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Introducción
La cetosis es una enfermedad metabólica asociada al balance energético negativo que sufren las vacas dedicadas a la producción láctea al inicio de la lactancia y se caracteriza por aumento en la concentración de cuerpos cetónicos circulantes 1. Debido al impacto de la cetosis sobre la productividad y la salud de los animales durante el postparto temprano 2 y al efecto negativo sobre la rentabilidad de la empresa ganadera 3, se han llevado a cabo un alto número de estudios epidemiológicos en muchos países que demuestran la alta presentación de la enfermedad bajo distintos sistemas productivos. Así por ejemplo, los reportes de la incidencia de la enfermedad subclínica en Europa varían entre 4,9% 4 y el 72% 5, mientras en Estados Unidos y Canadá se ha reportado entre el 12,1% 6 hasta el 61% 7.
En Colombia, un estudio diseñado para determinar el aumento en la concentración de βHB durante el primer mes postparto en vacas de producción láctea, como factor de riesgo de infección intramamaria en Caldas, reportó un riesgo de hipercetonemia del 12% 8. Sin embargo, la epidemiología en otras cuencas lecheras del país es desconocida. Estudios en condiciones un poco más similares a Colombia, se han realizado en Suramérica en países como Argentina, Chile y Brasil, donde la prevalencia de cetosis subclínica en animales en pastoreo reportada fue del 10,3% 9, 14,8% 10 y 29% 11, respectivamente.
El objetivo de este estudio fue determinar la incidencia y la prevalencia de la cetosis subclínica y clínica durante las primeras seis semanas postparto en vacas dedicadas a la producción láctea en 10 fincas ganaderas, ubicadas en el altiplano cundiboyacense; además de realizar la caracterización detallada de cada una de las fincas, con el fin de conocer las diferentes prácticas de manejo y alimentación durante lactancia y el periodo seco.
Materiales y métodos
Diseño del estudio
Se realizó un estudio observacional longitudinal de cohorte, con muestreo por conveniencia de 10 hatos dedicados a la producción láctea, ubicados en el altiplano cundiboyacense de acuerdo con la voluntad de los propietarios a participar en el estudio, durante el cual, se determinó semanalmente la concentración de β-hidroxibutirato, por medio de un medidor electroquímico portátil (Precision Xtra ® meter, Precision Xtra ® meter. Abbott Diabetes Care Inc., Alameda, CA) desde el parto hasta la sexta semana postparto. El estudio se realizó desde mayo hasta diciembre de 2017. Todos los procedimientos fueros avalados por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia (22/08/2017): Acta CB-FMVZ-UN-040-17 del 22 de agosto de 2017).
Tamaño de la muestra
El cálculo del tamaño de la muestra se realizó para obtener una confiabilidad del 95% y un error máximo del 5% con una prevalencia esperada del 10% 12, de acuerdo a la prevalencia reportada en Colombia, Costa Rica y Argentina anteriormente 8,9,13. Una muestra de 138 animales fue requerida. Como criterios de exclusión se definieron la pérdida de la identificación del animal durante el trascurso de estudio, la no medición inicial de la concentración de β-hidroxibutirato durante la primera semana postparto, animales que estuvieran recibiendo precursores de glucosa como propilenglicol o glicerol en la dieta preparto y la pérdida del seguimiento del animal por descarte o muerte por causas no relacionadas a la entidad, antes de las seis primeras semanas posparto.
Diagnóstico de cetosis clínica y subclínica
El diagnóstico de la entidad se realizó por medio de la toma de una muestra de sangre de la vena o arteria coccígea con una aguja calibre 21G x 25 mm y una jeringa desechable de 3 cc, después del ordeño de la mañana. La medición de la concentración de β-hidroxibutirato se realizó inmediatamente después de la toma de muestra de sangre, por medio de un medidor electroquímico portátil (Precision Xtra ® - Laboratorios Abbott), este medidor ha demostrado que usando como punto de corte 1.2 mmol/L βHB, la sensibilidad tiene valores entre el 88% al 96,3% y la especificidad del 94% al 98,2% 14,15.
La cetosis subclínica fue definida como valores de βHB en sangre completa desde ≥1,2 hasta <3,0 mmol/L 16,17 y la cetosis clínica como valores de βHB en sangre completa ≥ 3,0 mmol/L 18.
