocasionan una gran carga en morbi-mortalidad social y económica a nivel mundial.

En la presente revisión se busca evidenciar que las estrategias anti-apoptóticas poseen un gran potencial terapéutico. En tal sentido, se revisarán algunas de estas potenciales terapias como los inhibidores de caspasas, la proteína C activada, la familia Bcl-2 y la vía de señalización mediada por PI3K/Akt.

Palabras clave: apoptosis, degeneración nerviosa, sepsis, protección, caspasas, proteína C.

Abstract

Cellular apoptosis has been considered as the main physiological mechanism underlying neuronal demise associated to neurodegenerative diseases. Apoptosis has also been described in parenquimal and microvascular endothelium in the acute phase of sepsis during multi-organic dysfunction. Therefore, strategies aimed to prevent apoptosis (anti-apoptotic) represent a valuable tool for prevention and/or retardation of the appearance of clinical symptoms in these disorders, which generate a large morbilitymortality, social and economic burden worldwide. The present review is aim to show that antiapoptotic strategies hold a great therapeutic potential. In this sense, we will review some of these potential therapies such as caspase inhibitors, activated protein C, Bcl-2 family and the PI3K/Akt signalling pathway.

Key words: Apoptosis, nerve degeneration, sepsis, protection, caspases, protein C.

Abreviaturas: Δψm, potencial de membrana mitocondrial; ANT, transportador de nucleótidos de adenosina; EA, enfermedad de Alzheimer; EP enfermedad de Parkinson; EPCR, receptores endoteliales de proteína C; HSP, proteínas de choque térmico; IkB, inhibidor kappa B; mPTP, poro de permeabilidad transicional mitocondrial; NFkB factor nuclear kappa B; PAR-1, receptor-1 activado por proteasa; PCA, proteína C activada; SN, sustancia nigra; TNF, factor de necrosis tumoral; VDAC, canal aniónico dependiente de voltaje.


INTRODUCCIÓN

La muerte celular programada o apoptosis celular se considera el principal mecanismo fisiopatológico asociado a la pérdida neuronal en las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP). En la fase aguda de sepsis en la que se presenta disfunción orgánica, también se ha encontrado un incremento en la tasa apoptótica del endotelio parenquimal y microvascular.

Las enfermedades neurodegenerativas representan la consecuencia final de un grupo de interacciones complejas a lo largo de la vida de un individuo, en que intervienen la predisposición genética, algunas características innatas de poblaciones neuronales específicas y la exposición a toxinas endógenas y exógenas (1) Estas enfermedades se caracterizan por ocasionar una gran discapacidad y un aumento de la morbilidad entre las personas afectadas, por las grandes pérdidas económicas y por las graves consecuencias sociales y familiares que generan. En población mayor de 65 años se incrementa dramáticamente el impacto de la neurodegeneración primaria, ya que el envejecimiento es el principal factor de riesgo. La distribución de las enfermedades neurodegenerativas es mundial, estimándose que afectan el 1% de la población general. En Colombia afecta a unos 200.000 individuos, y su tendencia es al aumento debido al envejecimiento de la población. Aunque la fisiopatología y la etiopatogenia de las enfermedades neurodegenerativas primarias permanecen en gran medida inciertas, diversas evidencias sugieren que la apoptosis es la causa primaria o secundaria que contribuye a la muerte neuronal. La detección temprana de los procesos neurodegenerativos y los riesgos asociados a ellas están íntimamente relacionados con la identificación de factores neuroprotectores con potencial terapéutico. Las estrategias neuroprotectoras/neurorestauradoras buscan detener o prevenir la progresión de la enfermedad al bloquear la muerte de células en riesgo en una fase preclínica o inicial de la misma.

Estadísticas del Medicare Database and National Census Projections estiman que en Estados Unidos se presentan al menos 750.000 casos anuales de sepsis severa con una tasa de mortandad que fluctúa entre el 28 y el 59% (2). Así mismo, la Society of Critical Care Medicine (Society of Critical Care Medicine (SCCM) (homepage en Internet); c2001-2005 (consultado junio 16 de 2005). (1 pantalla). (Disponible en: http://www.sccm.org/press_room/sepsis_statistics.asp) reporta que las tasas de incidencia se han incrementado en un 91,3% en la última década, de manera que en el año 2010 se presentarán alrededor de un millón de casos de sepsis severa. En Norteamérica muchas más personas mueren a causa de sepsis que por cáncer de seno, colón, páncreas y próstata combinados.

