Papel de la vía fosfatidilinositol 3 kinasa (PI3K/Akt) en humanos

Role of phosphatidylinositol 3-kinase pathway (PI3K/Akt) in humans

Carlos Eduardo Pinzón, MD,¹ Martha Lucía Serrano, PhD,² María Carolina Sanabria, MSc³

1. Grupo de Genética Humana, Universidad del Rosario, Bogotá, Colombia. Grupo de Investigación Clínica, Instituto Nacional de Cancerología. Correo electrónico: cpinzon@cancer.gov.co, cepinzon@gmail.com.
2. Grupo de Investigación en Biología del Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología, Bogotá, Colombia.
3. Ciencias Básicas Biomédicas. Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.

Recibido: febrero 3 de 2009 Aceptado: junio 11 de 2009

Resumen

La vía de señalización de la fosfatidilinositol- 3-kinasa (PI3K) es crucial en numerosos aspectos del crecimiento y la supervivencia celular. Esta vía es estimulada fisiológicamente como consecuencia de muchos factores de crecimiento y factores reguladores. Varias alteraciones genéticas como amplificación, mutación y rearreglos cromosómicos pueden comprometer la vía PI3K, generando su activación permanente.

En diferentes tipos de cáncer se han encontrado evidencias de estas modificaciones genéticas deletéreas. La activación anormal de la vía PI3K resulta en alteración de los mecanismos de control del crecimiento y la supervivencia celular, lo que favorece el crecimiento competitivo, la capacidad metastasica y, frecuentemente, una mayor resistencia a los tratamientos. El objetivo de este articulo es revisar los aspectos relacionados con el funcionamiento de la vía de señalización PI3K/ Akt y su rol dentro del proceso de carcinogénesis en los seres humanos.

Palabras clave: Fosfatidilinositoles, Akt, PI3K, mTOR, vías de señalización, neoplasias.

Summary

The signaling pathway of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) is critical in many aspects of growth and cell survival. The path of PI3K is stimulated physiologically as a result of many growth factors and regulatory factors. Several genetic alterations such as amplification, mutation and chromosomal arrangements may compromise the PI3K pathway, generating permanent activation in different cancer types have found evidence of these deleterious genetic modifications. Abnormal activation of the PI3K pathway results in alteration of the control mechanisms of growth and cell survival, which favors the competitive growth, and frequently metastatic capacity, greater resistance to treatment. The aim of this paper is to review matters relating to the operation of the PI3K/Akt signaling pathway and its role in the process of carcinogenesis in humans.

Key words: 1-Phosphatidylinositol 3-Kinase, Proto-Oncogene Proteins c-akt, PTEN Phosphohydrolase, m TOR protein, neoplasm.

INTRODUCCIÓN

La vía de señalización de la fosfatidilinositol- 3-kinasa (PI3K) es crucial en numerosos aspectos celulares involucrados en el crecimiento y la supervivencia celular (1). La vía de la PI3K es estimulada fisiológicamente como consecuencia de la activación de receptores de membrana tirosina kinasa, los cuales autofosforilan y fosforilan el sustrato del receptor de insulina (IRS); este ultimo, a la vez, fosforilara la subunidad p85 de la PI3K (Figura 1). La fosforilacion de la subunidad p85 conduce a un cambio conformacional de dicha proteína que conduce a la unión de la subunidad catalítica (p110). La PI3K activa, fosforila el fosfatidil inositol 3,4 difosfato (PIP2) convirtiéndolo en el segundo mensajero fosfatidil inositol 3,4,5 trifosfato (PIP3), el cual, corriente abajo, conduce a la activación de la proteína Akt. La Akt tiene múltiples blancos, responsables de los efectos de la activación de la vía (1-3). La activación anormal de esta vía conduce a una respuesta proliferativa y antiapoptotica que se relaciona con el desarrollo de múltiples tipos de cáncer; por esto, su estudio es parte crucial para el entendimiento de los procesos de carcinogénesis (4-5).

