Doi: http://dx.doi.org/10.12804/revsalud12.03.2014.08

Avaliação da atividade antioxidante e citoprotetora dos extratos de Eugenia uniflora Lineau e Psidium sobraleanum Proença & landrum contra metais pesados

Evaluación de la actividad citoprotectora y antioxidante de los extractos de Eugenia uniflora Lineau e Psidium sobraleanum Proença & Landrum contra metales pesados

Evaluation of the Cytoprotective and Antioxidant Activity of the Extracts of Eugenia Uniflora Lineau e Psidium Sobraleanum Proença & Landrum Against Heavy Metals

Celestina E. Sobral-Souza MSc,¹ Nadghia F. Leite MSc,¹ Francisco A. B. Cunha PhD,¹ Antonio I. Pinho PhD,¹ José G. M. Costa PhD,¹ Henrique D. M. Coutinho PhD¹

¹ Universidade Regional do Cariri - URCA, Crato (CE), Brasil. Correspondencia: hdmcoutinho@gmail.com

Recibido: 2 de octubre de 2013 • Aceptado: 10 de junio de 2014

Para citar este artículo: Sobral-Souza CE, Leite NF, Cunha FAB, Pinho AI, Costa JGM, Coutinho HDM. Avaliação da atividade antioxidante e citoprotetora dos extratos de Eugenia uniflora Lineau e Psidium sobraleanum Proença & Landrum contra metais pesados. Rev Cienc Salud. 2014;12(3): 401-9. doi: dx.doi.org/10.12804/revsalud12.03.2014.08

Resumo

Objetivo: Estudos recentes apontam a utilização de plantas na forma de sucos ou chás como fontes de agentes antioxidantes naturais que apresentam baixo risco podendo ser utilizado no auxílio do tratamento de várias doenças. Materiais e métodos: Neste contexto, avaliaram-se os potenciais antioxidantes, in vitro, dos extratos de Eugenia uniflora e Psidium sobraleanum, além de quantificar fenóis e flavonoides presentes nos extratos. Resultados: De acordo com os resultados obtidos, observou-se uma melhor atividade antioxidante para o extrato de Eugenia uniflora, para o teste de TBARS com fosfolipídio de ovo, os extratos reduziram os níveis basais no processo de peroxidação lipídica, e quando induzidos por Fe^{2+ o} extrato de Psidium sobraleanum mostrouse mais eficiente. Conclusões: Portanto, através destes ensaios pode-se verificar que os extratos das folhas das espécies, Eugenia uniflora e Psidium sobraleanum, apresentam uma atividade antioxidante, diretamente relacionada com substâncias fenólicas produzidas a partir do seu metabolismo secundário.

Palavras-chave: Peroxidação lipídica, compostos fenólicos, sulfato de ferro, produto natural.

Resumen

Objetivo: Estudios recientes reportan la utilización de plantas en forma de zumos o té como fuente de agentes antioxidantes naturales que presentan bajo riesgo, pudiendo ser utilizados como complemento del tratamiento de diversas enfermedades. Materiales y métodos: En este contexto, se evaluarán in vitro, los potenciales antioxidantes, de los extractos de Eugenia uniflora y Psidium sobraleanum, además de cuantificar fenoles y flavonoides presentes en los extractos. Resultados: De acuerdo con los resultados obtenidos, se observó una mejor actividad antioxidante con el extracto de Eugenia uniflora, en el test de TBARS con fofolípidos de huevo, los extractos redujeron los niveles basales en el proceso de peroxidación lipídica; y cuando fue inducida con Fe⁺², el extracto de Psidium sobraleanum se mostró más eficiente. Conclusiones: Por lo tanto, a través de estos ensayos se pudo comprobar que los extractos de las hojas de las especies Eugenia uniflora y Psidium sobraleanum presentan actividad antioxidante, directamente relacionada con sustancias fenólicas producidas a partir de sus metabolitos secundarios.