En tal sentido, las terapias encaminadas a prevenir la apoptosis (antiapoptóticas) poseen un gran potencial terapéutico. Dentro de las estrategias que se han venido utilizando como herramientas protectoras, incluso en ensayos clínicos, se encuentran la utilización de factores de crecimiento, los inhibidores de caspasas, los transplantes celulares, la proteína C activada, entre otros. Aunque muchos de los procesos moleculares subyacentes permanecen desconocidos (3-7), se han empezado a aclarar los mecanismos involucrados en los procesos de muerte/ supervivencia celular.

MECANISMOS GENERALES DE MUERTE CELULAR

Clásicamente se han descrito dos mecanismos fundamentales, bioquímicamente distinguibles y que representan los dos extremos de una variedad de posibles mecanismos de muerte celular: la necrosis y la apoptosis (8-11). La necrosis constituye un proceso patológico, poco controlado y desordenado, no requiere de ATP para su progresión y causa una explosión de la célula asociada a un proceso inflamatorio. La apoptosis es una forma de muerte celular programada, morfológica y bioquímicamente bien caracterizada. Es un proceso activo, es decir, requiere de ATP, y se manifiesta con retracción celular, fragmentación nuclear, preservación de los organelos intracelulares, cambios en la asimetría de los fosfolípidos de membrana, formación de cuerpos apoptóticos, y fagocitosis de la célula apoptótica, que es llevado a cabo por una maquinaria intrínseca y específica de “suicidio celular” (12).

Algunos de los eventos que subyacen a la cascada molecular en la apoptosis se subdividen en dos vías: la vía extrínseca (disparada por activación de receptores de la superfamilia de CD95L o de muerte celular por acción de TNFα, FasL, IL-1 y otros) y la vía intrínseca (particularmente asociada a daño al ADN) (figura 1) (13). Las alteraciones en la fisiología mitocondrial han sido consideradas como el punto coordinador clave y vía final común que define el punto de no retorno de la apoptosis, y que es un área reciente de amplio estudio en los eventos de muerte y de supervivencia celular (14). En los procesos que ocurren corriente arriba de los cambios mitocondriales participan una multitud de proteínas pro-apoptóticas (caspasa 8 y 10, Bax, Bad, Bid, Bak, Bcl-xs) y anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xl, PI3K/Akt) (13), algunas de las cuales están localizadas en la membrana externa mitocondrial y otras en el citosol. Estas proteínas realizan su función mediante la regulación directa de la permeabilidad mitocondrial (familia Bcl-2, como se explica más adelante) o mediante otros mecanismos que involucran la regulación de sustratos mitocondriales y la regulación de las proteínas de la familia Bcl-2 (vía PI3K/Akt).

Las proteínas unidas a la mitocondria se encargan de regular su homeostasis por diversos mecanismos tales como inserción y formación directa de un poro transmembranal, interacción y regulación del canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) y del transportador de nucleótidos de adenosina (ANT), que conllevan a la alteración del poro de permeabilidad transicional mitocondrial (mPTP). Estos cambios generan la liberación al citoplasma de proteínas pro-apoptóticas confinadas dentro de la mitocondria como el citocromo C, Apaf-1 y ATP, que forman un complejo de proteínas denominado el apoptosoma, el cual activa las caspasas efectoras que dirigen el desmantelamiento final de la célula (13).

Las alteraciones mitocondriales surgen del delicado balance entre los niveles de las proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas, dependientes a su vez de la naturaleza e intensidad del estímulo apoptótico desencadenante, del estado y del tipo celular, de algunas condiciones del microambiente celular externo (15) y, de manera “autónoma”, de procesos de regulación que modifican las formas activas y/o inactivas de las distintas vías de señalización corriente arriba. Por ejemplo, la fosforilación, inactivación y secuestro de la proteína Bad por acción de Akt, es contrarrestada por la defosforilación inducida por ceramidas, causando su translocación a la mitocondria y la inhibición de proteínas anti-apoptóticas como Bcl-xL y Bcl- 2, conllevando apoptosis (figura 2) (16). Por consiguiente, es importante determinar cómo estos procesos de modificación postraduccional están implicados en la regulación de la supervivencia/ muerte celular (17).

