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Introducción
Guillaume Benjamin Amand Duchenne, por quien la distrofia muscular de Duchenne (DMD) recibe su nombre, fue uno de los pioneros en el reporte y descripción de la DMD 1-5. Con posterioridad a la descripción fenotípica de la enfermedad, realizó la primera biopsia de tejidos profundos en un paciente vivo con estudio electrofisiológico 6-12. Ello le permitió describir los hallazgos patológicos de la enfermedad, especialmente el daño muscular que la caracteriza 13.
Posteriormente, sir William Richard Gowers describió la ausencia de reflejos patelares en los pacientes con DMD y la propensión a la afectación de ciertos músculos como resultado de la enfermedad (gastrocnemios, cuádriceps, glúteos y, con menor frecuencia, tríceps y bíceps), con una debilidad mayor en los flexores y extensores de la cadera y el cuádriceps 13. Igualmente, describió lo que se conoce hoy como el signo de Gowers10,14,15, que es una forma particular como estos pacientes se levantan del piso. Así mismo, describió en los reportes de las biopsias en estos pacientes la presencia de un tumor graso o una masa de tejido adiposo13,16, que determinan la presencia de cambios musculares secundarios a un cambio fibroso, por un sobrecrecimiento del tejido conectivo del músculo y no una atrofia del músculo como se pensaba 13.
La DMD se debe a mutaciones en el gen que codifica la distrofina, localizado en Xp21 17,18. La distrofina es una proteína cuya función es absorber el impacto durante la contracción de la fibra muscular, al unir la actina del aparato contráctil al tejido conectivo que rodea el músculo 17,19. La pérdida de la distrofina lleva al daño de las fibras musculares durante la contracción, con daño muscular crónico subsecuente, inflamación y posterior remplazo de las fibras musculares por tejido fibroso 17. En 1986, se describió un fenotipo alterno a la DMD, conocido como la distrofia muscular de Becker (DMB), que se caracteriza por la presencia de una proteína parcialmente funcional y un fenotipo menos severo 17.
El correcto diagnóstico de los pacientes con DMD permite el adecuado enfoque terapéutico, de seguimiento y de rehabilitación del paciente afectado. En la presente revisión se describen los diferentes tipos de biomarcadores y métodos diagnósticos en pacientes con DMD, que mejoran el enfoque diagnóstico en estos pacientes.
Biomarcadores y pruebas genéticas
De acuerdo con el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos, los biomarcadores son "aquellas características biológicas, bioquímicas, antropométricas, fisiológicas, etc., objetivamente mensurables, capaces de identificar procesos fisiológicos o patológicos, o bien una respuesta farmacológica a una intervención terapéutica" 20. Un biomarcador debe cumplir con dos condiciones: a) ser objetivamente medible o b) reflejar algo de interés, ya sea un proceso bioquímico o un desenlace clínico como el resultado de una intervención terapéutica (por ejemplo, un resultado bioquímico, la antropometría y la medición de la función motora) 20. Algunos biomarcadores diagnósticos detectan o confirman la presencia de una enfermedad o condición de interés, y algunos biomarcadores de seguimiento determinan el estadio de la enfermedad o la mejoría luego de recibir un tratamiento, entre otros factores 20.
En los pacientes con DMD, los biomarcadores resultan útiles de acuerdo con la edad y la historia natural de la enfermedad (figura 1). Las concentraciones de distrofina son un marcador durante toda la historia natural de la enfermedad. Además, pese a que se recomienda analizar las cantidades de creatina cinasa (CK) y el reporte de mutaciones en el periodo neonatal o dentro del tamizaje neonatal, estos marcadores diagnósticos pueden ir más allá de los cuatro años, pues hay diagnósticos que se hacen tardíamente (entre los 10 y los 14 años).
A pesar de haber sido descritos hace mucho tiempo, en nuestro entorno el uso de biomarcadores "de monitoreo" no es rutinario, principalmente por los costos asociados. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los biomarcadores genómicos, como la proteína 4 de unión latente al factor de crecimiento transformante tipo p ( LTBP4), identifican modificaciones genéticas que se correlacionan con la edad de pérdida de la deambulación, independientemente del tratamiento con esteroides 21,22. La LTBP4, a su vez, estimula la expresión de fosfoproteína secretada 1 (SPP1) en los mioblastos. El spp1 es un marcador de predicción, en el cual un genotipo particular (genotipo G) tiene una relación con la pobre respuesta a corticosteroides 23,24.