Se solicitó a los propietarios no realizar el tratamiento de los animales positivos durante las seis semanas del estudio. Al finalizar el seguimiento, se informó a los propietarios los resultados de los animales positivos y su tratamiento fue dejado bajo el criterio del médico veterinario responsable del hato.
Diagnóstico de enfermedades
La definición de las enfermedades presentadas durante el periodo de estudio se presenta a continuación:
Retención de placenta: falla en la expulsión de membranas fetales mayor a 24 horas 20.
Metritis: útero anormalmente aumentado de tamaño y secreción uterina purulenta detectable en vagina durante los primeros 21 días posparto 21.
Mastitis clínica: leche visiblemente anormal. Inflamación, enrojecimiento o dolor del cuarto afectado 22.
Fiebre de leche: signos compatibles con fiebre de leche como incapacidad para incorporarse, debilidad muscular generalizada, decúbito esternal o lateral y extremidades frías. Consecuente administración de calcio Intravenoso y/o subcutáneo con respuesta favorable al tratamiento evaluada la por capacidad para levantarse y mantenerse en estación 23.
Alteraciones musculoesqueléticas: cojeras determinadas por un puntaje de locomoción ≥2/5 24, otros traumas o accidentes.
Análisis estadístico
La incidencia acumulada y semanal y la prevalencia total y semanal para cetosis clínica y subclínica fueron calculadas. La unidad de estudio fueron tanto la finca como el animal. Se realizó una encuesta a nivel de la finca y a nivel del animal. Se realizó estadística descriptiva de las variables evaluadas en las encuestas. A nivel de animal, las variables evaluadas fueron: raza, edad (años), número de lactancias, duración del preparto (días), duración del periodo seco (días), promedio de producción láctea (litros), condición corporal (1-5/5) 19, asistencia al parto, sexo de la cría y presentación de enfermedades concomitantes (retención de placenta, mastitis, metritis, fiebre de leche, desórdenes musculoesqueléticos).
A nivel de finca, las variables evaluadas fueron: número de animales en producción, tipo de suplementación en preparto y lactancia, cantidad de concentrado, tipo de suplementos diferentes al concentrado en producción y el tipo de pastura.
Se realizó una prueba de Kolmogorov-Smirnov 25 para determinar la normalidad de los datos, las variables que cumplieron este parámetro fueron expresadas en razón de media y desviación estándar. Los datos que no contaban con distribución normal se expresaron en mediana y con rango inferior y superior.
Resultados
Se incluyeron 150 animales provenientes de 10 fincas ubicadas en el altiplano cundiboyacense, seleccionándose 15 animales por finca, enrolados al momento del parto. El promedio de la edad, número de lactancias, días de duración del preparto y del periodo seco, producción láctea y condición corporal están resumidos en la Tabla 1. De un animal, no estuvieron disponibles los datos de producción láctea, por su bajo desempeño productivo durante las seis semanas del estudio, por lo cual, no fue incluido en el análisis de la producción láctea.
El 31,3% eran animales de primera lactancia, el 22% de segunda lactancia, el 17,3% de tercera lactancia y el 29,3% eran animales con cuatro o más lactancias. El 27,3% de los animales presentaba una condición corporal baja al parto (CC<2,7), el 66,6% se encontraba en una condición moderada (CC 2,7- 3) y el 6% restante se encontraba con una condición alta (CC>3). En la Figura 1 se muestra la distribución de los animales de acuerdo con la condición corporal al parto.
Figura 1 Condición corporal al parto (CC: Todos los animales, CC NC: Animales negativos a cetosis, CC C: Animales positivos a cetosis).
El 76,7% de los animales eran de raza Holstein, el 20,6% eran cruces y el 2,7% pertenecían a otras razas como Normando y Jersey. El 10,6% de los partos fueron distócicos, el 44,6% de las crías fueron hembras, el 52,6% machos y el 2,6% fueron partos gemelares; del total de partos, el 6% de las crías murieron durante el parto.
El 41,3% de los animales presentaron alguna enfermedad durante el periodo de estudio. La distribución de las enfermedades postparto se presenta en la figura 2.
Figura 2 Entidades presentadas durante las primeras seis semanas postparto (RP: Retención de placenta, FL: Fiebre de leche, MES: Desórdenes musculoesqueléticos).
