Introducción

El complejo Mycobacterium abscessus pertenece a las micobacterias de crecimiento rápido (MCR) que se encuentran ampliamente distribuidas en el suelo y en el agua. En el 2011, el grupo M. abscessus fue subdivido en dos subespecies denominadas M. abscessus subsp. abscessus y M. abscessus subsp. bolletii. Sin embargo, recientemente análisis genéticos sugieren reorganizar taxonómicamente el grupo M. abscessus en tres genomoespecies: M. abscessus, M. massiliense y M. bolletii^1-5.

Desde el punto de vista clínico y epidemiológico, los miembros del complejo M. abscessus son considerados patógenos oportunistas emergentes que pueden causar infecciones pulmonares crónicas, de piel y tejidos blandos, huesos y articulaciones. Además, existen numerosos reportes donde estas microbacterias están involucradas en infecciones asociadas a traumas, cirugías y otros procedimientos como acupuntura, liposucción, mesoterapias, implantación de prótesis mamarias, entre otras. En Venezuela, se han registrado infecciones de piel y tejido blando asociadas con procesos cosméticos causadas por estos microorganismos ^1,2,6-9.

El complejo M. abscessus se destaca por su elevada resistencia a los quimioterápicos antituberculosos y a la mayoría de los agentes antimicrobianos. Esta característica es principalmente atribuida a la estructura compleja e hidrofóbica de la pared celular y a la presencia de determinantes genéticos que codifican para diversos mecanismos de resistencia. Debido a esto, sería de utilidad realizar la prueba de susceptibilidad antimicrobiana como herramienta de orientación para el tratamiento. El método de microdilución en caldo (MDC), procedimiento de referencia recomendado por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), se realiza en microplacas con caldo de Müeller-Hinton ajustado catiónicamente. Los antimicrobianos que se sugieren ensayar son: macrólidos, aminoglucósidos, fluoroquinolonas, cefoxitina, imipenem, linezolid, tigeciclina, doxiciclina, minociclina y trimetoprima-sulfametoxazol. Las lecturas del MDC se realizan macroscópicamente determinando si hay o no crecimiento bacteriano dado por la presencia o ausencia de turbidez, respectivamente. Sin embargo, esta particularidad del método representa una desventaja, ya que el desarrollo de MCR no se realiza de manera homogénea, lo cual dificulta la interpretación objetiva de la prueba. En consecuencia, han surgido como una alternativa los métodos colorimétricos, que incorporan indicadores de pH u óxido-reducción, los cuales permiten evidenciar fácilmente la presencia o no del crecimiento bacteriano mediante un cambio de color en el medio de cultivo. Uno de los indicadores de concentración de O₂ más utilizado es la resazurina, una oxazona que en estado oxidado es de color azul y por acción de las oxidorreductasas producidas por las bacterias viables es reducida de forma irreversible a resorufina, un compuesto de color fucsia. Así, los microorganismos sensibles que son inhibidos por los antibióticos no producirán el viraje del indicador, manteniéndose la resazurina en su estado oxidado (azul). El micrométodo colorimétrico (MMC) ha sido ampliamente utilizado para determinar la susceptibilidad antimicrobiana por concentración inhibitoria mínima (CIM) en M. tuberculosis, pero su uso en MCR no ha sido estandarizado ^{2,10-12,13-17}.

El tratamiento de las infecciones producidas por MCR no está claramente establecido y, por lo general, difiere de las conductas terapéuticas de otras microbacteriosis, así como de la indicada en los casos de tuberculosis. Por otra parte, las distintas especies que conforman el complejo M. abscessus fenotípicamente presentan perfiles de susceptibilidad variable a los antimicrobianos de uso habitual en la práctica clínica. Por consiguiente, existe la necesidad de caracterizar correctamente cada aislamiento clínico y realizar estudios de susceptibilidad en todos los casos con el fin de orientar la elección del antibiótico y monitorear la aparición de mutantes resistentes durante el tratamiento, lo cual puede ocurrir durante la terapia prolongada ^{1, 2,10}.

Con base en lo descrito, los objetivos de este estudio fueron comparar las CIM obtenidas mediantes los métodos cuantitativos MMC y MDC en especies del complejo M. abscessus de origen clínico, establecer los puntos de corte empleados en el MMC y determinar la susceptibilidad antimicrobiana.