En la DMD, algunos biomarcadores que inicialmente se determinaron como de seguimiento ahora son biomarcadores de tamizaje o de diagnóstico, que se asocian con pérdida tardía de la marcha y estiman si hay o no una pérdida de la marcha temprana 25.
Por último, los desenlaces clínicos subrogados de los estudios pivotales se pueden utilizar para definir si hay un beneficio clínico de una intervención farmacológica y, dentro de estos estudios, la inmunohistoquímica define el beneficio de la intervención, sin que esto tenga una correlación clínica 26.
Creatina cinasa
Se ha planteado que el abordaje inicial del tamizaje neonatal para la DMD se mida con la actividad de la CK en suero, utilizando métodos como la fluorescencia 27-30. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las concentraciones de CK están elevadas en niños sin DMD desde el nacimiento, con valores que alcanzan incluso un máximo de 10 a 20 veces el valor de referencia en niños normales de mayor edad. Estas concentraciones pueden permanecer elevadas incluso hasta los dos años 31,32. Asimismo, la CK debe evaluarse en los niños con DMD, en relación con el estadio de la enfermedad, dado que el incremento severo inicial decae progresivamente a una tasa del 25 % por año y vuelve a los valores normales cuando una cantidad considerable de tejido muscular ha sido remplazada por tejido graso, necrótico o fibrótico 31,33.
Los valores de la CK varían levemente según la etnia o el género del paciente (en los hombres caen debido a la edad) y pueden estar elevados en condiciones diferentes a la DMD 34. Una de las limitantes de los marcadores bioquímicos es, pues, su variabilidad biológica entre individuos y cifras fuera de rango que no necesariamente son indicativas de una patología.
Creatina cinasa en la distrofia muscular de Duchenne
En los pacientes con DMD, distintos estudios han indicado valores elevados tempranamente, así como medias de los valores mayores 35. Se estima que cifras muy elevadas en la evaluación temprana predecirían un fenotipo más leve, en comparación con cifras bajas con una elevación más tardía 36.
En resumen, la CK es definitiva como biomarcador y hace parte del diagnóstico, aunque hay otras causas de elevación de la CK y la correlación puede no ser directa en pacientes que han recibido tratamiento, además de la variabilidad biológica de las variantes patogénicas.
| Creatina cinasa: fracción muscular como parte del tamizaje corriente de sus concentraciones. La creatina cinasa en su fracción muscular (CK-MM) es una enzima que cataliza la fosforilación de creatina en músculo, por lo cual es un buen referente de su fisiología 37. Las limitaciones de este marcador se relacionan con valores muy altos en una etapa muy temprana, aun cuando se presenta en percentiles. Ello se interpretaría como un falso positivo, y frente a lo cual es difícil saber si se relaciona con una miopatía o hace parte de la fisiología neonatal. Dada la variabilidad en las concentraciones de la CK-MM en los primeros días de vida, se sugiere realizar múltiples puntos de corte para la CK-MM que se relacionen con la edad, cuando se use la CK-MM como estrategia de detección en recién nacidos 38. |
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica en el diagnóstico de la dmd tiene limitaciones en la evaluación histopatológica de enfermedades neuromusculares, dado que requiere un equipo especializado. Por otra parte, el procedimiento de biopsia implica considerar los riesgos asociados con la intervención quirúrgica y el acto anestésico de la cual deriva la muestra (39). Igualmente, dependiendo del estado de la enfermedad, existe la posibilidad de tomar una muestra de tejido fibroso que no es útil para el análisis. Otra técnica descrita es el Western Blot en tejido, mediante la cual se determina la presencia de distrofina a través de electroforesis; sin embargo, es un proceso largo, complejo y costoso, que no hace parte del estándar de manejo 40.
Genotipificación
El gen de la distrofina (Xp21) está compuesto por 2.4 millones de pares de bases que se contienen en 79 exones y codifica la expresión de la distrofina, una proteína de 427 kDa, varias isoformas y una expresión variable en diferentes tejidos 41. Esta variabilidad de expresión se relaciona con un fenotipo variable, con alteraciones en el neurodesarrollo y cambios en el comportamiento, el estado cognitivo y el desarrollo del lenguaje, entre otros aspectos 41.
