Introducción

Durante la última década ha existido un aumento en el interés de los consumidores en búsqueda de mejorar su calidad de vida a través de una alimentación saludable, por lo que el concepto de nutrición está encaminado no solamente a cubrir las necesidades nutricionales, sino también a la prevención y tratamiento de enfermedades, lo que ha conducido al diseño de alimentos enriquecidos con nutrientes específicos para tal fin ¹¹.

El huevo es un alimento muy valioso desde el punto de vista nutricional, ya que contiene casi todos los nutrientes esenciales para el hombre. Además, puede considerarse como un alimento funcional debido a los numerosos compuestos bioactivos con los que cuenta, con importantes efectos beneficiosos para la salud ⁴. Actualmente, se han llevado a cabo diversas investigaciones ^{5,6,10,15,22,40)} con el objetivo de aumentar sus propiedades nutritivas, modificando la dieta de las gallinas por medio del uso de componentes que aporten un alto valor nutritivo como el omega 3, antioxidantes y otros componentes.

En este sentido, se resalta el potencial que tiene el huevo debido a la eficiencia de las gallinas ponedoras para depositar nutrientes mediante la modificación de su dieta ²⁴, donde se ha logrado producir huevos significativamente más altos en ácidos grasos insaturados del tipo omega 3, reduciendo la cantidad de ácidos grasos saturados, eliminando el uso de grasa o productos de origen animal e incluyendo semilla de linaza, aceite de pescado y/o algas marinas ¹⁴. También se han podido producir huevos enriquecidos con antioxidantes, como vitamina E, selenio y pigmentos carotenoides, que además de comercializarse como anti-envejecimiento para humanos, van a mantener su frescura y color por más tiempo ⁴¹.

La disponibilidad de materias primas en Chile, permite la modificación de la dieta de las gallinas, por una parte, mediante el uso principalmente de algas y microalgas, que, además de aportar macro y micronutrientes, algunas de ellas son una fuente muy apropiada de AGPICL omega-3, principalmente Ácido docosahexaenoico DHA, en la forma de triglicéridos y de fosfolípidos de alta biodisponibilidad, en forma limpia, eficiente y renovable ³⁸, y por otra parte, mediante el uso de bayas cultivadas en la región de los Lagos como la frutilla (Fragaria x ananassa), uva (Vitis vinifera L.) y mora (Rubus glaucus L.) cuyo nivel de actividad antioxidante promedio es de 6903, 8284 y 9043 mmol ET/100 g pf respectivamente, representando todos ellos una buena fuente de antioxidantes ¹⁷.

En los últimos años el uso de bayas autóctonas se ha incrementado, la presencia de niveles elevados de compuestos bioactivos se ha demostrado y, en consecuencia, compuestos que proporcionan efectos beneficiosos para la salud humana, por lo que las bayas chilenas se han estudiado como fuentes de alimentos funcionales ^26). En la actualidad, el empleo de productos naturales en la dieta de gallinas ponedoras que puedan mejorar no solo la calidad de huevo, sino también la salud y el desempeño productivo de estos animales es de suma importancia tanto para efectos económicos como para satisfacción de los consumidores, ya que se ha demostrado que ciertos compuestos pueden depositarse o modificar la composición o características del huevo ²⁰.

Dentro de las bayas utilizadas para alimentación de aves de corral se encuentra el arándano (Vaccinium myrtillus L.), como buena fuente de compuestos fenólicos naturales, entre ellos las antocianinas ³⁵, esta baya fue utilizada en un estudio realizado por Untea ³⁷, cuyo propósito fue examinar los efectos de la inclusión dietética de hojas de arándano como fuentes de antioxidantes naturales en la dieta de las aves de corral sobre la acumulación de nutrientes con actividad antioxidante en la yema de huevo, observándose una correlación significativa entre los productos de oxidación primaria y el contenido total de polifenoles demostrando tener un efecto inhibidor eficaz de los fitoaditivos sobre la formación de radicales peroxilo, por otro lado, un alto contenido de polifenoles en la dieta de las aves (2,5 g/kg o más) podría reducir la digestibilidad de las proteínas ileales y el aumento de peso, con una influencia negativa en la conversión alimenticia en las aves ¹². Un estudio realizado por Colombino ¹³ concluye que los orujos de frutas podrían ser ingredientes adecuados en la nutrición avícola, incluso indica que se necesitan más estudios para comprender mejor qué dosis se recomiendan más para evitar efectos negativos en la microbiota intestinal.