Figura 1. Esquema de la vía de señalización fosfatidil inositol 3 kinasa. ERK; kinasa regulada por señales extracelulares. FKHR; forkhead. GDP; ganosita difosfato. IRS; sustrato receptor de insulina. GSK3; kinasa sintasa de glicógeno. MAPK; protein kinasa mitógeno activado. NFkβ; factor nuclear kβ. PIP2; fosfatidil inositol 3,4 difosfato. PIP3; fosfatidil inositol 3,4,5 trifosfato. PKC; protein kinasa C. STATA; traductor de señal y activador de la trascripción Adaptado con permiso de Macmillan Publishers Ltd.: Exploiting the PI3K/Akt pathway for cancer drug discovery; Hennessy BT, Smith DL, Ram PT, Lu Y, Mills GB; Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery, Nature reviews, drug discovery. Vol 4, 988-1004; 2005.

COMPONENTES DE LA VÍA P13K/AKT

PI3Ks

La familia de PI3K constituye un gran grupo de proteínas kinasas de serina/treonina, que incluyen fosfatidilinositol kinasas, proteínas kinasas dependientes de ADN (DNA-PK), ataxia telangiectasia-mutada (ATM) y ataxia telangiectasia y Rad3, relacionadas (ATR) (1,2,4). Existen tres tipos de PI3K. En la tabla 1 se enuncian las principales características de cada uno de los tipos de PI3K (6-21).

Tabla 1. Características de las isoformas de la proteína PI3K

AKT (proteína kinasa B)

Akt es el homologo humano del oncogén viral v-Akt (retrovirus Akt 8) y esta relacionado con proteínas kinasas A (PKA) y C (PKC) en humanos (22-23). Akt tiene tres isoformas conocidas, derivadas de distintos genes: Akt1/PKBα, Akt2/PKBβ y Akt3/PKBγ (23-24). El dominio PH en la región N-terminal de Akt interactúa con 3´-fosfoinositoles, contribuye al reclutamiento de Akt hacia la membrana plasmática (25). El dominio PH en la región N-terminal de Akt interactúa con 3´-fosfoinositoles, ayudando al reclutamiento de Akt hacia la membrana plasmática (24-26). Se han identificado diferentes PDK2 potenciales. Estas son proteinquinasas vinculadas en proceso de activación de diferentes vías de señalización, incluyendo el complejo rictor-mTOR (pero no el complejo raptor-mTOR inhibido por rapamicina y sus análogos), la ILK (kinasa ligada a integrina), la PKCβII e, incluso, la propia Akt, permitiendo, por tanto, un potente mecanismo de retroalimentación en la vía (27). Aun no hay claridad sobre el tipo de interacción de las PDK2 en la regulación de Akt; también falta esclarecer el papel relativo de la señalización de Akt en la membrana, el citosol y el núcleo (28-29).

Las isoformas de Akt se han visto implicadas en funciones especificas, relacionadas con cáncer (Akt2 en motilidad/invasión y Akt3 en la independencia hormonal) (30). En ratones knockout, la eliminación de las diferentes isoformas conlleva a diversos defectos en el desarrollo y alteraciones en la sensibilidad a la insulina (31- 32). Akt2 se encuentra amplificado en tumores pancreáticos, de mama y de ovario, y la actividad de Akt3 se ha visto aumentada, a través de un mecanismo desconocido, en canceres de próstata y de mama, no sensibles a hormonas (33).

Debido a que las aberraciones en Akt1 son mas frecuentes, Akt2 y Akt3 deben suplir diferentes funciones, generando, así, una presión selectiva para aberraciones durante la génesis tumoral. Los inhibidores selectivos de isoformas podrían ser necesarios para alcanzar una optima eficacia con una toxicidad aceptable (33).

Akt, los sensores de energía celular LKB1 (STK11) y la proteína kinasa AMP activada (AMPK) ejercen un efecto opositor en el blanco mamífero de la rapamicina (mTOR), activado por la Akt.

Eventos celulares corriente abajo, regulados por PI3K/Akt

La vía de PI3K se bifurca en muchos puntos, resultando en diversos resultados funcionales. La diversidad de respuestas funcionales probablemente representa los efectos del espectro, el nivel y la duración de la activación de componentes particulares de la vía de PI3K. Sin embargo, diferentes nodos en la vía se han implicado como elementos fundamentales en desenlaces particulares (Figura 1) (34).