En los pacientes con DMD, las mutaciones puntuales de novo están presentes en uno de cada tres pacientes 17; sin embargo, pueden faltar o estar duplicados algunos exones (deleción y duplicación). También se ha reportado la presencia de deleciones en el 60 %-85 % de los casos y duplicaciones en el 10 %-15 %, lo cual hace que el gen se constituya en un biomarcador que permite diagnosticar de forma objetiva la enfermedad 42.
Las deleciones y duplicaciones se relacionan con la severidad del cuadro clínico, teniendo en cuenta si generan o no corrimiento del marco de lectura. Una deleción es la falta de material genético; mientras que una duplicación es el exceso de este. Si la deleción/duplicación conserva el marco de lectura del gen (in-frame), se produce una proteína (usualmente más corta), pero que sigue siendo parcialmente funcional. Por esto, la deleción/duplicación in-frame usualmente se asocia con un fenotipo más leve (DMB). Por otro lado, si la deleción/ duplicación interrumpe la transcripción del gen al no conservar el marco de lectura (out-frame), la proteína no se produce, con lo cual se da el fenotipo clínico de DMD 43.
Reacción en cadena de la polimerasa múltiple
En la DMD, con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple se busca la detección simultánea de múltiples exones en una sola reacción. Es una técnica que ha presentado limitaciones en DMD, por el hecho de que no amplifica la totalidad de los exones del DMD (solamente amplifica de 20 a 30 exones de los 79 del gen), de tal modo que si la deleción o duplicación del paciente se presenta en los exones no amplificados, el estudio no podría descartar la DMD, por lo cual a la fecha se ha dejado de utilizar.
Amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiplex
La amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiplex (MLPA, por sus siglas en inglés) es una variante de la pcr múltiple en la cual se utilizan sondas de dos oligonucleótidos marcadas con fluorocromo que reconocen sitios adyacentes del ácido desoxirribonucleico (ADN) y amplifican simultáneamente por PCR todas las sondas. Después los fragmentos se separan por electroforesis y se analizan con varios controles de ADN negativos de referencia. Es una técnica de muy buena calidad, pero su principal limitación es que no puede ser desarrollada in house, dado que la patente de la tecnología (sondas) pertenece a la compañía que la creó 44.
Dada la alta prevalencia de duplicaciones/deleciones en los pacientes con DMD, en una aproximación inicial la realización de este estudio es costo-eficaz, al ser el método de elección para duplicaciones/deleciones 17. En caso de resultados no definitivos, se debe analizar al paciente de manera complementaria por medio de secuenciación 45. Además, si en el sitio de unión de la ligasa del MLPA hay una mutación, no se podrían ligar las sondas y no se amplificaría el exón, lo que generaría un resultado falso positivo.
En otras ocasiones, al observar una deleción de un exón único, esta se puede originar en una falla parcial en la amplificación (llamada en inglés allelic dropout: un alelo no se amplifica), secundaria a la presencia de una variante puntual o de un polimorfismo de una sola base en el sitio de unión de la sonda de MLPA 46. Dicha variante podría ser incluso una variante patogénica, de tal modo que la aparente deleción de un solo exón enmascararía una variante puntual, por lo cual es necesario en estos casos hacer otros análisis para determinar la causa de la deleción única del exón. Se resalta que cuando hay deleción de un exón único, es necesario secuenciar todo el gen, dadas las implicaciones terapéuticas que tendría omitir una mutación puntual susceptible de manejo con terapias read through47.
Secuenciación por técnicas de siguiente generación
La secuenciación por técnicas de siguiente generación (NGS, por sus siglas en inglés) amplifica miles de secciones del genoma, con posterior secuenciación por síntesis. De ello se obtiene una gran cantidad de ampliaciones sobre los que se hace la secuenciación. Adicionalmente, la NGS permite detectar ciertos segmentos intrónicos que presenten alteraciones y puedan explicar el fenotipo de DMD. Sin embargo, algunos de estos hallazgos deben ser confirmados por secuenciación clásica, dependiendo de la amplitud y profundidad con que la NGS actúe en determinada sección de los genes, con las limitaciones que esto supone 48.