MUERTE CELULAR EN SEPSIS

En sepsis, el endotelio juega un papel importante en la generación de trombina mediada por el factor tisular (TF), la vía anticoagulante disfuncional y el bloqueo de la fibrinólisis (18). En condiciones fisiológicas el endotelio cumple su función en el proceso homeostático, mediante el control del tono vasomotor, el tráfico celular y de nutrientes, y el mantenimiento del flujo sanguíneo a través de la expresión y síntesis de anticoagulantes naturales (proteína C activada, inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) y antitrombina) y fibrinolíticos (activador de plasminógeno tisular) (19, 20).

En la cascada de eventos que llevan al choque séptico se encuentran involucrados monocitos, leucocitos, plaquetas y el endotelio. Como resultado de la acción de las citoquinas y de la activación celular, se inducen las vías del complemento y de la coagulación, se metaboliza el ácido araquidónico y es liberado el factor activador plaquetario, ocasionando fiebre, hipotensión, filtración capilar, coagulación intravascular diseminada, disminución de la función miocárdica, disfunción cardiovascular, renal, respiratoria, hepática, hematológica y del sistema nervioso central, acidosis metabólica y finalmente muerte (21). Las secuelas clínicas de la sepsis pueden variar de acuerdo con el balance de mediadores inflamatorios y antiinflamatorios. Una respuesta inflamatoria excesiva (SIRS) puede producir choque y disfunción orgánica, mientras que una respuesta antiinflamatoria excesiva (CARS) puede llevar a una inmunosupresión. Algunos pacientes pueden morir con inflamación mínima como resultado de apoptosis (20), en particular de los órganos linfoides (22). Durante la fase aguda de sepsis en que se presenta disfunción orgánica, se ha encontrado que existe un incremento en la tasa apoptótica del endotelio parenquimal y microvascular, así como una amplificación del efecto coagulante ya que el endotelio en apoptosis es pro coagulante (23). Aunque existen evidencias de apoptosis endotelial inducida por patógenos, no está claro si la apoptosis es un mecanismo fisiopatológico importante en sepsis ya que no existen estudios in vivo. Dichos estudios son complicados debido a que las células que sufren apoptosis se desprenden, pasan al torrente sanguíneo y son rápidamente eliminadas dificultando así su detección (24). El endotelio funciona como célula blanco de apoptosis y como mediador de la misma por medio de la generación de radicales libres de oxígeno y proteínas de choque térmico. La insuficiencia metabólica asociada a la disfunción multiorgánica lleva a la remoción del factor de crecimiento, lo que estimula la apoptosis celular. La apoptosis endotelial permite la translocación de las bacterias a zonas internas favoreciendo la diseminación bacteriana (25).

MUERTE CELULAR EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

El término neurodegeneración denota la muerte neuronal patológica característica de las enfermedades neurodegenerativas primarias como la EA y EP, o secundarias como la isquemia cerebral. Aunque la etiología de la muerte neuronal en la mayoría de estos desórdenes permanece desconocida, diversas evidencias sugieren que en estas enfermedades las neuronas podrían morir por apoptosis (12, 26, 27).

En la dinámica causal compleja que caracteriza las enfermedades neurodegenerativas, la genética y el componente medioambiental no son eventos mutuamente excluyentes sino que podrían ser complementarios en el proceso subyacente. Diversos paradigmas neurotóxicos han sido propuestos como potenciales mediadores de esta muerte neuronal (28-31). Entre otros se incluyen toxinas exógenas como el MPTP (1-metil- 4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) (32), rotenona (33), 6-OH-dopamina (34), y endógenas como la ceramida (35), el péptido amiloide-(ß) (36, 37), y procesos como el estrés oxidativo (38), alteraciones mitocondriales (39), alteraciones del sistema ubiquitina-proteosoma (SUP) (40), y el envejecimiento (41).