Papel de PI3K en la supervivencia celular e inhibición de la apoptosis

Existen revisiones previas acerca del papel de la vía de PI3K/AKT en la proliferación y supervivencia celular (35-36). La señalización por Akt inactiva varios factores proapoptoticos como BAD, procaspasa-9 y factores de transcripción FKHR (Forkhead) (Figura 1) (37-38). Otros factores de transcripción que incrementan la expresión de genes anti-apoptoticos son activados por Akt, incluyendo CREB (proteína de unión a elementos de respuesta a AMP-cíclico), mediante fosforilacion directa, NF-KB e HIF-1α. La activación del factor de transcripción NF-KB, a través de Akt, se genera inicialmente mediante la fosforilacion y consecuente activa cion de IKKαβ (kinasa inhibidora de NF-KB), que fosforila y marca a IkB (inhibidor de NFkB) para ser degradado mediante el sistema ubiquitina-proteosoma, dejando libre a NF-KB, favoreciendo tanto su translocacion al núcleo, como su actividad de transcriptor de genes antiapoptoticos. Otro efecto de Akt, para favorecer la supervivencia celular, es la inactivación del gen supresor de tumor, p53; lo cual se da por la habilidad de Akt para fosforilar y activar directamente a MDM2, una proteína que regula negativamente a p53. MDM2 se encuentra usualmente en el citoplasma y tiene dominios NSL (señalización de localización nuclear) y de unión a p53. Cuando MDM2 es activado por Akt, se transloca al núcleo para unirse a p53, impidiendo su actividad como factor de transcripción de genes proapoptoticos; posteriormente, sale nuevamente al citoplasma donde media los procesos de ubiquitilacion y degradación proteosomica de p53, disminuyendo sus niveles. Cuando la vía PI3K/Akt se encuentra en un estado de activación permanente, el anterior mecanismo permite que una célula, aun en malas condiciones, resista a la apoptosis, sobreviva y prolifere, contribuyendo, de esta manera, a la inestabilidad cromosómica, característica de la vía supresora de la carcinogénesis (39-42). La fosforilacion de muchos efectos por Akt regula su localización y, por tanto, su actividad, al generar sitios de ligando para proteínas 14-3-3, importantes en la regulación de la localización celular y en la degradación de diversas moléculas (42-43).

Papel de PI3K en la transcripción de genes, traducción a proteínas, metabolismo, crecimiento y proliferación celular

La proteína serina/treonina kinasa, mTOR (blanco mamífero de rapamicina) activada por Akt, se puede considerar como el regulador central del crecimiento celular (44). mTOR regula la traducción proteica, en respuesta a nutrientes y factores de crecimiento, al fosforilar componentes de la maquinaria de la síntesis de proteínas como son p70S6K (proteína ribosomal S6 kinasa) y 4E-BP (proteína ligadora de 4E). La fosforilacion de 4E-BP1 por raptor-mTOR (proteína regulatoria asociada a mTOR), libera el eIF-4E (factor iniciador de la traducción eucariotico 4E) para restablecer la traducción a proteínas dependiente de cap. Se han evidenciado, además, las actividades transformadoras y anti-apoptoticas in-vitro de eIF-4E (45-47). El complejo formado por TSC1 (hamartina) y TSC2 (tiberina) es un heterodimero que regula negativamente la vía raptor/ mTOR, ya que, estando activo, retiene e inactiva la proteína Rheb. Estando activa, dicha proteína se une al complejo raptor/mTOR, activándolo y favoreciendo los procesos de traducción proteica y crecimiento celular. El mecanismo anterior sucede gracias a la actividad kinasa de Akt, que fosforila la subunidad TSC2 del complejo, inactivándolo y dejando libre y activa a la proteína Rheb para unirse el complejo raptor/mTOR (48- 50). La cascada TSC/Rheb/mTOR/S6K también regula el sustrato del receptor de insulina (IRS). y PDGFR, el cual incluye potencialmente una importante asa de retroalimentación adicional (51-52). De hecho, la inhibición de mTOR por rapamicina, o sus análogos, puede activar proteínas upstream, incluyendo Akt, lo cual, probablemente, es resultado de la perdida de la inhibición de la retroalimentación (53-54). La rapamicina y sus análogos inhiben la vía raptor/mTOR, es decir, bloquean la fosforilacion de p70S6K y de 4E-BP1. De esta manera, se impide la activación de p70S6K y la inhibición de 4E-BP1, regulando de forma negativa los procesos de traducción proteica y crecimiento celular, siendo este el efecto deseado sobre un tejido tumoral (55).