Palabras clave: Peroxidación lipídica, compuestos fenólicos, sulfato de hierro, producto natural.

Abstract

Objective: Evaluation of antioxidant activity has been an important issue considering its importance in human health. Recent studies show that the use of plants in the form of juices or teas as sources of natural antioxidants with low risk can be used as an aid to the treatment of various diseases. Material and Methods: Evaluation of the antioxidant potential in vitro, extracts of Eugenia uniflora and Psidium sobraleanum, as well as the quantification of phenols and flavonoids present in the extracts. Results: Findings showed a better antioxidant activity for the extract of Eugenia uniflora. In the TBARS test with egg phospholipids, extracts presented a reduction in the basal levels in the lipid peroxidation process; and when the Fe2 + extract was inducted, Psidium sobraleanum proved to be more efficient.. Conclusions: These tests proved that the extracts of leaves of the species Eugenia uniflora and Psidium sobraleanum present antioxidant activity which is directly related to phenolic substances produced in its secondary metabolism.

Key Words: Lipid Peroxidation, Phenolic Compounds, Iron Sulfate, Natural Products.

Introdução

A avaliação da atividade antioxidante tem sido uma questão importante considerando sua importância sobre a saúde humana. Estudos recentes apontam a utilização de plantas na forma de sucos ou chás como fontes de agentes antioxidantes naturais que apresentam baixo risco podendo ser utilizado no auxílio do tratamento de várias doenças (1).

Para além de doenças crônicas, o estresse oxidativo também pode desempenhar um papel fundamental na hepatotoxicidade aguda de vários fármacos, incluindo o analgésico utilizado mundialmente e antipirético paracetamol (2). Estudos têm mostrado que a utilização de compostos polifenólicos encontrados no chá, frutas e vegetais está associada com um risco baixo de tais doenças (3). Consequentemente, existe uma grande quantidade de interesse em plantas comestíveis que contêm antioxidantes e de promoção da saúde fitoquímicos como potenciais agentes terapêuticos (4).

O malondialdeído MDA foi o foco de atenção da peroxidação lipídica durante muitos anos, pelo fato de poder ser medido livre, utilizando-se o ácido tiobarbitúrico (TBA). O MDA reage com TBA e forma um cromógeno de cor rosa fluorescente, cuja absorção ocorre em λde 532 nm e fluorescência em 553 nm (5).

Plantas medicinais possuem diversos compostos químicos com potencial antioxidante. Dentre as classes com essa propriedade, os compostos fenólicos têm recebido muita atenção, sobretudo por apresentarem comprovada atividade de inibição da peroxidação lipídica e da lipoxigenase in vitro (6, 7).

A espécie Eugenia uniflora, conhecida no Brasil como pitanga é uma planta arbórea da família Myrtaceae presente em todo o país. Além da sua atividade antimicrobiana, apresenta inúmeras atividades biológicas, como: antioxidante (8), hipotensor, anti-hipertensivo e diurético (9). Diversos fitoconstituintes de E. uniflora já foram isolados como os flavonoides, miricitrina, quercetina e o ramnosídio 3- quercitrina, além de esteróides, compostos mono e triterpenóides, taninos, antraquinonas, fenóis, cineol e óleos essenciais (10, 11).

O gênero Psidium se destaca por apresentar espécies com grande potencial terapêutico e diversas atividades biológicas e farmacológicas, dentre elas: atividade antioxidante, hepatoprotetora, antitumoral, antimicrobiana, anti-inflamatória, e anticestodea (12, 13-19). A espécie Psidium sobraleanum Proenca Landrum, é conhecida popularmente como araçá de veado e está presente na região da Chapada do Araripe, no estado do Ceará. O óleo essencial apresenta, dentre outros constituintes, 1,8-cineol, α-pineno β-pineno, acetato de mentila, α-cadinol, globulol, elemol. O óleo apresentou atividade antimicrobiana (14).