En EP por ejemplo, dada la escasez de cambios necróticos en la sustancia nigra (SN), y el patrón topográfico y temporalmente específico de la pérdida celular, la apoptosis emerge como el principal mecanismo de muerte neuronal. Algunos reportes indican que el 12% de las neuronas dopaminérgicas que se pierden durante la EP expresan proteínas proapotóticas, y además se ha determinado que la activación de caspasas precede la muerte celular (42). Otros reportes resaltan la importancia de los elevados niveles de proteínas antiapoptóticas en los ganglios basales y la SN de pacientes con EP (43), aunque la evidencia es aún controversial. Una correlación positiva entre la pérdida celular, el porcentaje de células de la SN positivas para caspasa 3 y una disminución del 76% en EP, sugiere que esta enzima es el principal efector de la apoptosis en EP y contribuye a la vulnerabilidad regional observada (44).

Teniendo en cuenta la importancia de la mitocondria durante la apoptosis, y basados en el hecho de que los procesos que favorecen la apertura del mPTP se consideran proapoptóticos, y aquellos que favorecen su cierre se consideran antiapoptóticos (44, 45), la ceramida surge como un neurotoxina endógena importante en neurodegeneración. Se ha demostrado que la ceramida modula la función mitocondrial mediante la formación directa de canales (46) e indirectamente mediante la inhibición del complejo I y III de la cadena respiratoria (47, 48), lo que induce la liberación de citocromo C, genera radicales libres, altera la homeostasis de calcio, extingue el ATP, colapsa el Δψm (49) y conduce la célula a apoptosis.

Adicionalmente, el estudio de los efectos de algunas neurotoxinas utilizadas en modelos de EP como el MPTP, 6-hidroxidopamina y rotenona, han mostrado que su acción sobre la viabilidad celular está mediada por cambios en el Δψm (50, 51), y de manera interesante estos modelos pueden ser evitados y/o revertidos modulando las vías corriente arriba de la mitocondria (52). Esto sugiere que las proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 interaccionan específicamente con proteínas o con vías de supervivencia celular distintas, y que regulándolas diferencialmente se podría determinar su papel como un modulador positivo o negativo en la muerte celular (53).

ESTRATEGIAS ANTIAPOPTÓTICAS

La protección celular se refiere a los mecanismos por los cuales se busca prevenir la pérdida celular para retardar y/o prevenir la progresión de enfermedades asociadas a muerte celular como las neurodegenerativas y la sepsis. El rescate celular se refiere a los procesos para salvar células que se encuentran en proceso de degeneración y se considera parte del proceso protector. Una de las principales herramientas en la protección es por medio de inhibición de la apoptosis. La restauración celular hace referencia al incremento del número de células, por ejemplo mediante transplantes, y no será tratada en esta revisión.

Las estrategias antiapoptóticas son variadas y se basan en la inhibición de vías de señalización involucradas en el proceso apoptótico y/o en el fortalecimiento de vías de supervivencia neuronal antiapoptótica, ya sea por métodos genéticos y/o farmacológicos. La mayoría de estos estudios se han realizado en modelos experimentales (54) y algunos ya han llegado al nivel clínico.

LA FAMILIA BCL-2

La familia Bcl-2 está constituida por un grupo de proteínas involucradas en la regulación de la muerte celular, que incluye miembros tanto con actividad proapotótica como antiapoptótica (55- 58). Las proteínas Bcl-2 antiapoptóticas se localizan principalmente a nivel de membranas, en particular en la membrana mitocondrial externa (59-61), mientras que la mayoría de los miembros proapotóticos se encuentran en el citosol, pero sufren un proceso de translocación a las membranas, particularmente a la mitocondria y retículo endoplásmico, luego de un estímulo apoptótico (62-64). Diversos estudios han demostrado que los miembros pro y antiapoptóticos de la familia Bcl-2 alteran o mantienen la homeostasis mitocondrial respectivamente, mediante la formación de canales o mediante el control de canales preexistentes en la mitocondria. Así, miembros antiapoptóticos como Bcl-2 y Bcl-xL previenen la pérdida de la homeostasis mitocondrial y la liberación de mediadores proapoptóticos confinados dentro de la mitocondria, mientras que los miembros proapoptóticos alteran tal homeostasis y permiten la liberación de mediadores pro-apoptóticos hacia el citosol (figura 2) (56, 60, 62, 65-68). De acuerdo con este modelo de “reóstato” de las Bcl-2, el balance entre los miembros proapoptóticos y antiapoptóticos definen la sensibilidad celular hacia estímulos apoptóticos particulares (56, 69).

