Artículo original

Control del crecimiento In Vitro sobre cepas Gram positivas y Gram negativas productoras de mastitis^*

Growth control In Vitro on Gram - negative and Gram - positive Strains that produce mastitis

Controle do crescimento In Vitro sobre cepas Gram positivas e Gram negativas produtoras de mastites.

Luz Adriana Gutiérrez^**, Divier Antonio Agudelo^***

Resumen

Introducción. La mastitis es una enfermedad causante de pérdidas, a nivel mundial, especialmente en las regiones con una producción lechera intensiva. Es producida por microorganismos que generan daños en la ubre, generando con el tiempo resistencia bacteriana a la acción de los antibióticos y produciendo infecciones reemergentes. Una solución a este problema es la utilización de cargas hipertónicas diferentes sobre los microorganismos que generan la mastitis. Objetivo. Evaluar el efecto de diferentes concentraciones de monosacáridos y disacáridos en los microorganismos causantes de la mastitis. Metodología. Se aisló Escherichia Coli y Staphylococcus Aureus de leches provenientes con vacas con mastitis del municipio de Santa Rosa de Osos, a estos se les midió su curva de crecimiento para identificar a qué horas llegaban a la fase estacionaria. La concentración de microorganismos para la evaluación con los respectivos azucares fue 10⁶/ml inoculados en 9ml de los diferentes azucares a las diferentes concentraciones, su inhibición se determinó por espectrofotometría, a las 20 horas aproximadamente de incubación. Resultados. Staphylococcus Aureus es susceptible a la acción de azucares como sacarosa y glucosa, mientras que Escherichia Coli tiene un nivel de tolerancia más alta. Los análisis de varianzas de dos factores mostraron que existen diferencias significativas en cada uno de los tratamientos tanto para Escherichia Coli como para Staphylococcus Aureus. Conclusión. Se comprobó que los azucares como sacarosa y glucosa tienen un efecto bacteriostático sobre el crecimiento In vitro de Staphylococcus Aureus y Escherichia Coli en concentraciones superiores al 30% y 35% respectivamente.

Palabras clave: Mastitis bovina, cepas Gram positivas, cepas Gram negativas.

Abstract

Introduction. Mastitis is a disease that causes loses worldwide, especially in regions with an extensive milk production. It is caused by microorganisms that damage the udders, producing a bacterial resistance to antibiotics with the pass of time and, in consequence, re-emerging infections. A solution to this problem is the use of different monosaccharide and disaccharide loads on the microorganisms that produce mastitis. Objective. To evaluate the effect of monosaccharide and disaccharide different concentrations on microorganisms that cause mastitis. Methodology. Escherichia coli and Staphylococcus aureus samples were taken from milks coming from cows in Santa Rosa de Osos. The growth curves of the microorganisms were measured to identify the moment of their stationary phase. The concentration of microorganisms for the evaluation with the corresponding sugars was 10⁶/ml inoculated in 9ml of those sugars at the different concentrations. Their inhibition was determined by the use of spectrophotometry, approximately 20 hours after their incubation. Results. Staphylococcus aureus is susceptible to the action of sugars like sucrose and glucose, while Escherichia Coli has a higher tolerance. The variance analysis of two factors showed that there are significant differences in each treatment for both Escherichia Coli and Staphylococcus aureus. Conclusion. A bacteriostatic effect of sucrose and glucose on the growth In vitro of Staphylococcus aureus and Escherichia Coli in concentrations above 30% and 35 %, respectively, was demonstrated.

Key words: Bovine mastitis, Gram positive strains, Gram negative strains.