Adicionalmente, la vía de PI3K/Akt interactúa con los mecanismos de control de la energía celular y el metabolismo de la glucosa (Figura 2) (56). Cuando se genera estrés celular, por depleción de glucosa y/o hipoxia, aumentan los niveles de AMP y disminuyen los de ATP por falta en la producción de energía; es decir, hay una alteración en la relación AMP/ATP. La proteína LKB1 (STK11, kinasa serina treonina 11) forma un complejo con STRAD (proteína adaptadora relacionada a Ste-20) y MO25 (proteína murina 25), LKB1-STRAD-MO25, forma mediante la cual se hace mas activa. Este complejo fosforila a AMPK (proteína kinasa activada por AMP), sensor de estrés celular, y lo activa. AMPK ejerce, entonces, su actividad kinasa sobre TSC2, activando el complejo TSC1/TSC2, lo que permite el secuestro de Rheb, el consecuente bloqueo de la vía raptor/mTOR y, por tanto, del crecimiento celular, permitiendo, así, la conservación energética en condiciones adversas (Figura 3) (57). Mutaciones en la línea germinal de genes que codifican para PTEN (homologo de la fosfatasa y tensina), TSC2 y LKB, resultan en síndromes clínicos similares, caracterizados por la presencia de hamartomas en diferentes sitios, además de un incremento en el riesgo de aparición de canceres específicos. De esta manera, otorgan evidencia sobre la perdida de la regulación del crecimiento celular ante la desregulación de la vía de PI3K/ AKT, causada por la inactivación de estos genes cruciales (Figura 3) (58). Además, Akt esta involucrado en los procesos de regulación del ciclo celular al fosforilar las CKI (inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas) p21^CIP1/WAF1 y p27^KIP1, favoreciendo, de esta manera, su translocacion al citoplasma y posterior degradación (59-61). Como resultado, se incrementa la proliferación celular, al abolirse el efecto antiproliferativo de las CKI sobre los complejos de ciclina-kinasas, y también, probablemente, a funciones citosolicas novedosas de los CKI. Akt, de forma directa o indirecta, fosforila e inhibe la GSK3 (kinasa glucógeno sintetasa-3), la fosfodiesterasa-3B, la proteína fosfatasa 2A y, posiblemente, a Raf1; en consecuencia, crea una compleja red intracelular (62). Los inhibidores de GSK3 previenen la fosforilacion de β-catenin, impidiendo su degradación, resultando en traslocacion al núcleo para estimular la trascripción de genes blanco, incluyendo c-JUN y homebox del gen CDX1 (63). Adicionalmente, la fosforilacion de ciclina D1 por GSK3 resulta en su desestabilización (64- 65). La señalización de PI3K también controla la angiogenesis, el crecimiento, la proliferación, la senescencia y otros procesos, a través de mecanismos como la activación transcripcional del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y la expresión del factor 1α inductor de hipoxia (HIF1 á) (66-67).

Regulación negativa de la vía PI3/Akt mediada por PTEN

PTEN es una proteína que regula la señal de supervivencia celular, dependiente e independiente de la vía PI3K/Akt. Esta proteína supresora de tumor se expresa cuando existen señalizaciones de daño celular, bloqueando la supervivencia de la célula mediante p53. La actividad fosfatasa de PTEN le permite desfosforilar la PI(3)P, inhibiendo el proceso de activación de Akt y el proceso de inactivación de p53 vía Akt-MDM2. PTEN también se une a p53, favoreciendo su estabilidad e impidiendo la actividad inhibitoria de MDM2 sobre la misma. Lo anterior representa que p53 se mantiene activa para inhibir la proliferación celular y promover los procesos de reparación o apoptosis. De esta manera, se protege tanto la integridad genómica como cromosómica de una célula y un tejido en general (68).