En cuanto a la alimentación, los pastos predominantes fueron el Kikuyo (Pennisetum clandestinum) y el Ray Grass (Lolium sp). Durante el preparto, en todas las fincas suministraban a las novillas 3 a 4 kg/día de concentrado comercial por 30 días antes de la fecha esperada de parto, mientras en las vacas, se suministraba concentrado preparto en la misma cantidad, con una variación en la duración del preparto de 20 a 30 días. En cuanto a la suplementación durante la lactancia, las novillas recibían entre 4 a 6 kg de concentrado y las vacas de 4 a 9 kg de concentrado al día, además todas recibían sal mineralizada entre 80 a 120 gramos/día junto con el concentrado. La información nutricional de los concentrados comerciales utilizados en lactancia y preparto se encuentra resumido en la tabla 2.
Tabla 2 Descripción de la composición de los concentrados comerciales utilizados como suplemento preparto y en lactancia en los 10 hatos incluidos en el estudio.
En siete de las fincas, suministraban otro tipo de suplementación adicional al concentrado durante la lactancia como heno (en cuatro de los hatos), silo de avena, papa (Solanum tuberosum), harina de arroz o harina de maíz. En dos fincas, utilizaban levadura en forma líquida (Saccharomyces cerevisiae) a razón de 4 litros/día.
Incidencia y prevalencia de la CSC y CC
En todos los hatos hubo casos positivos a CSC con una variación de incidencia entre 6,66 y 46,66%, mientras la variación entre hatos de CC estuvo entre 0-6,66%, presentándose en solamente en cuatro de las fincas incluidas. La incidencia acumulada de cetosis subclínica y clínica fue de 25,3% y 3,33%, respectivamente. En la Figura 3 se muestra la distribución de la incidencia semanal de la cetosis subclínica.
La distribución de los casos positivos a cetosis subclínica es presentada en la Figura 4, solo dos novillas en primera lactancia fueron positivas para cetosis subclínica. En cuanto a la cetosis clínica (n=5), todos los casos pertenecían a animales con más de tres lactancias, así, 2 casos fueron animales de cuarta lactancia, dos de sexta lactancia y un caso de siete lactancias.
Figura 4 Distribución de los casos positivos a cetosis subclínica de acuerdo con el número de lactancias.
La prevalencia total de cetosis subclínica y clínica fue del 42,6% y 6%, respectivamente. En la figura 5, se muestra la distribución semanal de la prevalencia de la cetosis subclínica, siendo mayor en la semana 4 con 10,6%. La semana de mayor prevalencia para la forma clínica de la entidad fue también durante la 4 semana postparto, con una prevalencia del 2,6%.
El 46,15% de los animales tuvieron un solo resultado positivo para cetosis durante todas las semanas del estudio, mientras el 53,8% tuvieron dos o más resultados positivos, como se explica en la figura 6. Ninguno de los animales fue positivo durante todas las seis semanas del estudio y 13,15% de los animales con al menos un test positivo para cetosis subclínica fueron positivos para cetosis clínica también, aunque 4/5 de los animales positivos a cetosis clínica fueron positivos a cetosis subclínica en otra semana diferente y ninguno tuvo dos resultados positivos a cetosis clínica, excepto un solo animal fue positivo en 5 semanas consecutivas para cetosis clínica.
Discusión
La cetosis bovina es una enfermedad común 26 que tiene un impacto importante sobre la producción láctea 16,27, un mayor riesgo de descarte temprano 28,29, mayor predisposición a otras enfermedades del periparto y un efecto negativo sobre la eficiencia reproductiva. Los costos de la enfermedad derivados de diagnóstico, tratamiento y pérdidas por descarte se han estimado alrededor de $289 dólares por animal, según un modelo económico determinista desarrollado en Nueva York (Estados Unidos) 3. Debido a esto, se han realizado estudios observacionales para determinar la prevalencia o incidencia de la cetosis en los hatos productores de leche en Norteamérica y Europa desde los años 80’s; sin embargo, en Colombia a pesar de su importancia, se desconoce la situación con respecto a esta entidad, por lo cual se hace importante determinar la presentación de cetosis y para así poder proponer el establecimiento de medidas preventivas necesarias.