Una forma de utilización de los subproductos de la industria de la fruta es como aditivos alimentarios en las raciones de aves de corral. Estos aditivos pueden tener un impacto positivo en el metabolismo y la salud de los animales y en la calidad del producto, se ha informado que la suplementación con polifenoles a 600 y 1.000 mg/kg puede contrarrestar los efectos adversos del vanadio sobre la capacidad antioxidante de las gallinas ponedoras, la calidad y la capacidad antioxidante de los huevos ⁴¹. Además, el uso de resveratrol en la dieta de las gallinas ponedoras ejerce efectos positivos sobre su desempeño y en las enzimas ligadas al sistema de defensa antioxidante ⁴².

Un estudio realizado por Skomorucha ¹⁹, donde el objetivo fue evaluar el impacto del orujo seco de frambuesa, grosella negra y chokeberry negro, a 30 g por kg de alimento, en el rendimiento, la calidad del huevo, los glóbulos blancos, heterófilo, indicó que la dieta con chokeberry negro y orujo de grosella negra tenían un impacto positivo en el sistema inmunológico de las gallinas ponedoras, como lo confirman los cambios en frotis de los glóbulos blancos y por el mayor porcentaje de bazo.

Por lo anterior, este estudio tiene como objetivo evaluar los efectos de la inclusión de compuestos antioxidantes proveniente de bayas a través de la actividad antioxidante y ácidos grasos, entre ellos, omega 3 y omega 6, provenientes de algas, pescados y mariscos, materias primas autóctonas del sur de Chile sobre la composición en ácidos grasos y capacidad antioxidante de huevos puestos por gallinas criollas chilenas.

Materiales y métodos

Dietas experimentales

Materias primas. Los insumos para formular y fabricar las dietas para la alimentación de gallinas criollas consistieron en productos de origen vegetal y marino, 100% naturales y provenientes de la región de Los Lagos, Chile. Estas materias primas fueron seleccionadas por su alta disponibilidad, calidad nutricional y precio. Como fuente proteica se consideró principalmente materias primas vegetales tales como harina de maíz, harina de avena, harina de maní, harina de lupino y harina de trigo comerciales. Por otra parte, se utilizaron harinas producidas artesanalmente por medio una estufa de convección forzada marca Binder Serie FD Classic.Line; harina de salmón, harina de chorito, harina de mora, harina de frutilla, harina de pepa de uva y harina de microalgas comercial (DHA Natur). Adicionalmente, pre mezclas de aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales (núcleo ponedora hY LINE2015 con natuphos) con el fin de cubrir los requerimientos nutricionales de las gallinas ponedoras. Igualmente, se adicionaron aditivos nutricionales tales como lisina en polvo fina, metionina y fosfato tricalcico 11% P y 14,5% Ca.

Formulación y elaboración de dietas. Las formulaciones se realizaron mediante un programa computacional basado en programación lineal (Dapp Nutrition 2.0), considerando los requerimientos nutricionales de gallinas ponedoras. Además, se consideraron las variables de proceso implicadas para fabricar estos productos tales como: mínimo porcentaje de almidón y mínimo porcentaje de humedad. Las 8 dietas experimentales fueron formuladas en base a un modelo factorial 2X3 donde se evaluaron dos niveles de inclusión (60 y 30 g/kg de dieta) de fuentes de omega 3 (harina de salmón, harina de chorito y harina de alga) y tres niveles (40, 20 y 10 g/kg de dieta) de fuentes de antioxidantes (harina de mora, de frutilla y de pepa de uva).