Resumo

Introdução. A Mastites é uma doença causadora de perdas a nível mundial especialmente nas regiões com uma produção leiteira intensiva, esta é produzida por microorganismos que geram danos na ubre; gerando com o tempo resistência bacteriana à ação dos antibióticos produzindo infecções re-emergentes. Uma solução a este problema é a utilização de ônus hipertônicos diferentes sobre os microorganismos que geram a mastites. Objetivo. Avaliar o efeito de diferentes concentrações de monossacarídeos e dissacarídeos em microrganismos que causam mastite. Metodologia. Isolou-se Escherichia coli e Staphylococcus aureus de leites provenientes de vacas com mastites do município de Santa Rosa de Osos, a estes se lhes mediu sua curva de crescimento para identificar a que horas chegavam à fase estacionária. A concentração de microorganismos para a avaliação com os respectivos açucare foi 10⁶/ml inoculados em 9 ml dos diferentes açucares às diferentes concentrações, sua inibição se determinou por espectrofotometria, às 20 horas aproximadamente de encubação. Resultados. Staphylococcus aureus é susceptível à ação dos açucares como sacarose e glicose, enquanto Escherichia coli tem um nível de tolerância mais alta. As análises de variâncias de dois fatores mostraram que existem diferenças significativas é cada um dos tratamentos tanto para Escherichia coli como para Staphylococcus aureus. Conclusões. Comprovouse que os açucares como sacarose e glicose tem um efeito bacteriostático sobre o crescimento in vidro de Staphylococcus aureus e Escherichia coli em concentrações superiores aos 30% e 35% respectivamente.

Palavras chaves: Mastites bovina, cepas Gram - positivas, cepas Gram - negativas.

Introducción

La mastitis es la inflamación mamaria caracterizada por alteraciones patológicas del epitelio glandular, las cuales se reflejan en cambios físicos y químicos de la leche. La mastitis puede ser causada por agentes físicos y por la interacción de algunos efectos ambientales¹. Una de las principales causas de la aparición de la mastitis es la presencia de microorganismos gram negativos y gram positivos que atacan y generan daños en la ubre de la vaca, que sumados a la resistencia bacteriana que oponen estos gérmenes a la acción de los antibióticos, presente en la mayoría de los casos, se torna una infección re emergente y reincidente. Al menos 140 microorganismos que causan mastitis han sido reportados, la mayoría de los cuales son de difícil erradicación².

No sólo los microorganismos son responsables de la mastitis, la realidad es que la enfermedad es el resultado de la interacción y cooperación de varios factores, entre los que se destacan: la higiene y el manejo de los animales, especialmente durante la ordeña; las características del ambiente productivo, y la susceptibilidad individual de las vacas².

Las formas más frecuentes de mastitis son: la subclínica y la clínica^2,3. La subclínica es difícil de detectar, dado que la enfermedad transcurre sin provocar inflamación glandular visible, ni cambios organolépticos de la leche, aunque sí afecta la calidad fisicoquímica. para su diagnóstico se requieren análisis de laboratorio que detecten la presencia de microorganismos causantes o el recuento de células somáticas en el fluido lácteo, y es de 10 a 40 veces más frecuente que la clínica. La forma clínica de la enfermedad presenta manifestaciones externas de naturaleza inflamatoria en la glándula, detectables por análisis clínico, secreciones lácteas alteradas y reacción sistémica⁴.

Las medidas básicas de control de los organismos contagiosos apuntan a la prevención, a evitar que se produzcan las infecciones intramamarias. Estas medidas consisten en la práctica de un ordeño higiénico, el secado y el tratamiento antibiótico de mastitis clínicas. Estas medidas tradicionales logran reducir la incidencia de mastitis por S. aureus; sin embargo, en muchos casos, el nivel de infección puede ser tan elevado, que puede desencadenar mastitis clínica; con el agravante de originar resistencia bacteriana⁵.

Una solución a este problema es la utilización de métodos alternativos que no generen efectos colaterales después de su tratamiento. Las concentraciones hipertónicas de determinados azúcares sobre el crecimiento in Vitro de los microorganismos es una estrategia para su control que aunque, es in Vitro, los resultados pueden ser extrapolables a nivel in Vivo estudiando previamente las posibles consecuencias que puedan generar en el tejido. En esta investigación se evaluó el efecto de varios azúcares con diferentes concentraciones, sobre el crecimiento in Vitro de bacterias productoras de mastitis.

Materiales y métodos

La investigación se realizó en el laboratorio de microbiología de la Corporación Universitaria Lasallista.