En el presente estudio, el 68,7% de los animales incluidos eran vacas multíparas. Las vacas con dos o más partos, están en mayor riesgo de presentar cetosis (OR=2, P<0,01) 30, asociado al mayor nivel de producción láctea; sin embargo, la importancia de incluir animales de primer parto está en que la prevalencia de la enfermedad también ha sido determinada en estos animales, teniendo variaciones entre estudios desde 0,6 hasta 48% 4, 5. En esta investigación, la incidencia de cetosis subclínica en animales de primer parto fue de 4,6%, comparada con la incidencia en vacas multíparas que fue de 31%, la cual a pesar de ser inferior a la que ocurre en las vacas de dos o más partos, sigue siendo relevante en su impacto y al momento de desarrollar programas de prevención y monitoreo de la enfermedad en el postparto 31.
La enfermedad que más se presentó durante el periodo de estudio fue la retención de placenta (20,7%), similar a lo reportado en Pasto (Colombia) (15,8%) 32. La prevalencia en los animales con cetosis fue del 46,2%. La retención de placenta ha sido asociada como factor de riesgo para la presentación de cetosis (OR: 1,6 P<0,01) 33, por lo que su alta presentación en este estudio lo hace uno de los principales factores a tener en cuenta para la prevención de cetosis en la lactancia temprana.
En cuanto a metritis, la prevalencia encontrada (18%), está acorde con lo reportado en otro estudio también realizado en Colombia, en el cual, la prevalencia fue del 17,4% 32, sin embargo, la prevalencia de metritis en los animales con cetosis fue mucho mayor (48,7%). Diversos estudios han determinado la presentación de metritis como factor de riesgo para la presentación de cetosis 9. En un estudio realizado por Berge & Vertenten (2014), aunque la prevalencia fue considerablemente menor (4,8%), el riesgo de desarrollar cetosis fue de 1,5 veces mayor en estos animales (OR: 1,5 P<0,03) en comparación con los animales sanos 33.
La prevalencia observada de mastitis clínica (8,7%) fue menor a lo reportado en Colombia, donde la prevalencia fue del 18,4% 32. Los animales con cetosis mostraron una prevalencia del 17,8%, más alta que la observada en la muestra. Existe cierta dicotomía a la relación entre mastitis y cetosis, ya que la mastitis ha sido descrita tanto como un factor de riesgo para la presentación de cetosis 33 y como una consecuencia de la hipercetonemia 34 en diversos estudios, en los que la causalidad de los eventos no ha sido claramente evidenciada. Así, por ejemplo, en Colombia, Villa et al., (2017), no encontraron una correlación estadística entre el aumento en la concentración de βHB sanguíneo postparto y el riesgo de infección intramamaria durante el primer mes de lactancia (OR: 0,25 IC 95%: -1.71 - 2,21) 8.
La incidencia de enfermedades infecciosas durante el postparto temprano en vacas con cetosis se ha atribuido al efecto del balance energético negativo sobre la función inmune 35, por lo cual, animales con concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNEs) y βHB durante el postparto temprano muestran una marcada disminución en la función de polimorfonucleares caracterizada por una disminución en la actividad de la mieloperoxidasa y en la reducción citocromo c36, lo cual puede considerarse asociada a la alta prevalencia de estas enfermedades de origen infeccioso durante el inicio de la lactancia.
La hipocalcemia puerperal también ha sido asociada con un mayor de riesgo de presentar cetosis (OR:2, P<0,01) 33. La presentación de casos clínicos de hipocalcemia puerperal en todos los animales (3,3%) y en los animales con cetosis (7,7%), estuvo dentro de valores cercanos a otros estudios, en los cuales la prevalencia varío entre 4 al 7% 7,17.
La baja presentación de cojeras (3,3%), estuvo acorde con lo reportado en Europa (3,3%) 17, aunque fue menor a lo reportado en Pasto (Colombia), donde la prevalencia fue del 7,2% 32. Aunque en el presente estudio, la prevalencia de desórdenes musculoesqueléticos en los animales con cetosis fue superior a la prevalencia total (7,7%). Sin embargo, la identificación de casos clínicos de cojeras no era registrada con regularidad en las fincas involucradas en este estudio y la prevalencia presentada dependió de la observación en cada visita realizada.