Un miembro de la familia Bcl-2 lo constituye la proteína A1, que se expresa en células endoteliales en respuesta a estímulos proinflamatorios. Además de proteger el endotelio contra la apoptosis mediada por TNF y ceramidas (figura 3), A1 también inhibe la activación endotelial y, por consiguiente, la expresión de proteínas proinflamatorias mediante la inhibición del factor transcripcional NFkB (70, 71). Ademá la expresión de A1 también depende de NFkB, por lo tanto A1 se encarga de su autorregulación.

Diversos estudios han demostrado que la sobreexpresión de miembros antiapoptóticos o la deficiencia de miembros proapotóticos de la familia Bcl-2 protegen contra estímulos apoptóticos variados. En modelos de EP, la deficiencia de Bax protege las células dopaminérgicas contra el efecto tóxico de la toxina MPTP (72), de igual forma que la sobreexpresión de Bcl-2 (73, 74).

INHIBIDORES DE CASPASAS

Las caspasas son un grupo de proteasas de cisteína importantes en la progresión de la apoptosis (75). Varios estudios han demostrado el potencial protector de la inhibición de las caspasas por métodos farmacológicos o genéticos como neuroprotectores (54, 76-79). Sin embargo, la protección conferida por estrategias inhibidoras de caspasas, por ejemplo en neuronas, es limitada, temporal y los resultados son contradictorios. En algunos casos se ha demostrado protección en diversos modelos (80-84) mientras no en otros (85-88). Estos estudios sugieren que aunque existe cierta protección mediante la utilización de inhibidores de caspasas, sus efectos son específicos del tipo celular y el paradigma utilizado, y no siempre favorecen la supervivencia a largo plazo, ni la preservación de terminales nerviosas, ni la función celular normal, que son dos pilares claves en neuroprotección (3, 54, 78, 87).

La combinación de inhibidores de caspasas y factores de crecimiento, como neurotrofinas, han demostrado su potencial neuroprotector, favoreciendo la supervivencia celular a largo plazo (54, 82, 87, 89, 90).

LA VÍA PI3K/AKT

La vía PI3K/Akt puede participar en la supervivencia celular y neuroprotección mediante el bloqueo de la apoptosis, al promover la proliferación celular y al regular vías adicionales de señalización celular. En neuronas la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) y su mediador corriente abajo, proteína quinasa B o Akt (PKB/Akt), median señales de supervivencia, diferenciación y proliferación neuronal (91, 92).

Estas vías activadas por diversos factores de crecimiento (FC) son un punto crucial en el cual convergen diversas señales de supervivencia celular (93, 94). La unión de FC a los receptores tirosina quinasa causa autofosforilación de sus residuos tirosina, reclutamiento de proteínas adaptadoras como Shc, acoplamiento corriente abajo y activación de las vías PI3K/Akt y Raf/ MEK/ERK (95-98).

PI3K consiste en una subunidad reguladora (85 kDa) y una catalítica (100 kDa) encargada de la fosforilación de lípidos de inositol para generar 3-fosfoinositoles (PI(3)P, PI(3,4)P2 y PI(3,4,5)P3). Éstos se unen a un dominio homólogo a plekstrina presente en una variedad de moléculas de señalización, alterando su actividad y localización subcelular (99). La función de supervivencia de PI3K en particular está mediada por la activación Akt (99-101). Recientemente se ha demostrado que la activación de Akt requiere su translocación a la membrana plasmática y la fosforilación en treonina 308 (Thr308) y serina 473 (Ser473) (102, 103). Los blancos corriente abajo de Akt son diversos, y se asocian a respuestas metabólicas y de supervivencia celular (104, 105). En neuronas, se ha demostrado que Akt regula la supervivencia pero no el crecimiento y la diferenciación (94).

