Introducción

La metagenómica es el estudio o el análisis genómico y funcional de diversas comunidades microbianas que no son cultivables a nivel de laboratorio; se construyó sobre la base de los avances en la genómica microbiana, amplificación por PCR, clonación y secuenciación de genes altamente conservados como el ARNr 16 S, el nif, el recA, entre otros ^1-3. El termino metagenomica se utilizó por primera vez en el año 1998 por los científicos Handelsman Jo y colaboradores, los cuales definieron al metagenoma como el conjunto de genomas de la microbiota del suelo que permite acceder a los genes de las diferentes comunidades microbianas que componen ese ecosistema de forma directa sin necesidad de un cultivo previo ⁴.

La metagenómica nace por la necesidad de determinar, explorar y analizar las comunidades microbianas de diversos ambientes. Esto permite recuperar nueva diversidad genética, acceder al estudio de rutas metabólicas y comportamiento ecológico de estas comunidades y a acceder a la secuencia de sus genes ^1,2.

Un proyecto metagenómico consta de los siguientes pasos: clonación de ADN, construcción de bibliotecas metagenómicas, selección de los clones mediante la detección basada en función o basada en secuencia y por último el análisis de los datos obtenidos ^5,6. Los análisis de las secuencias junto con los análisis funcionales proveen una visión del potencial genómico y del papel ecológico de los microorganismos ³.

Es importante resaltar que el tamizaje de las bibliotecas metagenómicas se realiza basado en función o en secuencia y su uso depende del objetivo del estudio. En el enfoque basado en función, la biblioteca es detectada por la expresión de características fenotípicas, mientras que en el enfoque basado en secuencia la biblioteca es detectada por las secuencias de ADN. Estos dos enfoques han permitido el descubrimiento de nuevas enzimas y antibióticos ^1,2,7.

Uno de los ambientes más estudiados mediante metagenómica ha sido el suelo, de hecho, los primeros estudios metagenómicos fueron realizados en este ambiente ⁴, encontrándose diferentes biomoléculas, enzimas y genes ⁸. La metagenómica funcional, o también llamada metagenómica basada en función, junto con el implemento de nuevas técnicas y herramientas bioinformáticas, ha permitido la comprensión de los Genes de Resistencia a Antibióticos (GRA), sus orígenes, reservorios y movimientos ^9,10.

La resistencia antimicrobiana generada desde el inicio de la era antibiótica se ha dado por el uso excesivo y mal uso de los antibióticos creando la aparición e incremento de microorganismos patógenos resistentes a todas las clases de antibióticos conocidos (naturales, semisintéticos y sintéticos). Esta situación obstaculiza el tratamiento de enfermedades no solo en humanos sino también en plantas y animales, obligando a descubrir nuevos antibióticos y a comprender los genes que ocasionan esta resistencia, sus orígenes, reservorios y sus movimientos (ecología de los genes de resistencia a antibióticos) para así mismo poder afrontar esta crisis en salud ^11-13.

La finalidad de esta revisión es abarcar la temática relacionada con los genes de resistencia a antibióticos, sus orígenes, reservorios y movimientos en los diferentes hábitats y poder visualizar la metagenómica como herramienta útil para aislar, identificar y analizar estos genes que son albergados por microorganismos que habitan los suelos, así como el impacto que tienen en salud pública.

Estudio de genes de resistencia microbiana mediante metagenómica funcional

Para comprender el tema de resistencia microbiana a antibióticos, desde el punto de vista metagenómico, es importante conocer las tres definiciones que existen de resistencia antimicrobiana en la actualidad (figura 1).

Fuente: elaborado a partir de Martínez y colaboradores ¹²

Figura 1 Resistencia a antibiótico. 