Este trabalho teve como objetivo verificar os potenciais antioxidantes, in vitro, dos extratos de Eugenia uniflora e Psidium sobraleanum por DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) e TBARS (Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico) e quantificar fenóis e flavonoides presentes nos extratos como forma de demonstrar o potencial protetor destes produtos naturais contra os efeitos tóxicos de metais pesados.

Materiais e métodos

Material vegetal As folhas de Psidium sobraleanum foram coletadas na fazenda Barreiro Grande, na Chapada do Araripe, município de Crato, Ceará. As folhas de Eugenia uniflora foram coletadas no Horto Botânico de Plantas Medicinais do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN), da Universidade Regional do Cariri (URCA).

Preparação do extrato

O extrato de Eugenia uniflora foi preparado por imersão utilizando 600 g de folhas frescas em etanol durante 72 horas à temperatura ambiente e 308 g de folhas frescas de Psidium sobraleanum submersas em etanol e água (1:1) durante 72 horas à temperatura ambiente. As soluções foram filtradas e concentradas utilizando um evaporador rotativo de vácuo (modelo Q-344B-Quimis, Brasil) e banho de água quente (modelo Q214M2-Quimis Brasil). O extrato bruto de Eugenia uniflora e Psidium sobraleanum, obtiveram um rendimento de 6,31 g e 49,2 g, respectivamente.

Quantificação de Fenóis totais A quantidade de fenóis totais, foi determinada adicionando-se 200 µL da solução dos extratos (300, 100, 50 e 25 µg/mL em etanol 99,6%) a 1 mL de reagente de Folin-Ciocalteau (10 % v/v) sendo agitada por 1 minuto. Em seguida acrescentou-se 800 µL de carbonato de sódio 7,5 %, sendo a amostra homogeneizada por 30 segundos. Após 1 hora foi medida a absorbância em espectrofotômetro com comprimento de onda ajustado para 765 nm. O branco foi determinado com todos os reagentes, porém o extrato foi substituído por água destilada. O teste foi realizado em triplicata. A média das três leituras foi usada para determinar os fenóis totais, expressos como miligramas equivalentes de ácido gálico/ grama de extrato, interpolando este valor na curva de calibração construída com os padrões de ácido gálico. A curva de calibração de ácido gálico foi determinada utilizando diferentes concentrações desta substância (300, 100, 75, 25 e 10 µg/mL).

Quantificação de Flavonóides

Foram preparadas soluções do extrato (300, 200, 100 e 50 µg/mL) e utilizado 1 mL destas adicionando-se 1 mL cloreto de alumínio (AlCl₃) com contração de 2 % peso/volume. No tubo que foi determinado como branco, o volume adicionado de cloreto de alumínio foi substituído por água destilada. Após 30 minutos de incubação a temperatura ambiente, a absorbância foi medida no filtro de 415 nm. O teste foi feito em triplicata, resultando assim na utilização da média para determinação da quantidade de flavonóides totais e expresso como miligramas de quercetina equivalentes/grama de extrato.A curva de calibração da quercetina foi determinada utilizando diferentes concentrações desta substância (400, 300, 200, 100, 50, 25 e 10 µg/mL) diluída em etanol 99,6%.

Atividade antioxidante por DPPH

Foram preparadas soluções com diferentes concentrações de cada extrato de Psidium sobraleanum e Eugenia uniflora (250, 125, 50, 25, 10 e 5 µg/mL) em triplicata. Em um tubo foram misturados 100 µL da solução do extrato e 3,9 mL de solução de 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) 0,06 mM e homogenizado com agitador de tubos, procedimento realizado em ambiente escuro. Para o branco, a amostra foi substituída por 100 µL de metanol. As leituras foram realizadas utilizando um filtro de comprimento de onda de 520 nm e repetidas a cada minuto até que foi observada a estabilização da leitura.

A curva padrão foi determinada realizando leituras no mesmo comprimento de onda (515 nm), porém com soluções de DPPH em diferentes concentrações (10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM e 60 μM), sendo o branco determinado por metanol (20).