Los sustratos de Akt incluyen la inactivación por fosforilación de mediadores pro-apoptóticos (Bad, Bax, caspasa-9, factor de transcripción Forkhead, GSK-3, p53), y activación de proteínas antiapoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, IAP y mTOR) (figura 3) (100, 106-110). Por otro lado, algunas vías implicadas en la supervivencia celular como Akt y la hexoquinasa interfieren con la capacidad de Bax de alterar el Δψm, abrir el PTP y liberar el citocromo C, e inducir muerte celular (111-113).

Probablemente Akt media la supervivencia neuronal a diferentes niveles dependiendo del tipo celular, de la disponibilidad de blancos y del requerimiento de eventos transcripcionales o postranscripcionales (114). El desarrollo de terapias dirigidas contra componentes específicos de la vía PI3K/Akt y sus blancos corriente abajo, puede constituir una de las principales opciones para la regulación de la muerte celular y un blanco terapéutico para favorecer la supervivencia neuronal de las poblaciones más susceptibles.

Adicional a su función en supresión de la muerte celular, los factores de crecimiento (FC) vía PI3K/Akt también regulan el metabolismo celular modulando la captación de glucosa (115- 119). Poco se conoce acerca de la función de la vía PI3K/Akt en la regulación del metabolismo de la glucosa (glucólisis) y cómo ésta contribuye a las decisiones de supervivencia/muerte celular (120, 121).

A diferencia de las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, que mantienen la homeostasis mitocondrial en respuesta a remoción de FC al promover el transporte continuo de metabolitos a través de la membrana mitocondrial externa aún en presencia de metabolismo celular disminuido (122, 123), la supervivencia mediada por PI3K/Akt requiere de un suplemento continuo de sustratos metabólicos y, por ende, depende del metabolismo celular (116).

En modelos de ausencia de FC y de glucosa, la disminución en la glucólisis se ha asociado de forma consistente con estadios iniciales de apoptosis (depleción de ATP, translocación mitocondrial de Bax, activación de JNK, disminución Δψm, y liberación de citocromo C al citoplasma). Estos cambios se generan debido a la ausencia de sustratos metabólicos derivados de la glucosa, ya que la sobreexpresión de Glut1 (transportador de glucosa) previene tales alteraciones (116, 124, 125). La sobreexpresión de Akt previene también las alteraciones asociadas a ausencia de FC y mantiene la supervivencia celular al estabilizar la bioenergética celular vía incremento en el transporte y metabolismo de glucosa (126). Se ha demostrado que Akt incrementa la actividad hexoquinasa, de tal forma que la hexoquinasa permanece asociada a la mitocondria y disminuye la muerte celular (127). Estos estudios sugieren que el acoplamiento entre glucólisis y la función mitocondrial es un prerrequisito para que los FC, y en particular Akt, medien sus efectos en supervivencia. Además, la actividad hexoquinasa es suficiente para que Akt inhiba la apoptosis (127). La forma como la vía PI3K/Akt regula la función hexoquinasa, su asociación/desplazamiento de VDAC, y la función mitocondrial, y cómo la actividad hexoquinasa contribuye a la supervivencia celular mediada por los FC, requieren mayor análisis. Así, la inhibición de la vía glucolítica a través de inhibición de la vía PI3K/Akt puede determinar eventos que dirigen las neuronas a muerte celular, y constituyen un blanco terapéutico poco explorado en EP.

En la EP, algunos estudios han evaluado el papel de la vía AKT y su relación directa con algunas proteínas implicadas en esta enfermedad como las sinucleínas. Se ha reportado que éstas estabilizan Akt y favorecen su acción promoviendo la supervivencia celular (128). Además, su relación con algunas de las toxinas implicadas en la etiopatogénesis de la EP, como el MPTP, el rotenona, la OH-Dopamina parecen regular corriente abajo y negativamente la actividad Akt, favoreciendo así el proceso apoptótico de manera selectiva (129-131). Por otro lado, proteínas implicadas en fenómenos de neuroprotección, neurodegeneración como son la HSP o chaperonas moleculares (132-134), se han visto que regulan y estabilizan Akt evitando su defosforilacion y, por ende, evitan la apoptosis y promueven la sobrevida celular (135, 136). Se plantea que de esta manera median su papel neuroprotector. Así mismo, algunos agonistas de los receptores dopaminérgicos que han mostrado evidencia en modelos experimentales de neuroprotección, también ejercen su efecto a través de la vía PI3K/Akt (137-139).