La elaboración del alimento de las gallinas, fue a través de la forma de “Pellet”, el cual se desarrolló en la planta piloto de extrusión del Centro de Estudios de la Universidad de Santiago de Chile (CEUS Llanquihue). Para la elaboración, se procedió a moler cada una las materias primas utilizando un molino de martillo (Metalmack, Santiago), hasta un tamaño de partícula de 800 micras. Posteriormente, las materias primas fueron pesadas de acuerdo a formulaciones de cada dieta como se puede observar en la tabla 1 y mezcladas en un mezclador horizontal de paletas (Tandy, China) por 15 minutos. La dieta 9 corresponde al control es decir sin ningún tipo de compuesto bioactivo añadida y la dieta 10 corresponde a grano de maíz adquirido de manera local.

Para la fabricación del pellet de 4 mm, se utilizó una peletizadora semiindustrial (Indusus, Santiago), los pellets de alimento resultantes fueron cortados y secados en un secador convectivo (Cretors, China) de aire caliente durante 15 minutos llegando a una humedad del 7%. Finalmente, una vez enfriados, los pellets de alimentos fueron empacados en bolsas de polipropileno de 25 kg, las cuales fueron etiquetadas y almacenadas.

Consumo de pellets en gallinas. Para el estudio, se consideraron 8 dietas experimentales, un control (sin bioactivos) y una dieta compuesta por grano comercial de maíz, se dio a consumir a cada gallina 135 g de pellet por día de manera exclusiva, alimento que fue proporcionado en dos raciones diarias, en cada habitáculo de cada una de las explotaciones avícolas por un periodo de 8 semanas, en el periodo de primavera.

Tabla 1 Formulación y composición proximal de las dietas experimentales 

Toma de muestras. Al finalizar el periodo experimental, desde cada uno de los habitáculos se realizó un muestreo según la Norma Chilena para muestreo ³⁰, se tomaron aleatoriamente tres huevos para el análisis de ácidos grasos y capacidad antioxidante, se realizó una mezcla de huevos según diseño experimental, estos huevos son pesados con y sin cascara, homogenizados en agitador magnético de placa (Dragonlab, Santiago) congelados a -21°C en refrigerador (Mademsa, Santiago) y liofilizados (liofilizador vertical Operon, Corea), una vez liofilizados se almacenan para su posterior análisis.

Análisis de composición química

Para la totalidad de huevos muestreados se medirán los parámetros de ácidos grasos, entre ellos, omega 3 y omega 6, provenientes de algas, pescados y mariscos y capacidad antioxidante de bayas, entre ellas mora, frutilla y uva, todas materias primas autóctonas del sur de Chile.

Ácidos grasos. Se utilizó la metodología señalada por el por el Instituto de Salud Pública de Chile Subdepartamento Laboratorios del Ambiente e ISO 15304 perfil de ácidos grasos en g/100 g de muestra: “Animal and vegetable fats and oils - Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetable fats and oils - Gas chromatographic method”.

Capacidad antioxidante. Previamente al análisis de actividad antioxidante, fue necesario realizar un proceso de extracción de estos compuestos activos de las matrices alimentarias. Con el objetivo de obtener la mayor cantidad de compuestos activos durante la extracción, se optimizó este proceso a partir del uso de tres mezclas de disolventes de extracción: agua, etanol y una mezcla agua:etanol (1:1). El tratamiento de extracción se efectuó a 40 °C durante 2 horas con agitación constante. Los extractos obtenidos se guardan en refrigeración para su posterior análisis.

