Determinación del polimorfismo C677T de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) en una población piloto de estudiantes de la Universidad del Rosario

Preliminary population study of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) C677T polymorphism determination in a pilot group of students from the University of Rosario

Zaniah N. González-Galofre¹, B.Sc., Victoria Villegas², M.Sc., María Martínez-Agüero², Ph.D.

1. Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, Bogotá, Colombia.
2. Universidad del Rosario, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Bogotá, Colombia. Correspondencia: maria.martinez@urosario.edu.co.

Recibido: 16 de febrero de 2010 • Aceptado: 24 de marzo de 2010

Resumen

Introducción: la 5, 10-metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) es una enzima clave en el metabolismo del folato; sus polimorfismos se han asociado al aumento de riesgo de padecer enfermedad coronaria, problemas obstétricos en mujeres gestantes, desarrollo de fetos con defectos de cierre del tubo neural y susceptibilidad a algunos tipos de cáncer. Este gen presenta una variación polimórfica de nucleótido único, que consiste en un cambio de C por T en la posición 677 el cual afecta de manera notable su actividad enzimática.

Objetivo: Dada la importancia de esta enzima y la heterogeneidad genética de la población colombiana se realizó un estudio para determinar las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo C677T de MTHFR en individuos sanos, debido a que en el país sólo se han realizado estudios que involucran metodología de casos y controles.

Materiales y métodos: Este polimorfismo se estudió a partir de ADN de una muestra poblacional de 206 estudiantes. Adicionalmente, se calcularon las frecuencias globales de Colombia utilizando los datos de controles sanos reportados en otros estudios.

Resultados: En la muestra evaluada se detectó un desequilibrio Hardy-Weinberg, mientras que en los datos globales colombianos se encontró que la población está en equilibrio. Conclusión: la frecuencia poblacional del alelo T parece estar sometida a una presión de selección positiva, dado su incremento en la población a pesar de su efecto deletéreo. Un estudio español reporta resultados similares y argumenta como causa probable de este cambio en la frecuencia alélica de T la suplementación con ácido fólico a futuras madres.

Palabras clave: ácido fólico, metilentetrahidrofolato reductasa, polimorfismo, frecuencia alélicas y génicas, equilibrio Hardy-Weinberg

Abstract

Introduction: the 5, 10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is an essential enzyme in folate metabolism; their polymorphisms have been associated with heart disease risk increase, obstetric problems, neural tube defects in fetuses and cancer susceptibility. This gene has a single nucleotide polymorphism, a C-T change at nucleotide 677, which affects significantly its enzymatic activity.

Objective: because of the biological importance of this enzyme and the Colombian population genetic heterogeneity characteristic, a study was performed to determine allele and genotype frequencies of MTHFR C677T polymorphism in healthy individuals, taking into account that in Colombia there are only studies that have involved case-control methodology.

Methods: we analyzed this polymorphism trough the amplification of the DNA of a 206 students sample population. Additionally, Colombian overall frequencies were calculated, using data from healthy controls reported in other studies.

Results: a Hardy-Weinberg disequilibrium was found in the sample tested. For the Colombian data, we found that the global population was in equilibrium.

Conclusion: T allele population frequency seems to be under positive selection pressure, which is reflected in the population allele increase, despite its deleterious effect. A Spanish study reported similar results and identified folic acid supplementation on expectant mothers as a probably cause of this change.

Keywords: folic acid, methylenetetrahydrofolate reductase, polymorphism, gene, genetic frequencies, Hardy-Weinberg equilibrium.

Introducción

El folato es la forma soluble de la vitamina B9. Entre los alimentos que la contienen están la lenteja, la arveja, la naranja, el brócoli, los espárragos y el hígado; en suplementos alimenticios se encuentra como ácido fólico, su forma sintética (1). La ingesta adecuada de folato es importante en diversos procesos vitales, entre ellos la síntesis, replicación y reparación del ADN, así como la biosíntesis de proteínas y otros procesos fundamentales para la viabilidad celular, por ejemplo la división y la homeóstasis (1-2), debido al papel esencial de sus coenzimas en la regeneración de metionina, oxidación y reducción de unidades de un único carbono requeridos para un metabolismo normal y regulado (2).