En el endotelio Akt promueve la supervivencia inhibiendo la apoptosis mediada por Fas al regular la expresión de FLIP (proteína inhibitoria de FLICE), FLIP interactúa con FADD (Dominio de muerte asociado a FAS), inhibiendo la activación de la caspasa 8 (figura 3C) (140). Además, Akt suprime la vía apoptótica mitocondrial al fosforilar Bad y la pro-caspasa 9 (figura 3B); Akt también promueve la degradación de IkB incrementando así la actividad del NFkB y estimulando la síntesis endotelial de óxido nítrico inhibiendo de esta manera las caspasas por nitrosilación (figura 3C) (140-142).

LA PROTEÍNA C ACTIADA

La proteína C es una serina proteasa y un anticoagulante natural que al unirse (en exceso de trombina) a la trombomodulina y a los re- ceptores endoteliales de proteína C (EPCR) presentes en la superficie endotelial, produce la proteína C activada. Esta última interacciona con la proteína S inhibiendo los factores Va y VIII, limitando así la trombosis. Una segunda acción antitrombótica la realiza al formar un complejo con el inhibidor del activador de plasminógeno- 1(PAI-1), facilitando así la fibrinolisis (143). La acción antiinflamatoria la realiza atenuando la expresión de factor de necrosis tumoral a (TNFα) y el factor nuclear k B (NFkB) (144). Estudios in vitro han demostrado que la proteína C se une a un receptor en los macrófagos e inhibe la producción del factor de necrosis tumoral (144). La proteína C activada también reduce la interacción neutrófilos-selectinas, y la inflamación mediada por citoquininas y trombina.

Estudios epidemiológicos han demostrado que la PCA es un factor de protección contra isquemia cerebral (145). En modelos de isquemia cerebral se ha demostrado efecto protector de la PCA al endotelio cerebral, a través de la regulación de la proteína P53 (dependiente de la inhibición de la transcripción), modulación de la tasa Bax/Bcl-2 y regulación de la actividad de caspasa 3. El efecto de la PCA depende de la activación inicial del receptor de proteína C endotelial (EPCR) seguida de la activación del receptor-1 activado por proteasa (PAR-1) (146). Adicionalmente, se ha demostrado que la protección conferida al endotelio cerebral por la PCA se relaciona con la capacidad de PAR-1 de regular los niveles intracelulares de calcio (147). Esta función protectora es diferente a la reportada para células endoteliales de otras fuentes, en las cuales el efecto protector de PCA se da a través de una reducción en la expresión de la subunidad p50 del NFkB, inhibición de la síntesis de citoquinas (incluyendo TNF y moléculas de adhesión de la superficie celular tales como CX3C, moléculas de adhesión intracelular-1, E-selectinas y moléculas de adhesión vascular-1), expresión de proteínas antiapoptóticas y de sobrevivencia celular (A1, inhibidor de apoptosis-1, sintetasa de óxido nítrico endotelial y A20) y disminución en la expresión de proteínas inductoras de apoptosis tales como calreticulina y TRMP-2 (148). Sin embargo, el efecto protector directo de la PCA en neuronas ha sido poco explorado. Recientemente, un estudio tanto in vitro como in vivo ha demostrado que la PCA neuroprotege contra la acción tóxica de la estaurosporina y contra la excitotoxicidad mediada por NMDA, en forma dependiente de PAR-1 y PAR-3 e independiente de EPCR (149). El rol antiapoptótico de la PCA contra ceramida permanece sin ser explorado.

CONCLUSIONES

La apoptosis celular se considera uno de los principales mecanismos fisiopatológicos involucrados en diversas enfermedades humanas, en particular en procesos neurodegenerativos y sépticos, que comprometen la muerte de grupos neuronales específicos y del endotelio respectivamente. La comprensión de los procesos de regulación de las vías de señalización intracelular implicadas en supervivencia/muerte celular, pueden generar nuevas herramientas farmacológicas o la implementación en nuevos paradigmas patológicos de algunas ya existentes, que permitan la regulación de la apoptosis (antiapoptosis) y el potenciamiento de las vías de supervivencia celular que favorezcan los procesos de viabilidad específica. El análisis de diferentes grupos de células permite una visión diferencial de los procesos celulares particulares a cada una, como la muerte celular, y la definición de vías célula-específicas involucradas en estos procesos, que contribuyen al mejor entendimiento de tales mecanismos.