Figura 2. El rol de AKT y el blanco mamífero de la rapamicina (mTOR) en la homeostasis de la glucosa

Figura 3. Síndromes clínicos asociados con la alteración de la vía de señalización PI3K/Akt, resultado se las mutaciones en cuatro genes supresores de tumor

Papel de la vía PI3K/Akt en cáncer

La inhibición de los componentes de la vía PI3K puede hacer oposición o sobreponerse a la resistencia, a quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal y a los agentes dirigidos en cáncer (69-71). Un mecanismo potencial para esta oposición es la potenciación de la apoptosis. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han realizado con compuestos relativamente no específicos y podrían reflejar la inhibición de kinasas similares a PI3K, activadas por daño o irradiación al ADN (por ejemplo, proteína kinasa activada por ADN (DNA-PK), ATM y ATR), por medio de medicamentos tales como LY294002 o wortmannin (72-74).

En cáncer de seno existen importantes interacciones entre los efectos genómicos y no genómicos del receptor de estrógenos y las kinasas de membrana y citoplasmáticas, incluyendo a los miembros de la vía PI3K que juegan un papel en la resistencia anti-estrogenica (75-76). La actividad de PTEN contribuye a la eficacia de trastuzumab (Herceptin; Genetech) y a la radioterapia (77-78). Por tanto, el estado de activación de la vía de PI3K contribuye a la resistencia tumoral ante ciertas terapias, lo mismo que ante quimio y radioterapia (79).

Aberraciones y alteraciones genéticas de la vía de PI3K en cáncer

Las anomalías en la vía de PI3K son comunes en cáncer y participan en la transformación neoplasica (Tabla 2) (80). En si, PI3K es un blanco frecuente de activación mutacional (81). Las mas frecuentes aberraciones genéticas en cáncer de seno son las mutaciones missense somáticas en el gen que codifica p110a (PIK3CA). Estas mutaciones ocurren con mayor frecuencia en canceres HER2-amplificados y en positivos para receptor hormonal (82). La amplificación o mutación del gen PIK3CA también ocurren comúnmente en cáncer de colon, ovario (mutaciones en subtipos de células endometriales y claras, y amplificación en tumores serosos), de cabeza y cuello y escamoso de cuello uterino, gástrico, pulmonar, oligodendroglioma anaplasico, astrocitoma anaplasico, glioblastoma multiforme y meduloblastoma (82-87). A pesar de que las mutaciones y translocaciones en p85α son raras, sirven para hacer énfasis en la importancia de la vía (88).

La Akt y PTEN también son blanco de frecuentes cambios genómicos y epigeneticos en canceres humanos (Tabla 3) (89-99). Recientemente, y de forma sistemática, se realizo una secuenciación genética a gran escala de las fosfatasas y tirosin kinasas por parte de tres grupos académicos (ver el Sanger Centre Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) (100-103). Se detectaron frecuentes mutaciones no descritas en la vía de PI3K o en otras vías de kinasas, por ejemplo, en los tres genes que codifican los componentes de la vía PI3K/Akt (PDK1, AKT2 y kinasa activada por p21 (PAK4)) en cáncer colorrectal. En modelos específicos, se demostró que las isoformas de Akt tienen actividad de transformación. Las alteraciones genéticas también se presentan en moléculas de otras vías relacionadas con cáncer (Tabla 4) (104-118). En muchos casos, los efectos oncogénicos de estas anormalidades están mediados, al menos parcialmente, por la señalización de PI3K/Akt. Mutaciones en Ras, que activan PI3K, son comunes en cáncer de páncreas (104-107).

La modulación de la vía PI3K/Akt es requerida para la génesis tumoral mediada por HER2, en modelos animales y para las respuestas con trastuzumab (109-113). La vía PI3K/Akt también se requiere para los efectos oncogénicos de EGFR. Un incremento en la actividad de PI3K esta asociado con transformación por SRC, antígeno T medio de polioma, ABl y Ros.

Tabla 2. Anormalidades en la vía de señalización PI3K/Akt en cáncer

Tabla 3. Anormalidades en las vías de señalización relacionadas con PI3K/Akt en cáncer

Tabla 4. Funciones asociados a las diferentes isoformas de p110 de PI3K

Importancia del estudio de la vía de Señalización

En contraste con p53 y otras vías supresoras tumorales, la vía del PI3K se activa en el cáncer, convirtiéndola en un blanco terapéutico optimo, ya que es mas fácil inhibir los eventos de activación que reemplazar la perdida de la función supresora de tumores (118). Mas de 20 compañías farmacéuticas y centros académicos han manifestado programas activos en esta área y se espera que en los próximos anos inicien ensayos clínicos de medicamentos específicos.