La primera, la definición clínica, se basa en los puntos de corte de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y se utiliza para informar a los médicos sobre el posible antibiótico de elección para la terapia. Esta definición no es válida para microorganismos que no son patógenos humanos y tampoco para compuestos antimicrobianos que no son utilizados en terapia, ya que en éstos no se han determinado tales puntos de corte. La segunda es la definición epidemiológica en la cual se establecen valores comunes de cortes epidemiológicos para la resistencia (ECOFFS), que se define como el valor de la MIC que corresponde al límite superior de una población tipo salvaje de una especie particular. Los ECOFFS se establecen analizando un gran número de aislados de la misma especie bacteriana para determinar la distribución normal de sus MICs. Se utiliza para cualquier combinación microorganismo-antimicrobiano, incluyendo los biocidas, pero es limitada cuando se desea analizar un único gen o mutación en determinado aislado. La tercera es la definición operacional que se centra en el gen de resistencia, al contrario de las anteriores definiciones que se centran en las especies y se basan en la comparación de una cepa parental con una cepa mutante o la misma cepa parental con una cepa que contiene un gen de resistencia adquirido por Transferencia Horizontal de Genes (TGH). La cepa será resistente si tiene un mayor valor de MIC que su cepa parental tipo salvaje para el compuesto estudiado. La expresión o inactivación de estos genes hacen a un organismo huésped susceptible, de una u otra manera, más resistente a un antibiótico particular. Esta definición es la más apropiada para estudios metagenómicos de resistencia a antibióticos ya que permite a los investigadores definir un gen específico.

En los estudios de resistencia antimicrobiana se utiliza la metagenómica funcional debido a que permite descubrir genes cuya función es difícil de determinar a partir de sólo la secuencia ^13-15. Diferentes estudios metagenómicos basados en función han demostrado la presencia de GRA en diferentes ecosistemas, confirmando su ubicuidad en el ambiente, generando así un posible riesgo para la salud humana debido a que pueden ser adquiridos por patógenos humanos ^13,12,16.

Uno de los primeros estudios realizados mediante metagenómica en el cual se identificaron GRA en suelo fue el realizado por Riesenfeld y colaboradores en el 2004 ¹⁴. Estos científicos identificaron clones que expresaban resistencia a dos tipos de antibióticos, los aminoglucósidos y las tetraciclinas, los GRA responsables de conferir esta característica a los clones diferían de los GRA que se conocían hasta ese entonces, por ello, estos autores propusieron que las bacterias del suelo podrían ser un reservorio de nuevos GRA y que su diversidad genética era mucho mayor a lo que se creía.

De ahí en adelante infinidad de estudios en esta área se han desarrollado y se han identificado compuestos con funciones antibióticas que son producidos por microorganismos que habitan el suelo. Por ejemplo, se han aislado y caracterizado a partir de bibliotecas metagenómicas de ADN de suelo, antibióticos como la turbomicina A y B ¹⁷, de suelos supresores de enfermedad se han hallado clones que contienen una riqueza de loci de biosíntesis de antibióticos, con un consecuente potencial de producción de antibióticos ¹⁸. También se han recuperado e identificado enzimas con capacidad biocontroladora y antifúngica como la quitinasa bacteriana, Chi18H8 ¹⁹, se han identificado genes que codifican para nuevas moléculas terapéuticas como las policétidos sintasas tipo I y tipo II que contribuyen a la síntesis de los antibióticos eritromicina, epitilona, y rifampicina mediante Streptomyces spp; las péptido sintetasas que contribuyen a la síntesis de antibióticos complejos ^1-3.

Genes de resistencia en suelos sin actividad antropogénica

Se ha demostrado también la presencia de GRA en suelos en ausencia de presión selectiva mediada por actividades antropogénicas, en gran medida esto se debe a que estos suelos contienen bajas concentraciones de compuestos que seleccionan para esa resistencia. Un claro ejemplo son los antibióticos betalactámicos que se encuentran en grandes proporciones en el suelo de forma natural ya que en este habitan una densa población de microorganismos que los produce, esto podría explicar la razón de porqué se ha encontrado GRA en suelos sin actividad antropogénica.

En el 2009 Allen y otros realizaron un estudio metagenómico en un suelo de Alaska virgen, en el cual identificaron GRA β-lactámicos que codifican tanto para β-lactamasas divergentes como para la primera β-lactamasa bifuncional que posiblemente es una fusión natural entre dos enzimas de longitud completa, confiriéndole una ventaja selectiva en un ambiente clínico a los organismos patógenos que puedan albergar estos genes. Estos hallazgos comprueban que los determinantes de resistencia a β-lactámicos se encuentran en ecosistemas con ausencia de presión selectiva del uso moderno de antibióticos, debido a que son suelos remotos sin ningún tipo de actividad antropogénica ¹³.