Atividade antioxidante por TBAR A produção de TBARS (Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico) de fosfolípido foi determinada usando o método de Ohkawa, et al, com modificações (21). Foi preparada uma solução de vitelo da espécie Gallus gallus L., misturada com uma solução de hexano-isoprapanol (3:2). Essa solução foi filtrada e rotaevaporada até a obtenção de resíduo sólido. Para ensaio TBARS solubilizou-se 0,05g do resíduo em 10 mL de água mili-Q. Para pré-incubação foi utilizado 100 µL de fosfolipídio, 50 µL de ex-trato nas concentrações de 100, 40, 10 e 4 µg/ mL juntamente com um volume adequado de água deionizada. As amostras foram repetidas adicionando 14 µL de Fe (60 µM) e incubadas a 37 ºC, durante 1 h. Após a pré incubação foi adicionado 500 µL de tampão ácido acético e 500 µL de TBA (ácido tiobarbitúrico) 0,6% e incubado por 1h a uma temperatura de 100 ºC. Os tubos foram adicionados 2 mL de n-butanol e a mistura centrifugada. O sobrenadante foi retirado e a absorbância foi lida a 532 nm num espectrofotômetro.

Para a curva de MDA (malonaldialdeído) foi utilizada 500 µL de ácido acético, 500 µL de TBA (0,6%), MDA nas concentrações de 50, 100, 150, 200 µL e volume adequado de água destilada para completar um volume de 1,5 mL. Os testes fora feitos em triplicata e repetido duas vezes.

Avaliação do potencial citoprotetor do produto natural EEFEU e EHFPS contra metais pesados

De acordo com Coutinho et al, modificado, as concentrações inibitórias mínimas (CIM) do EEFEU e EHFPS, foram determinados pelo ensaio de microdiluição usando suspensões de 105 UFC/mL em solução salina e extratos na concentração inicial de 1024 µg/mL (22).A CIM foi definida como a concentração mais baixa à qual não foi observado crescimento. Para a avaliação do efeito protetor EEFEU e EHFPS ao metal pesado, foi realizada uma modulação utilizando concentrações sub-inibitórias dos extratos, suspensões de 105 UFC/mL de Escherichia coli ATTC 11105 e Candida albicans 62 em meio M9 Tris com 2% de glicose e uma de concentração do sulfato de ferro II variando de 100 mM a 0,0488 Mm. As placas de microdiluição foram incubadas por 48 h a 37 °C.A concentração bactericida mínima (CBM) e concentração fungicida mínima (CFM) foram determinadas como a menor concentração capaz de inibir o crescimento dos microrganismos.

Análise estatística Os resultados dos testes foram feitos em triplicata e expressos como média. Para análise estatística foi aplicada a Anova seguida do teste de Tukey. Um p ˂ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

O extrato das folhas P. sobraleanum possui alto teor de polifenóis (417,48 mg/g) quando comparado com o extrato das folhas de E. uniflora (75,65 mg/g). Já em relação à quantidade de flavonóides o extrato de E. uniflora (42,46 mg/g) obteve um maior valor se comparado com P. sobraleanum (12,54 mg/g) (tabela 1).

A determinação de fenóis totais ou compostos fenólicos é a determinação de flavonóides, tocoferóis e ácidos fenólicos juntos, que são antioxidantes naturais (23). Segundo Ratty e Das, já foram relatados em alguns trabalhos os efeitos dos flavonoides sobre os sistemas biológicos e, dentre eles: capacidade antioxidativa (24); atividades anti-inflamatórias e de efeito vaso-dilatador; ação antialérgica; atividade contra o desenvolvimento de tumores, antihepatotóxica, antiulcerogênica; atuação antiplaquetária, bem como ações antimicrobianas e antivirais.