Algunos fármacos de uso clínico, o en fase de evaluación preclínica, originalmente desarrollados con otros propósitos o no identificados en los tamizajes de la vía PI3K, han demostrado, directa o indirectamente, actuar sobre la señalización de la vía (118-119). Estos incluyen inhibidores del blanco de la rapamicina mamífera (mTOR) de la familia rapalog, de los análogos de la rapamicina, los lípidos éter (tales como perifosina y miltefosina), y los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), del HER2/ neu, del c-Kit, del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) y del BCR-ABL (119). Sin embargo, a excepción de los inhibidores del mTOR, que parecen actuar únicamente sobre la vía del PI3K, se desconoce si los desenlaces funcionales de estos medicamentos están relacionados con una inhibición de la vía del PI3K o con otros efectos. Dado que la vía del PI3K es importante para numerosas funciones celulares normales y, en particular, para la vía de señalización de la insulina, la mayor limitante para la implementación de medicamentos que inhiban esta vía, probablemente, será la identificación de blancos y fármacos que garanticen un índice terapéutico suficiente y confiable en la practica clínica (119).

Se desconoce si estos medicamentos podrán demostrar una actividad anti-tumoral de forma independiente o en combinación con otros agentes (120). En particular, debido a que la vía PI3K es un regulador crucial para la supervivencia durante estrés celular –y teniendo en cuenta que los tumores frecuentemente existen en ambientes intrínsecamente estresantes, con limitaciones en el suministro de oxigeno y de nutrientes, al igual que bajo pH– la inhibición de la vía PI3K probablemente pueda hallar una eficacia optima en combinación, con el fin de inducir estrés celular, incluyendo combinación con otros inhibidores de la señal de transducción y con quimioterapia o irradiación (119).

A medida que los inhibidores de la vía de PI3K sean integrados en la práctica clínica, será crucial desarrollar métodos para identificar a aquellos pacientes que se puedan beneficiar de estas terapias, desarrollando, paralelamente, marcadores moleculares y terapéuticas dirigidas (120). Esta aproximación maximizara la eficacia y costo-efectividad de estas nuevas terapias, y minimizara una innecesaria exposición de los pacientes (120). Esta aproximación fue muy exitosa con imatinib mesylate (Gleevec; Novartis), desarrollado para el tratamiento de leucemia mieloide crónica (CML), basado en que la CML es casi exclusivamente definida por la fusión del oncogén BCR-ABL. Posteriormente se encontró que el imatinib era altamente efectivo cuando actuaba sobre aberraciones genéticas en otras enfermedades tales como la activación mutacional de c-Kit en los tumores estromales gastrointestinales (GIST) y el PDGFR en dermatosarcoma protuberans y en el síndrome hipereosinofilico (120).

CONCLUSIONES

En las dos últimas décadas, la vía de señalización PI3K/Akt se ha establecido como un contribuidor critico en el proceso de tumorogenesis. La elucidación del rol de la vía de señalización en el crecimiento celular, la supervivencia y la proliferación ha abierto una puerta en el estudio de su regulación en el proceso tumoral. Componentes de la vía de señalización PI3K/Akt tienen compromisos emergentes como: nuevos blancos en el desarrollo de terapias en cáncer y la generación de inhibidores de la vía han mostrado ser efectivos, in vitro e in vivo, en la reducción del crecimiento tumoral. Se deberá continuar con esfuerzos para el desarrollo de inhibidores específicos, y con alta afinidad, para la vía PI3K/Akt, para generar un tratamiento efectivo para el cáncer en los seres humanos.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Instituto Nacional de Cancerología por su colaboración en el desarrollo de este articulo.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

CP y MCS realizaron la búsqueda y lectura revisada para el manuscrito. CP realizo el primer manuscrito. CP realizo los procedimientos para la solicitud del permiso al autor para la modificación y el uso de su material publicado, y genero las adaptaciones de las figuras y tablas del manuscrito. MLS contribuyo en la designación de los estudios y el concepto de cada uno de ellos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

CONFLICTOS DE INTERÉS

No declarados.

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