A la fecha se pueden solicitar paneles genéticos que permiten, además, determinar los genes de miopatías congénitas y que reconocen de una manera costo-eficaz el diagnóstico diferencial 49.
| Distrofina-DMD en mujeres Las mujeres portadoras de una mutación del gen de la distrofina suelen ser asintomáticas; sin embargo, alrededor del 2.5 °% al 12 °% de las portadoras pueden desarrollar síntomas que incluyen mialgias, debilidad muscular proximal y miocardiopatía. En estas pacientes se puede evidenciar debilidad muscular (en músculos proximales, como la musculatura de la cintura pélvica y del hombro), la cual es generalmente asimétrica. En estas pacientes hay un amplio rango de valores de CK, lo que la convierte en un mal biomarcador de las mujeres portadoras 50. |
Algoritmo diagnóstico
Lo anterior ha permitido crear algoritmos diagnósticos que determinan el tipo de prueba genética que se debe realizar, de acuerdo con el fenotipo del paciente y los hallazgos de resultados previos (figura 2) 17.
VP: variante patológica; IHQ: inmunohistoquímica; Del.: deleción; CPK: creatina-fosfocinasa; CGH: gonadotropina coriónica humana; MLPA: amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple; NGS: secuenciación de nueva generación.
Figura 2 Algoritmo de secuenciación diagnóstica
Es importante recalcar que no encontrar una variante patogénica en DMD a través de MLPA y secuenciación no descarta necesariamente el diagnóstico, dado que existen otros mecanismos por medio de los cuales explicar la ausencia de distrofina 51. Pueden haber mutaciones intrónicas en que es necesaria una secuenciación profunda 52. De igual manera, en pacientes con manifestaciones atípicas (por ejemplo, deficiencia de glicerol cinasa, hipoplasia suprarrenal congénita, enfermedad granulomatosa crónica o discapacidad intelectual) se debe realizar una hibridación genómica comparada o un microensayo de análisis de polimorfismos de una sola base 53; entre tanto, en pacientes femeninas con expresión variable, en las cuales sus hijos no pueden ser genotipificados, se debe aplicar el mismo algoritmo descrito en la figura 2, al igual que en las portadoras de la enfermedad 17.
Asesoría genética en la distrofia muscular de Duchenne
La DMD se hereda de forma recesiva ligada al cromosoma X. El riesgo para los hermanos de un probando depende del estado genético de la madre. Las mujeres heterocigotas tienen un 50 % de posibilidades de transmitir la variante patogénica de la DMD en cada embarazo. Los hijos que hereden la variante patógena (homocigotos) se verán afectados; mientras que las hijas que heredan la variante son heterocigotas y pueden presentar una variedad de manifestaciones clínicas (mujeres portadoras). En el caso de los varones con DMD, todas sus hijas serán heterocigotas (portadoras), en tanto que ninguno de sus hijos heredará la variante patógena.
Las pruebas moleculares de portadora para mujeres en riesgo, las pruebas prenatales y las pruebas genéticas previas a la implantación son posibles si se conoce la variante patogénica de la DMD en la familia. Se debe asesorar a las familias acerca del riesgo de recurrencia de la enfermedad y ofrecer opciones reproductivas que incluyen la selección de embriones de mujeres, que serán portadoras. Se debe tener en cuenta que se dispone del diagnóstico genético preimplantación, el diagnóstico prenatal temprano por ADN fetal en sangre materna periférica y la biopsia de vellosidad coriónica. También es necesario ofrecer otras alternativas como la donación de esperma, de óvulos o la adopción 17. Para determinar la secuenciación diagnóstica se propone el algoritmo descrito en la figura 2.
Conclusiones
A la fecha, los biomarcadores actuales y de utilidad clínica son la CK, la MLPA, la secuenciación NGS o Sanger y la distrofina en biopsia. Adicionalmente, los pacientes deben contar con asesoría y el diagnóstico genético preimplantación en los casos en que sea pertinente. Otras técnicas, como el Western Blot, han entrado en desuso. Se debe tener precaución al realizar tamizaje con creatina-fosfocinasa en mujeres o recién nacidos. En pacientes con manifestaciones atípicas asociadas, se recomienda la hibridación genómica comparada.