El suplemento de las coenzimas del folato in vivo requiere tanto de la cantidad y biodisponibilidad del folato ingerido como de su tasa de pérdida por vía catabólica, urinaria y fecal. Cuando se presentan ciclos de ingesta inadecuada, mala absorción o cambios bioquímicos asociados con un nivel inadecuado de folato, se generan anormalidades (2-5) que pueden ser asociadas a enfermedad coronaria y ciertos tipos de cáncer (3-7). También existen otros polimorfismos funcionales en los genes que codifican para las enzimas involucradas en su metabolismo que pueden llegar a influir en la susceptibilidad frente a estas patologías; por tal razón, los polimorfismos del gen de metilentetrahidrofolato reductasa se cuentan entre los más estudiados (3-5).

MTHFR y función

El gen codificante para esta enzima se encuentra ubicado en la región p36.3 del cromosoma 1. La secuencia complementaria de ADN tiene una longitud de 2,2 kb y 11 exones; el producto del gen es una proteína de aproximadamente 70 kDa (4). La enzima desempeña un papel fundamental en el metabolismo del folato, catalizando junto con otra serie de enzimas la conversión irreversible de 5,10-metilentetrahidrofolato a 5-metilentetrahidrofolato, la primera forma circulante del folato en el cuerpo (5), y un co-sustrato para la metilación de homocisteína a metionina. La actividad enzimática está bajo el control de los niveles intracelulares de S-Adenosil-Metionina (SAM), coenzima participante en la transferencia de grupos metilo, encontrándose una alta actividad relacionada con niveles elevados de SAM y una baja actividad con niveles intracelulares disminuidos (6). De esta manera se asegura que haya suficiente disponibilidad de folato tanto para la metilación de la homocisteína como para la metilación de dUMP (desoxi-uridinmonofosfato), intermediario en el metabolismo de los desoxirribonucleótidos, el cual es catalizado por la timidilato sintasa que también utiliza 5,10-metilentetrahidrofolato (5-6).

En 1995 se describió un cambio común de CT en la posición 677 del gen de MTHFR, que conduce a la sustitución de alanina por valina en el codón 222 de la proteína y que trae como consecuencia termolabilidad y baja actividad específica de la enzima. Desde entonces el genotipo homocigoto (677TT) ha sido relacionado con bajos niveles de folato en suero (7), homocisteína elevada en plasma (8-9), distribución alterada de distintos tipos de folato en las células (10) y aumento del riesgo de generar enfermedad coronaria (11) y varios tipos de cáncer (12).

Implicaciones

La función de la enzima puede llegar a influir en el riesgo de contraer cáncer, frecuentemente gástrico o de seno, de dos formas. En la primera, el 5,10-metilentetrahidrofolato, substrato de MTHFR, al estar involucrado en la conversión de dUMP a monofosfato de deoxitimidilato (dTMP), puede ocasionar el incremento de la relación de estos dos componentes, si se encuentra en niveles disminuidos, aumentando la tasa de incorporación al ADN de uracilo en vez de timina, incrementado así la probabilidad de aparición de mutaciones puntuales y rompimiento del ADN a nivel cromosómico (13).

La segunda está determinada por los niveles de SAM, un donante común de grupos metilo necesarios para el proceso de metilación del ADN. En este caso, cambios en la metilación modifican la conformación del ADN y la expresión de los genes [14]. Una forma menos activa de la enzima MTHFR supone bajos niveles de SAM, por ende hipometilación (15). De manera similar, la baja ingesta de folato puede determinar el riesgo de aparición de algunos tipos de cáncer, provocando una metilación aberrante en el ADN que resulta en una expresión alterada de proto-oncogenes y de genes de supresión tumoral (16-17).

En cuanto a la enfermedad coronaria, se han encontrado elevadas concentraciones de homocisteína en pacientes con enfermedad arterial (18) e hipertensión (19), esto sugiere que la homocisteína está involucrada en activación plaquetaria, híper coagulación, estrés oxidativo, disfunción endotelial y proliferación de células de músculo liso junto con oxidación y peroxidación de lípidos (20-22). Adicionalmente, una concentración elevada de homocisteína en pacientes hipertensos ha sido correlacionada con la presión arterial (23-26). Individuos escogidos aleatoriamente para llevar a cabo un tratamiento de reducción de la concentración de homocisteína mostraron una disminución en la presión sanguínea, hecho que evidencia tal la relación (18).