Materiales y métodos

Resultados

La CIM fue determinada en 19 cepas del complejo M. abscessus contra ocho antibióticos (tabla 2), encontrando que los intervalos generales de inhibición para los antibióticos ensayados se ubicaron entre 2 a 32 μg/mL por ambos métodos (MMC y MDC), excepto para SAM y AMX cuyos valores de CIM fueron superiores a 128 μg/mL y 512 μg/mL, respectivamente. Por otra parte, en la tabla 3 se muestra la diferencia significativa entre los resultados obtenidos empleando los dos métodos para cada antibiótico, mediante la estimación de la diferencia del promedio de las CIM y los intervalos de confianza. El análisis permitió evidenciar que los valores de las CIM, conseguidos en cada una de las técnicas, para el 50% de los antibióticos ensayados tuvieron diferencias significativas, obteniendo una confiabilidad del 95%. El punto de corte óptimo fue calculado para los ocho antibióticos probados (tabla 3). El porcentaje de sensibilidad osciló entre el 14 y el 100%, la especificidad entre el 33 y el 83%, mientras que la precisión varió entre 26 y 100%.

Los resultados de la interpretación de las pruebas de susceptibilidad por el método MDC de las 19 cepas del complejo M. abscessus se muestran en la tabla 4. Todas las cepas fueron sensibles a la AK, y resistentes al MEM y SAM. M. bolletii fue la especie que demostró la más amplia resistencia, siendo inhibida por un solo antibiótico (AK); de los nueve ensayados la sensibilidad intermedia solo fue observada con el IMP. Adicionalmente, se evidenció una pobre o nula actividad frente a las fluoroquinolonas y al linezolid sobre la colección de las cepas en estudio, oscilando los porcentajes de resistencia entre 35 y 100%.

Discusión

El tratamiento farmacológico de las enfermedades producidas por MCR es prolongado, costoso e incluye drogas con toxicidad generalmente mayor que los antibióticos de primera línea empleados en el tratamiento de la tuberculosis. En muchos casos la falla en la terapia antimicrobiana se debe a la elevada resistencia que presentan muchas de sus especies a los antituberculosos convencionales. Particularmente, los miembros del complejo M. absces-sus presentan patrones de sensibilidad variable, razón por la cual se sugiere la identificación precisa de cada aislado clínico y la realización de pruebas de susceptibilidad in vitro. En vista de que no hay un consenso sobre las conductas terapéuticas para el manejo de las infecciones por MCR, las pruebas de susceptibilidad constituyen una herramienta necesaria para la orientación y el apoyo al decidir la antibióticoterapia más adecuada y eficaz según las características clínicas y epidemiológicas de cada caso ^2,10,23.

En la actualidad, la técnica de MDC es considerada el procedimiento de referencia para determinar la sensibilidad de las MCR, siguiendo las recomendaciones del CLSI. Cuando un método diferente se postula para su implementación en los laboratorios clínicos, como ocurre en el caso de MMC, es necesario evaluar y demostrar si este funciona apropiadamente y si los resultados obtenidos son comparables con el método de referencia. Basándonos en los resultados obtenidos, se pudo evidenciar que el 50% de los antibióticos ensayados mostraron diferencias significativas entre ambos métodos. Probablemente, esta discrepancia en los resultados registrados para la CIM en el MDC y MMC se deba a diferencias en algunos parámetros técnicos de cada procedimiento, tales como: composición del medio de cultivo que cada método utiliza, concentración del inóculo, presencia o no de un indicador de crecimiento bacteriano y temperatura de incubación. En un estudio similar, Lavollay et al. compararon los resultados obtenidos de CIM en 43 aislados clínicos de M. abscessus con el método MDC utilizando dos medios de cultivo: caldo M7H9 suplementado OADC (10%)-tween-80 (0,05% v/v) y caldo Müeller-Hinton ajustado con cationes, encontrando diferencias estadísticamente significativas (p < 10^-4, U-test Mann-Whitney) para IMP y FOX. Estos autores atribuyen dichas diferencias principalmente a la presencia del tween-80 en uno de los medios de cultivo utilizado, ya que este componente puede alterar la permeabilidad de la pared celular por su acción detergente y producir en las cepas estudiadas una falsa susceptibilidad a los antibióticos. Por el contrario, Li et al. sugieren que las pruebas de susceptibilidad realizadas a partir de micrométodos basados en caldo, como el desarrollado en placas de 96 pocillos con alamar azul, son comparables con el propuesto por el CLSI ^14,24-26.