La correlación funcional y patológica endotelio-neuronas, en el contexto de la función de la barrera hemato-encefálica, se convierte en la actualidad en un área de amplio análisis dada su importancia como regulador de la fisiología normal del sistema nervioso y de su compromiso en el marco de enfermedades neurodegenerativas y procesos sépticos. De tal forma que el análisis de los procesos de muerte endotelial en los procesos sépticos y neuronales en neurodegeneración, permitirá ayudar a la comprensión de mecanismos, ya sean similares o no, que desencadenan la muerte de estos tipos celulares y que pudieran desembarcar en novedosas estrategias protectoras similares. En tal sentido, es interesante mencionar que la proteína C activada aparece como una estrategia terapéutica en casos severos de sepsis mediante su acción antiapoptótica en endotelio. Sin embargo, su acción en neuronas ha sido poco explorada y podría convertirse en una alternativa como agente neuroprotector, ya sea mediante su acción directa en las neuronas o indirectamente mediante la protección endotelial.

Dentro del grupo de Ciencias Básicas Médicas de la Facultad de Medicina de la Universidad del Rosario se viene consolidando una línea de investigación en el campo de la muerte celular, la cual busca realizar investigación básica a nivel celular y molecular de potenciales terapias para prevenir la muerte celular en modelos in vitro de neuronas mesencefálicas y endotelio, con la mira, a corto plazo, de ampliar los hallazgos in vitro a modelos animales de experimentación de enfermedad de Parkinson, barrera hemato-encefálica y sepsis.

Figura 1. Vías generales de apoptosis

Se han caracterizado dos vías generales de iniciación de apoptosis: la vía extrínseca dirigida por la estimulación de receptores de muerte y la activación de caspasas iniciadoras que activan caspasas ejecutoras directamente o a través de alteraciones mitocondriales mediadas por miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2 como Bax y Bid; y la vía intrínseca iniciada por alteraciones celulares como daño al ADN y estrés del retículo endoplásmico, que dirigen alteraciones en la homeostasis mitocondrial y la subsecuente activación de caspasas ejecutoras. Las alteraciones mitocondriales a través de cualquiera de las dos vías parece ser el determinante clave del compromiso de muerte celular. La perturbación de la permeabilidad mitocondrial causa la liberación de moléculas proapoptóticas como el citocromo C, Apaf-1, Smac/Diablo entre otras, que conducen a la formación del apoptosoma de una manera dependiente de ATP. El apoptosoma a su vez dirige el clivaje y la activación de la caspasa 9, y la inhibición de las proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP). De esta manera se asegura la activación de las caspasas ejecutoras (caspasa 3, 7), el clivaje de diversos sustratos celulares y la apoptosis.

Figura 2. Consecuencias generales de la apertura del poro de permeabilidad transicional mitocondrial (mPTP) en apoptosis

El PTP controla la liberación de mediadores pro-apoptóticos de la mitocondrial al citosol y se encarga de mantener el potencial de membrana mitocondrial (pmm). El PTP es regulado por las proteínas de la familia Bcl-2: (A) proteínas antiapoptóticas (Bcl-2 y Bcl-xL) inhiben la apertura del PTP, mientras (B) proteínas proapoptóticas (Bax y Bad) causan apertura del PTP.

Figura 3. Estrategias antiapoptóticas en endotelio

A. Inhibición de la apoptosis mediada por TNF por la proteína A1 (miembro de la familia de la Bcl-2). B. Inhibición de la apoptosis mediada por ceramida por acción de la proteína A1. Akt inhibe la vía apoptótica mitocondrial por medio de la fosforilación de Bad y la procaspasa 9. C. Akt inhibe la apoptosis mediada por Fas y la activación de caspasa 8 (izquierda). Akt estimula la síntesis de óxido nítrico (derecha) que genera nitrosilación e inhibición de caspasa 3.


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