El folato también ha sido relacionado con defectos de tubo neural en bebés en etapa de gestación, que han producido patologías como anencefalia y espina bífida, además de influir en la aparición de cardiopatías congénitas, con mayor frecuencia la tetralogía de Fallot, comunicación interventricular y comunicación intraventricular (27).

Variantes genéticas

La mayoría de los genes que codifican para las enzimas involucradas en el metabolismo del folato son polimórficos (28). Con base en lo anterior, 29 mutaciones raras del gen para MTHFR, que resultan en una actividad enzimática considerablemente baja, han sido descritas en pacientes que padecen de homocistinuria (4), mientras que en individuos no homocistinúricos y considerados sanos se han encontrado dos polimorfismos funcionales frecuentes, cuyas variantes genotípicas son asociadas con bajos niveles de folato en plasma sanguíneo (3).

El primer polimorfismo corresponde a un cambio CT en el nucleótido 677 del exón 4 (C677T); el segundo, a un cambio AC en el nucleótido 1.298 del exón 7 (A1298C). Estos dos polimorfismos se localizan a 2,1 kb el uno del otro, y se ha investigado la asociación de estos polimorfismos con el riesgo de padecer las patologías mencionadas (4). Si bien estos polimorfismos se relacionan con bajos niveles de folato en plasma sanguíneo, el primero es más relevante. La actividad enzimática de los heterocigotos (CT) es del 65% y del 30% para los homocigotos (TT) con respecto al alelo mayor (CC) (3-4, 16). Diferentes investigaciones han asociado al genotipo MTHFR-TT con la hipometilación del ADN, particularmente en individuos con concentraciones reducidas de folato en plasma (29-32). Estudios realizados en distintas poblaciones del mundo muestran una alta asociación del polimorfismo C677T y la susceptibilidad de cáncer gástrico (5, 32-33), de seno (17, 34-36) y enfermedad coronaria (11, 18, 37).

Frecuencias poblacionales

Diferentes trabajos han mostrado la frecuencia del alelo T y su amplia variación en los rangos de frecuencias alélicas en poblaciones sanas, en estudios poblacionales (38-39) y en estudios de casos y controles en patologías como cáncer o cardiopatías (4-5, 37, 40-41).

La tabla 1 presenta algunos datos reportados en distintas regiones del mundo para este polimorfismo. En casos como China (42-43) o Estados Unidos (44), donde se muestrean las mismas poblaciones geográficas, se obtienen resultados muy diferentes. Esta frecuencia tiene valores entre el 1% en la población del sur oriente de la India (45) hasta el 57% en Linxian, China (43), con una frecuencia de homocigosidad que varía entre 0% (45, 44) hasta más del 30% en diferentes poblaciones de China (46, 47, 43). En Estados Unidos, en un estudio aplicado a diferentes grupos étnicos, Li y colaboradores han reportado la menor frecuencia del alelo T en la población afroamericana y la mayor en la población hispana (44).

En Colombia se han realizado previamente tres estudios (48-50), en los que se han analizado las frecuencias alélicas y genotípicas de este polimorfismo mediante la comparación de casos y controles. Los resultados han mostrado un comportamiento variable, incluso cuando se han muestreado personas de la misma región geográfica, como la población de Medellín, en el occidente del país (49-50).

Teniendo en cuenta la importancia de esta enzima y la heterogeneidad de las poblaciones estudiadas, se realizó un estudio para determinar las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo C677T de MTHFR en una muestra de individuos sanos colombianos compuesta por estudiantes de la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad del Rosario; adicionalmente, se compararon con los resultados obtenidos con otras poblaciones a nivel mundial.

Tabla 1. Frecuencias alélicas para el polimorfismo C677T reportadas para diferentes regiones del mundo en individuos sanos

Materiales y métodos

Estudio de tipo descriptivo diseñado para conocer las frecuencias alélicas y genotípicas de las dos variantes polimórficas del gen de interés en una muestra poblacional e integrado, pues combina resultados de tres estudios científicos realizados en Colombia.