La prevalencia total de distocia (16%) y en los animales con cetosis (20,5%) fue comparable con la prevalencia reportada por Vallejo et al., (2017) (21.1%) 32. La presentación de distocia ha sido asociada con un mayor riesgo de desarrollar cetosis durante la lactancia (OR: 6,59, P: 0,025) 27. La comparación de la presentación de distocia se hace difícil en los diferentes estudios, debido a la falta de homogeneidad en la definición de distocia y en el grado de asistencia requerida al parto que fue clasificada como distocia.
La duración periodo seco fue en promedio 80,5 días (26-278). En el presente estudio, del 33,9% los animales tuvieron un periodo seco inferior a 60 días, por causas como errores en la fecha posible de parto u olvido en el cambio de grupos. El acortamiento de la duración del periodo seco, evita la sobrecondición corporal al parto y disminuye la lipolisis y el balance energético negativo en sistemas intensivos, en comparación con animales con periodos secos de 56 y 90 días 37, sin embargo, en el presente estudio el 20% de los animales con un periodo seco menor a 60 días, fueron clasificados con una condición corporal inferior a 2,7 al parto, por lo cual, el acortamiento del periodo seco, puede afectar el mejoramiento de la condición durante el preparto.
En este estudio, el 46,6% de los animales tuvieron un periodo seco mayor a 65 días, principalmente atribuido a problemas de fertilidad y a una baja producción láctea que conllevó a secar animales más temprano en la gestación, sin embargo, fueron positivos a CSC el 41,6% de estos los animales y el 53,3% de los animales con un periodo seco ≤65 días, siendo alta la presentación de cetosis entre ambos grupos, por lo cual, es posible que el alargamiento del periodo seco no sea un factor de riesgo como tal para el desarrollo de cetosis por no tener un impacto sobre la condición corporal, ya que tan solo el 6,2% de una condición al parto alta (≥3).
Garnsworthy, (2006) plantea un ideal entre 2,75 y 3, para animales en pastoreo con suplementación en el preparto y la lactancia 38. En el presente estudio, el 66,6% de los animales tenían una condición corporal dentro de los parámetros ideales (2,7-3), pero el 27,3% tenían una condición corporal baja (<2,7). Vacas con una condición baja al parto, están en mayor riesgo de problemas de salud, cojeras y descarte temprano 39. Por otro lado, solo el 6% de los animales tuvieron una condición alta (>3), lo cual es deseable, debido a que los animales con sobrecondición corporal tienen un menor consumo de materia seca, y mayor grado movilización grasa al parto con incremento de AGNE’s y βHB 37.
La incidencia acumulada de cetosis subclínica fue de 25,3%, la cual fue superior a la reportada (12%) en un estudio realizado en dos municipios de Caldas (Colombia) 8. Estudios epidemiológicos en Europa y Norteamérica han demostrados incidencias más altas que los resultados del presente estudio, variando entre 45,1% 40 hasta 72% 5, En cuanto a estudios epidemiológicos en animales en pastoreo, también reportaron una incidencia mayor (66,5%) durante las primeras cinco semanas posparto en 15 hatos en Nueva Zelanda 41, lo cual pudo deberse a que a pesar de tener un diseño metodológico similar al presente estudio, difieren en la suplementación durante la lactancia, así solo en el 66,6% de los hatos en nueva Zelanda suministraron concentrado y en todos suministraron silo, mientras en el presente estudio en todos se suministraba concentrando y solo en el 30% silo. Así, los animales alimentados con concentrado tienen un balance energético negativo menor consecuencia de la mayor producción de propionato en rumen 42,43, mientras los alimentados con silo consumen una mayor cantidad de ácido butírico que es metabolizado a butirato 44, además de un balance energético negativo mayor por menor densidad energética de la dieta 45.
La incidencia de cetosis clínica fue de 3,33 casos/100 vacas, lo cual fue parecida a lo reportado por Seifi et al., (2011) y McArt et al., (2012), quienes reportaron una incidencia de 3,7 28 y 3,02% 16, respectivamente, diagnosticada, igual que en el presente trabajo, por concentraciones de βHB sanguíneo ≥3mmol/L. Por el contrario, la incidencia fue mayor en dos estudios realizados en Finlandia (5,3 y 7,3%) 46,47 aunque en estos estudios, el diagnóstico se realizó únicamente basado en signos clínicos (inapetencia, disminución producción láctea, depresión), lo cual, pudo sobreestimar la presentación de la entidad.