Genes de resistencia en suelos con actividad antropogénica

Por otro lado, se ha demostrado que el uso de antibióticos en la agricultura contribuye a la propagación de genes de resistencia. Los mecanismos por los cuales estas prácticas agrícolas influyen en la resistencia son desconocidos y también su impacto en el resistoma y microbioma del suelo. En el estudio realizado por Forsberg y otros en el 2014 se descubrieron GRA que representan todos los principales mecanismos de resistencia, además demostraron que los distintos tipos de suelo, tanto suelos agrícolas como de pastizales albergan distintos resistomas debido a la adición de fertilizantes nitrogenados que influyen fuertemente en su contenido siendo las betalactamasas empobrecidas y los trasportadores de membranas enriquecidos y favoreciendo organismos particulares como los copiotrofos que causan cambios en la abundancia bacteriana que a su vez probablemente afectará la composición del resistoma.

El suelo contiene una enorme diversidad de GRA, cuyos genotipos preexistentes pueden ser favorecidos por el incremento a la exposición a antibióticos y no por la adquisición de nuevos GRA. Se puede inferir que el principal determinante del contenido del resistoma del suelo es la filogenia. Al cambiar la diversidad y el tipo bacteriano a través de los suelos, así mismo, lo hacen sus GRA asociados, resultando en resistomas que pueden responder a las modulaciones antropogenicas como lo son los fertilizantes nitrogenados y que no poseen propiedades relacionadas a los antibióticos ²⁰.

Estudios como el de Nikolina y otros en el 2014 demostraron que los suelos tratados con estiércol de vacas que no han recibido tratamiento antibiótico aumentaron la cantidad de GRA betalactámicos existentes en ese suelo. Los GRA son abundantes en estiércol de animales que no tienen historia de tratamiento antibiótico debido a la presencia natural de estas bacterias intrínsecamente resistentes a antibióticos que habitan el tracto gastrointestinal de los animales ²¹.

Los GRA del resistoma del suelo pueden entrar a la cadena alimenticia vía cultivos contaminados o aguas subterráneas y tener potenciales consecuencias en salud humana si son transferidos a patógenos ²¹.

Transferencia horizontal de genes entre bacterias del suelo y patógenos clínicos

Los GRA presentes en un suelo, con o sin actividad antropogénica, pueden ser adquiridos por los patógenos humanos mediante diferentes vías. Una de las vías propuestas en esta adquisición es la transferencia horizontal de genes (THG), un estudio que lo respalda es el realizado por Forsberg y otros en el 2012 quienes encontraron que los GRA de las bacterias del suelo que estudiaron tienen una similitud del 100 % con los GRA de los diversos patógenos humanos incluyendo secuencias de movilización que sugieren como mecanismo de diseminación la THG ⁹.

En la figura 2 se muestra que cuatro de los contigs ensamblados (AB95_GE_3, AB95_CH_13, AB95_TE_2, AB95_PI_68) son más del 99 % idénticos a un gran espacio de secuencia encontrado en numerosos patógenos que contienen una alta densidad de GRA y que es flanqueado por múltiples elementos móviles. Los aislados que albergan los GRA están estrechamente relacionado con Pseudomonas sp K94.23 y con Ochrobactrum anthropi; microorganismos que predominan en entornos ambientales y están poco vinculados a causar infecciones en humanos, y son altamente divergentes a los patógenos humanos. Sin embargo, sus GRA presentan el 100 % de identidad con los GRA de patógenos confirmando que estos genes se mueven entre especies vía THG ⁹.

Figura 2 Comparación de cuatro contigs de resistencia ensamblados (AB95_GE_3, AB95_CH_13, AB95_TE_2, AB95_PI_68) y derivados de una colección de cultivos con cinco aislados de patógenos humanos. Se muestran los diferentes GRA que comparten. 

Ahora bien, se sabe que la resistencia está dada por GRA que se pueden definir como GRA ecológicos o GRA operacionales (figura 3). Los GRA ecológicos han evolucionado en la naturaleza con el objetivo de proteger a un organismo del efecto inhibitorio de un antimicrobiano producido por otro organismo. La fuerte presión selectiva ha llevado a un cambio en la función ecológica de estos genes que son adquiridos por patógenos mediante THG desde que inició el uso de antibióticos por los humanos ¹².

Fuente: elaborado a partir de Martínez y colaboradores ¹².

Figura 3 Definiciones de genes de resistencia microbiana GRA ecológicos / operacionales. 

No todos los genes que confieren a un organismo el fenotipo de resistencia son GRA. Por ejemplo, existen genes que codifican para proteínas detoxificadoras que tienen como función detoxificar el ambiente de éstos compuestos antibióticos más no resistir su acción; o las bombas eflujo cuya función original es resistir las sales biliares y no los antibióticos utilizados en terapia humana; también las β-lactamasas tipo AmpC en las enterobacterias que contribuyen al mantenimiento de la morfología normal de E. coli¹².