Población muestreada

Para estimar el tamaño poblacional a evaluar a partir de los 436 estudiantes de primer a cuarto semestre de la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad del Rosario, se trabajó con un máximo de variabilidad para el alelo T de 0,5; un intervalo de confianza del 95% y un error del 5%, obteniendo un tamaño poblacional de muestreo de 204 estudiantes. Se tomó una muestra de 5 ml de sangre total para 206 estudiantes voluntarios. Los individuos incluidos fueron estudiantes sanos, de ambos sexos y mayores de edad con previa firma del consentimiento informado. No se estratificó por procedencia, grupo étnico o nivel socioeconómico.

Consideraciones éticas

El estudio fue realizado con previa aprobación del protocolo por parte del Comité de Ética de la Universidad del Rosario.

Extracción de ADN

El ADN genómico se aisló mediante la técnica de extracción de salting out (51). Una vez obtenido, se comprobó su calidad en gel de agarosa al 1%; posteriormente, se cuantificó y diluyó a una concentración de 25 ng/μl.

Amplificación de ADN y análisis de polimorfismos

Para el estudio del polimorfismo C677T de MTHFR se utilizó el método reportado por Frosst (52) y Weisberg (53) con modificaciones menores. Los primers: 5’ CGA AGC AGG GAG CTT TGA GGC TG 3’ y 5’ AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3’. La amplificación se realizó mediante una PCR convencional bajo las siguientes condiciones experimentales: 94 ºC 5 min; 35 ciclos (94 ºC 30 s, 62 ºC 45 s y 68 ºC 30 s) y finalmente 68 ºC 5 min. Se obtuvo un fragmento de 233 pb (figura 1), el cual fue digerido con la enzima TaqI durante 12 h a 37ºC, generando un fragmento de 233 pb para el homocigoto CC, un fragmento de 171 pb para el homocigoto TT y dos fragmentos de 233 y 171 pb para el heterocigoto CT (figura 2).

Figura 1. Fragmento de 233 pb correspondiente a la amplificación por PCR utilizando un marcador de peso de 50 pb

Figura 2. Fragmentos obtenidos a partir del corte con la enzima Taq I. a) Homocitogo TT 171 pb. b) Homocigoto CC 233 pb. c) Heterocigoto CT 233 pb y 171 pb.

Análisis estadístico

Se incluyeron en los análisis a 621 individuos colombianos, aparentemente sanos, reportados por estudios previos en Colombia (48-50). Se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas tanto para la población de estudiantes como para la población total (incluyendo los individuos sanos reportados por otros autores) y se realizó el análisis de ajuste al equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) en ambas muestras, utilizando test exactos con cadenas de Markov para estimar el valor exacto de p.

Resultados

En la amplificación por PCR se obtuvo un fragmento de 233 pb (figura 1), que al ser cortado con la enzima TaqI generó fragmentos de 233 pb para el homocigoto CC, un fragmento de 171 pb para el homocigoto TT y dos fragmentos de 233 y 171 pb para el heterocigoto CT (figura 2).

Se estimaron las frecuencias alélicas y genotípicas tanto para la población de 206 individuos aparentemente sanos (tabla 2) como para la población colombiana en general, al incluir los individuos de otros trabajos previamente reportados (tabla 3). En ambos casos se observó un exceso de homocigotos, que en el grupo de datos de estudiantes de la Universidad del Rosario generó una probabilidad significativa de no encontrarse en EHW (p=0,0001; s.d. <0,0000), con un índice de endogamia negativo y significativo (F IS =-0,2712). Para los 621 individuos de Colombia la probabilidad de no encontrarse en EHW (p=0,2468; s.d.=0,0043) no es significativa, con un índice de endogamia negativo, pero no significativo (F IS =-0,0480).

Tabla 2. Cálculos realizados para los 206 individuos aparentemente sanos muestreados (a)

Tabla 3. Cálculos realizados para los 621 individuos aparentemente sanos muestreados (a)

Se muestran las frecuencias del alelo T para individuos aparentemente sanos en diferentes poblaciones alrededor del mundo (tablas 4 y 5). La tabla 4 presenta algunas de las poblaciones cuyas frecuencias alélicas son estadísticamente diferentes a este trabajo; la tabla 5, poblaciones con frecuencias alélicas similares.