La prevalencia total de cetosis subclínica fue del 42,6%, valores superiores a los encontrados en los estudios desarrollados en centro y Suramérica, en donde la prevalencia más baja reportada fue en Argentina (10,3%) 9 y la mayor fue en Brasil durante en verano (22,8%) 11, en los cuales se utilizó el mismo método diagnóstico que en el presente estudio, pero difieren en que los animales pertenecían a un solo hato, al igual que los estudios realizados en Costa Rica 13 y Chile 10, lo cual da una idea a nivel de hato únicamente.
La prevalencia de cetosis clínica fue del 6%, lo cual supera el 1,6% reportado en Europa (definida únicamente por signos clínicos) 33 y más acorde con otro estudio en Europa donde la prevalencia fue del 3,7%, esta vez definida por signos clínicos y determinación colorimétrica de cuerpos cetónicos en leche u orina 17 y a la prevalencia reportada en Costa Rica por determinación de la concentración sanguínea de βHB >2.9 mmol/L (3,51%) 13.
El mayor número de casos de cetosis subclínica ocurrieron durante la cuarta semana postparto, lo que difiere de los sistemas intensivos en Norteamérica y Europa, en los cuales, la mayor incidencia de cetosis subclínica se presentó durante la primera semana de lactancia, siendo mayor al 5 día en leche 16, 17,40, sin embargo, de acuerdo a estudios realizados en sistemas productivos en pastoreo y menos intensivos, al igual que en el presente estudio, la mayor incidencia ocurrió más tarde en la lactancia, hacia la 3 y 4 semana posparto 41,48, lo cual puede deberse a las diferencias entre el tipo de alimentación y el nivel de producción láctea de los sistemas intensivos, que conllevan a un balance energético negativo más temprano, por los altos requerimientos energéticos al inicio de la lactancia que en los sistemas de pastoreo, donde el grado de lipólisis y cetogénesis para suplir los requerimientos, se hacen más importante cerca al pico de lactancia.
El 43,6% de los animales tuvieron una sola prueba positiva, mostrando una resolución sin tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, el 30,7% de los animales tuvieron resultados positivos en semanas no consecutivas, posiblemente por una resolución sin tratamiento, que por una falla en los mecanismos homeostáticos y un inadecuado consumo de materia seca, reincidió durante la misma lactancia 1. El 33,3% de los animales tuvieron entre dos y cinco resultados positivos en semanas consecutivas, por lo cual, la duración media de cetosis fue de 2,5 semanas, similar a lo reportado por Dohoo & Martin, (1984), para quienes la duración media de la enfermedad fue de 16 días 6, lo que difiere con una duración entre 3 y 5 días descrita más recientemente 16,49, aunque en estos estudios el muestreo se realizó diariamente o dos veces por semana, por lo cual, la comparación en la duración no se hace totalmente equiparable.
En conclusión, la cetosis subclínica fue una enfermedad con alta incidencia (25,3%) y prevalencia (42,6%) durante las primeras semanas postparto en los hatos lecheros estudiados, especialmente durante la cuarta semana posparto mientras que la incidencia de cetosis clínica no fue tan relevante en el presente estudio. La enfermedad fue más prevalente en las vacas multíparas, principalmente en las vacas de tercera lactancia. Las enfermedades más importantes durante el postparto fueron la retención de placenta y la metritis. El 89,7% de los animales positivos a cetosis presentaron, además, otra enfermedad concomitante principalmente metritis y retención de placenta (48,7 y 46,1%, respectivamente). Este es el primer reporte de la incidencia y la prevalencia de cetosis subclínica, clínica en Colombia.
Limitaciones del estudio
La principal limitación del estudio fue el muestreo por conveniencia, involucrando solamente 10 hatos, de acuerdo con la voluntad de participar de los propietarios, lo cual afecta la validez externa del estudio. Otra limitación de estudio deriva de la frecuencia de muestreo, que, al ser semanal, no permitió conocer con precisión la duración de la enfermedad, además de la posibilidad de haber subestimado la incidencia de la enfermedad, al no detectar animales positivos entre muestreos, sin embargo, esto requiere un estudio con una mayor frecuencia de muestreo que implica mayores costos además de una mayor colaboración por parte de los hatos participantes, debido al tiempo adicional que involucran los muestreos, sobre las labores diarias en los hatos.