Aislamiento de cepas

Las muestras de leche se obtuvieron de vacas con mastitis clínica y subclínica, provenientes de rebaños lecheros de la finca LA BAVIERA, ubicada en la vereda Pontezuela del Municipio de Santa Rosa de Osos -Departamento de Antioquia, Colombia- altura de 2450m.s.n.m, con una temperatura promedio de 14°C.

Las muestras de leche provenientes de vacas fueron recolectadas asépticamente de cuartos mamarios individuales en tubos estériles desechables con tapa rosca de 15ml de capacidad. Para el aislamiento e identificación de los microorganismos se siguieron las normas internacionales estandarizadas, empleando agar sangre para Staphylococcus spp además del reconocimiento de sus propiedades morfológicas, hemolíticas y pruebas de la coagulasa⁶.

Para la identificación de las bacterias coliformes, además de las características morfológicas, se utilizó una batería bioquímica de reconocimiento para gram negativas.

Determinación de la curva de crecimiento de los microorganismos

Para determinar el comportamiento de los microorganismos aislados en condiciones favorables, se procedió a evaluar su curva de crecimiento para definir las horas en las que llegaban a la fase exponencial y estacionaria; determinando de esta manera la hora aproximada en la cual se podrían realizar las lecturas de inhibición.

Efecto de diferentes concentraciones de monosacáridos y disacáridos sobre el crecimiento in Vitro de E.coli y Staphilococos sp

Los microorganismos aislados se sometieron a concentraciones de 25%, 30%, 35% y 40% para los azucares glucosa, fructosa, maltosa y sacarosa, el número inicial de microorganismos empleados fue de 10E6 bacterias/ml; concentración necesaria para que se desencadene una infección en la mayoría de los organismos superiores. Estos se inocularon en 9ml de las respectivas concentraciones. Los cultivos se encubaron a 37°C aproximadamente 20 horas Cada experimento tuvo 5 repeticiones y dos réplicas. El control para los experimentos se realizó con la concentración de azúcar sin el microorganismo para cada una de las presiones.

Medición del crecimiento por Espectrofotometría

Con los datos obtenidos en la curva de crecimiento, para cada uno de los microorganismos, se pudo estimar la hora en la cual ellos se encontraban en el máximo punto de la fase exponencial; de acuerdo con estos datos se tomaron las medidas por espectrofotometría a 630nm, determinando, de esta manera, el efecto de las presiones osmóticas sobre el crecimiento de los microorganismos.

Resultados

Después de varios muestreos se aislaron colonias de bacterias en agar EMB (eosina metil blue) con características muy semejantes a las de Escherichia coli. De igual manera, se aislaron colonias en agar sangre con características muy similares a las de Staphylococcus aureus y estos resultados se corroboraron con pruebas morfológicas, pruebas bioquímicas convencionales y test de coagulasa para Staphylococcus aureus⁷.

Una vez se aislaron y determinaron las cepas productoras de mastitis, se realizaron las curvas de crecimiento para cada microorganismo, evaluando su crecimiento, por espectrofotometría aproximadamente cada tres horas, en las que se observó un comportamiento similar en ambos mocroorganismos (Gráfica 1) y aproximadamente a las 17 de horas de evaluación se llegó a la fase estacionaria; estos resultados fueron determinantes a la hora de evaluar el efecto de las concentraciones de azúcares sobre el microorganismo.

Al comparar los resultados obtenidos (Gráficos 2 y 3) se observa que las concentraciones de azúcares empleadas en E.coli muestran un comportamiento similar, excepto con sacarosa, en la cual se observaron disminuidas las medidas espectrofotométricas; en cambio, con Staphylococcus aureus las medidas espectrofotométricas más bajas se observaron con sacarosa a concentraciones superiores del 30%, seguido de maltosa, glucosa y fructosa. En la Gráfica 2 se observan dispersiones obtenidas de maltosa y fructosa en las concentraciones de 30% y 25% respectivamente. Es probable que haya habido conteos imprecisos de los microorganismos inoculados inicialmente y por lo tanto se disparó el crecimiento.

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