Los GRA operacionales son aquellos que cuando están presente confiere resistencia a un antibiótico y cuando está ausente incrementa la susceptibilidad al antibiótico. Algunos genes son identificados como genes de resistencia (acrAB y ampC en E. coli, mexAB en Pseudomonas aeruginosa, aac (6ʹ)-Ii en Enterococcus faecium y blaOXY en Klebsiella oxytoca) que pertenecen al genoma del núcleo de estas especies y son responsables por naturaleza, de fenotipos de resistencia intrínsecos. Sin embargo, estos genes no contribuyen al grupo común de genes de resistencia que son capaces de circular entre bacterias. Por tal razón, los análisis metagenómicos deben ser capaces de diferenciar los genes del núcleo de los genes que son capturados por elementos móviles genéticos para, así mismo, conocer su riesgo real en salud pública ¹².

Riesgos asociados con la presencia de un potencial GRA en un ecosistema dado.

Los GRA identificados mediante metagenómica se clasifican en categorías según los riesgos que puedan presentar en salud pública, es decir, el riesgo de que sean adquiridos y confieran resistencia a patógenos humanos. Los niveles de riesgo llamados REScon (condición de la disposición de resistencia), se clasifican desde el riesgo más alto REScon 1 hasta el riesgo más bajo REScon 7 ²².

Discusión

La metagenómica ha abierto las perspectivas al estudio de las comunidades microbianas en diferentes ambientes, y ha permitido acceder al conjunto de genomas de dichas comunidades. Lo anterior es muy importante en la comunidad científica debido a los grandes aportes que se han generado; creando una nueva visión en la microbiología. Mediante la metagenómica se ha podido estudiar a profundidad uno de los ecosistemas más complejos, el suelo, que alberga comunidades microbianas de mucho interés en la academia, industria, salud y demás. El acceso al resistoma del suelo ha conllevado a importantes hallazgos sobre la resistencia microbiana que es tan importante en salud pública, se ha logrado llegar a un entendimiento de la ecología de los genes de resistencia a antibióticos y todos los factores que influyen en esta.

Se sabe que el suelo es un reservorio de nuevos genes de resistencia antimicrobianos, estudios como el de D’Costa y colaboradores en el 2006 ²⁴ permitieron encontrar determinantes de resistencia a múltiples antibióticos en Actinomicetos del suelo y respaldaron la idea de que el suelo es un reservorio de GRA. Por otro lado, Donato y colaboradores en el 2010 ¹⁵ identificaron enzimas bifuncionales en suelo expuestos a actividad antropogénica creando formas de albergar microorganismos que desarrollen resistencia a diferentes antibióticos.

Su y colaboradores en el 2014 ²⁴ también identificaron y caracterizaron GRA en suelos agrícolas y evaluaron el impacto de las prácticas agrícolas, confirmaron que éstas aumentan la diversidad de genes de resistencia a antibióticos en las bacterias del suelo y que pueden conducir a la propagación de resistencia a bacterias del suelo ²⁶.

D’Costa y colaboradores en el 2011 demostraron que la resistencia a antibióticos es antigua y es un fenómeno natural anterior a la presión selectiva moderna del uso clínico de los antibióticos ¹¹. Por lo tanto, los genes de resistencia a antibióticos existen y existieron mucho antes del comienzo de la era antibiótica. La resistencia no es un fenómeno que esté principalmente asociado con su real presión selectiva (típico de la moderna era antibiótica), pero es una característica que es inherente a los microorganismos en la naturaleza ^27-32.

Conclusiones

La resistencia microbiana va más allá del entorno clínico con el que se suele relacionar, los diferentes ecosistemas están en estrecha relación con la ecología de los genes de resistencia a antibióticos, sus orígenes, reservorios y movimientos. Uno de los ambientes más estudiados ha sido el suelo, gracias a la metagenómica que ha permitido el acceso al resistoma de éste, y que ha permitido dilucidar varias incógnitas respecto a la ecología de los GRA. A pesar de que se ha avanzado mucho en el tema, aún falta conocer con exactitud los riesgos reales que representan estos genes y la influencia o impacto que puede tener la actividad del ser humano en los diferentes ecosistemas, no solamente el suelo.