Aunque algunos autores refieren que el MMC es un procedimiento confiable y de alta reproducibilidad para la determinación de la CIM de drogas antituberculosas en M. tuberculosis, en este estudio no fue apropiado extrapolar los criterios de interpretación del CLSI para calificar los datos arrojados por el MMC, por lo que fue necesario determinar los puntos de corte para cada antibiótico. Según los resultados obtenidos, se puede afirmar que, en este estudio, la confiabilidad del MMC para discriminar las cepas como verdaderamente sensibles o resistentes fue limitada. Los resultados obtenidos sugieren incrementar el número de cepas a estudiar, no solo de M. abscessus sino incorporando aquellas MCR de importancia y aislamiento clínico a fin de considerar una estandarización adecuada y una futura implementación en los laboratorios de diagnóstico ^15-16.

La interpretación de las pruebas de susceptibilidad demostró que todas las cepas fueron sensibles a la AK al igual que en varios reportes previos. Sin embargo, Lee et al. encuentran una resistencia variable dependiendo de la especie: 6,03%, 12,38% y 100% para M. massi-liense, M. abscessus y M. bolletii, respectivamente. En este estudio, 8 de las 14 cepas (57%) de M. abscessus fueron inhibidas por IMP. Por el contrario, Heidarieh et al. hallaron una sensibilidad para este antibiótico menor al 20% en cepas M. abscessus aisladas en varias regiones de Irán ^10,27-30.

Por otra parte, publicaciones previas muestran que las especies del complejo M. abscessus expresan una resistencia a FOX que oscila entre 1-7%, lo cual difiere con nuestros resultados, cuyo valor fue > 20%. Esta discrepancia puede explicarse por la diferencia en la proporción de las cepas incluidas en los estudios, así como a las variaciones en los patrones de susceptibilidad según las regiones geográficas ^23,24,29.

En China, las fluoroquinolonas (LVX y CIP) son un grupo de antibióticos comúnmente utilizados para el tratamiento de infecciones producidas por microbacterias no tuberculosas. No obstante, en este estudio la proporción de M. abscessus resistentes a estos antibióticos fue del 86% (12/14), 67% (2/3) en M. massiliense y 100% (2/2) en M. bolletii. Las posibles razones de esta alta resistencia pueden ser atribuidas al uso excesivo de LVX y CIP en la práctica clínica para otras enfermedades infecciosas, lo cual conlleva a una presión selectiva que resulta en la emergencia de mecanismos de resistencia, o que algunos aislados clínicos del complejo M. abscessus pueden ser naturalmente resistentes a estas fluoroquinolonas ²³.

Linezolid y moxifloxacina son antibióticos que muestran elevada susceptibilidad in vitro contra M. abscessus. Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio demuestran una débil actividad sobre las cepas estudiadas, la cual difiere de los resultados reportados en otros trabajos. Es probable que estas diferencias obedezcan a una dinámica epidemiológica local determinada por el origen de la cepa, la presión selectiva de los antibióticos en el momento de la recuperación de la cepa, así como todos aquellos factores que de alguna manera pudieran intervenir en la triada hospedero, microorganismo y ambiente ^{10,13,23,26,28,29}.

Los resultados obtenidos demostraron variaciones importantes de la susceptibilidad a los antibióticos entre las diferentes especies del complejo M. abscessus. Por lo tanto, se sugiere precisar la identificación de los aislados clínicos y realizar las pruebas de susceptibilidad como una herramienta ideal para orientar y optimizar las conductas terapéuticas en infecciones producidas por MCR. Por otra parte, a pesar de que una de las limitantes de este trabajo fue el bajo número de cepas analizadas, el MMC podría tener un valor potencial para evaluar la susceptibilidad de cepas de M. abscessus.