A inibição do processo de peroxidação lipídica utilizando fosfolipídio de ovo apresentou indício de redução quanto aos níveis basais para os extratos das folhas, esta redução não foi considerada significativa para EEFEU. Foi observada inibição significativa para o EHFPS em todas as concentrações utilizadas tendo como melhor resultado as concentrações de 40 μg/ mL e 10 μg/ mL, quando o estresse oxidativo foi induzido com auxilio de Fe2+ (figura 1).

Existe uma forte correlação entre as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) como um marcador de peroxidação lipídica e os produtos que refletem o dano oxidativo ao DNA (25). Aumento do stresse oxidativo induzido por sulfato de ferro (II) na formação de TBARS, em comparação com o normal, sugerem um possível dano de tecidos com uma sobrecarga de ferro (26).

Sabir e Rocha determinaram a atividade antioxidante de Phyllanthus niruri (Euforbiaceae), utilizando diversas metodologias, entre elas,TBARS com fosfolipídio de ovo, nesse estudo foi induzido estresse oxidativo com ferro e nitroprussiato de sódio separadamente (27). Nas duas situações foram observadas reduções significativas da produção de malondialdeído (MDA) (p > 0,05) na concentração de 100 μg/ mL de extratos aquosos e metanólicos, sendo que os melhores resultados foram observados em relação ao ferro.

O ensaio utilizando DPPH avalia a capacidade sequestrante de radicais livres da amostra analisada. O radical livre DPPH é relativamente estável e sua ação sequestrante deve-se à abstração de um radical hidrogênio de compostos presentes nos extratos e frações, geralmente fenólicos (28). Magina et al, demonstraram que extratos etanólicos e frações hexanicas, diclorometano, acetato de etila, n-butanol e aquosa principalmente das folhas, de espécies de Eugenia testadas apresentam uma atividade antioxidante bastante eficaz (29).

A atividade antioxidante foi mensurada com o método do DPPH e o resultado expresso em um valor de CE50 185,47 μg/mL e 305,10 μg/ mL, para a E. uniflora e P. sobraleanum, respectivamente (tabela 2). Com os dados obtidos no teste de TBARS, foi possível determinar a concentração letal média (CL50) de 19,16 mg/ mL para EEFEU e de 75,67 mg/mL para EHFPS e de 100,10 mg/mL para EEFEU e de 80,45 mg/ mL para EHFPS. Quanto mais baixo for o valor da CL50 e da CE50, maior é a potência antioxidante. Nesse contexto, o EEFEU, mostra-se mais efetivo quando comparado ao EHFPS, que pode está relacionada à elevada presença de flavonoides.

Os resultados obtidos evidenciaram que os microrganismos conseguiram resistir ao sulfato de ferro II em todas as concentrações utilizadas. O mesmo resultado foi visto no teste de citroproteção onde foram testados as concentrações de sulfato de ferro II em conjunto com os extratos de EEFEU e EHFPS. Com isso, a presença dos extratos não mostrou atividade citoprotetora in vitro, visto que não alterou o perfil de sobrevivência das cepas bacterianas nos ensaios empregados.

Nas células eucarióticas e em grande parte de células procarióticas, o ferro é particularmente necessário para a sobrevivência e propagação, tal como um membro de um grupo diverso de hemoproteínas que inclui proteínas envolvidas no transporte de oxigénio e de armazenamento (hemoglobina e mioglobina), a transferência de elétrons (citocromos) e síntese de DNA (ribonucleótido-redutase) (30).

Conclusão

Observou-se através da captura do radical livre DPPH, uma melhor atividade antioxidante no extrato de E. uniflora. Para o teste de TBARS, os extratos reduziram os níveis basais no processo de peroxidação lipídica, e quando induzidos por Fe2+, mas o extrato de P. sobraleanum mostrou-se mais eficiente. Portanto, através destes ensaios pode-se verificar que os extratos das folhas das espécies, Eugenia uniflora e Psidium sobraelanum, apresentam uma atividade antioxidante, diretamente relacionada com substâncias fenólicas produzidas.

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