Tabla 4. Frecuencias alélicas reportadas para países con diferencias significativas frente a las frecuencias calculadas para la población muestreada

Tabla 5. Frecuencias alélicas reportadas para países con diferencias significativas frente a las frecuencias calculadas para la población muestreada

Discusión

Al comparar los resultados de frecuencias alélicas en la población de estudiantes (tabla 2) y de la población total colombiana (tabla 3), los valores obtenidos son muy similares, con menos del 1% de diferencia. Sin embargo, las estimas de ajuste al EHW indican que la población de estudiantes muestreada en este trabajo no se encuentra en EHW, contrario al análisis que incluye la totalidad de muestras colombianas.

Esto sugiere que existe la probabilidad, aunque reducida, de que una fuerza de selección esté favoreciendo a los heterocigotos en la población de estudiantes o que esté representando alguna situación que favorezca al alelo T lo cual se refleja en el alto número de heterocigotos.

La primera situación puede ser el cambio en el número total de individuos. Un tamaño de muestra más grande reduce el error de muestreo; por tanto, es posible que las poblaciones se ajusten mejor a los supuestos del equilibrio, al hacer este muestreo en una población con características más heterogéneas. Se destaca que las desviaciones al EHW por tamaños de muestreo se deben por lo general a un efecto Wahlund, según el cual el número de homocigotos aumenta debido a la subestructura críptica de la población (58-59). Esto suele solucionarse aumentando el número de individuos muestreados. Sin embargo, en este caso, el desequilibrio se observa por un exceso de heterocigotos; si bien la población es pequeña –206 individuos– y puede no representar de manera adecuada a la totalidad de la población colombiana, debe resaltarse que en ninguno de los estudios realizados en Colombia que fueron incluidos en este análisis (49-51) ni en otro estudio no incluido realizado en Bogotá con personas aparentemente sanas (60) se observa falta de EHW aun cuando los tamaños de muestra son menores o iguales al reportado por nosotros.

Otra situación se refiere a la enorme variabilidad del polimorfismo C677T en las diferentes poblaciones muestreadas en el mundo. Sus frecuencias alélicas han sido reportadas para el alelo T entre 0,01 (17) y 0,64 (4). Los datos obtenidos en este estudio para la población colombiana se sitúan en un punto intermedio similar al reportado para México, donde el polimorfismo es de 0,47 (33).

Si bien los valores de las frecuencias alélicas observadas en los dos grupos (tabla 1 y tabla 2) son similares, no ocurre lo mismo con la distribución de las frecuencias genotípicas. En este caso, los estudiantes presentan valores de heterocigotos mayores a los observados en la población general (más del 10%).

Si se tiene en cuenta que las presiones selectivas positivas sobre alelos deletéreos son poco frecuentes, existe la posibilidad de que la población de estudiantes se esté comportando de manera similar a la que analizaron el grupo de Mayor-Olea y colaboradores (38) en España.

Estos investigadores trabajaron con una población española de diferentes rangos de edad, verificando en cada uno de ellos las frecuencias del polimorfismo C667T MTHFR; encontraron que los nacidos después de 1976 presentaban un comportamiento en las frecuencias diferente a la de los nacidos en el período 1900-1975. Los autores atribuyen este cambio en las frecuencias alélicas, representada por un aumento en el número de individuos que portan el alelo T, a la suplementación con ácido fólico durante el período gestacional, incluida en el sistema de salud español durante la década de 1970 (38).

Los resultados presentados en las tablas 4 y 5 indican que no existe una distribución zonal que permita afirmar que las poblaciones se comportan igual en las distintas regiones del mundo. Asimismo, se evidencia la enorme variabilidad del polimorfismo, al observarse que es posible encontrar frecuencias del alelo T bastante diferentes en un mismo país, como en China (46) y Colombia (49, 50), donde la población muestreada es la misma.

Los interrogantes biológicos a partir de los resultados de este estudio indican que es necesario considerar proyectos futuros que permitan darles solución. Para esto sería pertinente realizar otro estudio con dos nuevos grupos poblacionales: mayores de cuarenta años y niños menores de edad. Así, si la hipótesis presentada por el grupo español (38) es correcta, la primera muestra se encontraría en EHW y la segunda en desequilibrio; esto confirmaría que la ingesta de ácido fólico por parte de madres gestantes está influenciando la frecuencia genética del alelo T. Si se llegase a observar que en la población de niños los alelos se encuentran en EHW, entonces se analizaría un posible proceso de exogamia sobre la muestra de estudiantes.

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