La Actividad Antioxidante (AA) de las materias primas y de los huevos fueron medidas a partir de los métodos DPPH y TEAC, que miden la capacidad secuestradora de los radicales libres 2,2-fenil-1-picrilhidrazil (DPPH) y el radical catión 2,2′-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS), respectivamente. Se siguieron los métodos descritos por Okada ³¹ y modificados por López de Dicastillo ²⁵. Los métodos se basan en la decoloración de los radicales libres DPPH y ABTS, seguida por monitoreo espectroscópico de la disminución de la absorbancia a una longitud de onda característica durante la reacción. En su forma radical, DPPH· absorbe a 517 nm y ABTS·+ a 734 nm, pero tras la reducción por especies antioxidantes, la absorción desaparece. Ambas soluciones radicales fueron obtenidas de la siguiente forma:

(i) Disolución etanólica 2 mM de radical DPPH y dilución hasta obtener una disolución con valor de absorbancia de 1 a 517 nm); (ii) los cationes de radical ABTS fueron producidos por reacción de ABTS 7 mM en agua con persulfato de potasio 2,45 mM y almacenada en oscuridad a temperatura ambiente durante 16 h. La solución de radical ABTS fue diluida para obtener un valor de absorbancia de 1 a 734 nm. Todos los análisis se llevaron a cabo en triplicado. La actividad antioxidante fue calculada como porcentaje de inhibición de los radicales (%I):

Con el fin de estandarizar los resultados, las actividades inhibición de los radicales DPPH y ABTS fueron expresados como equivalentes en Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), que es un análogo de la vitamina E.

A partir de una curva de calibrado se expresaron los resultados como gramo de ácido gálico por gramo de producto y como gramo de Trolox por gramo de producto para los ensayos de actividad antioxidante.

Análisis estadístico. Se comprobó la normalidad de los datos utilizando el test de normalidad Kolmogorov-Smirnov. Los datos fueron analizados mediante análisis de varianza usando Statgrphics® Centurion, V.18 Academic Perpetual License (PO 30688).

Resultados

Previo a la realización de los análisis químicos (capacidad antioxidante y ácidos grasos) se realizó una evaluación del peso tanto de la cascara como del huevo mediante el test de normalidad Kolmogorov-Smirnov, se obtuvo que tanto la cascara de huevo como el peso del huevo provienen de una distribución normal, con valores de p-valor de 0,76 y 0,34, respectivamente. Dado que los p-valor resultaron ser mayor a 0,05, no se puede rechazar la hipótesis que los datos provienen de una distribución normal con un 95% de confianza.

En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos del efecto de la dieta en el peso de los huevos recopilados de todos los habitáculos.

Figura 1 Efecto de la dieta en el peso de los huevos recopilados de todos los habitáculos. 

Acorde a los resultados se observa que la dieta presentó un efecto significativo en la media del peso de los huevos y peso de las cáscaras (p-valor=0.031 y 0,039; F ratio=2,20 y 2,11), respectivamente. En cuanto al peso de los huevos los valores más altos fueron obtenidos con la dieta de 1 a la 6 donde no hubo diferencias significativas respecto al control, no así al compararlo con la dieta de grano. Mientras que las dietas 7,8 compuestas por harina de alga y de pepa de uva, y la dieta grano fueron aquellas con los valores más bajos de peso de los huevos. Respecto al peso de la cascara, las dietas 1-8 no presentaron diferencias significativas respecto al control, no así al compararlo con la dieta grano, donde las dietas 1,3,4, presentaron valores de peso estadísticamente más altos en comparación con la dieta grano.

A continuación, se muestran los resultados obtenidos de los perfiles de ácidos grasos en función de las dietas administradas, en donde se demostró que las dietas 1 y grano fueron aquellas que influyeron directamente en que los huevos presentaran altos niveles de ácidos grasos saturados y ácidos grasos trans, mientras que la dieta 3 y 6 están directamente relacionadas con los huevos con alto contenido ácidos grasos insaturados y omega 3. Así también se observó que la dieta 7 fue aquella indujo a los valores más altos de omega 6 y poliinsaturados, y resultan ser indirectamente proporcional respecto al contenido de AG. monoinsaturados, tal como se puede corroborar en la figura 2, en donde se muestra que la variabilidad de los datos fue descompuesta en dos factores principales explicando un total del 72,72% de la variabilidad, con un 48,48 y 24,24% el componente principal 1 y 2, respectivamente, estos resultados fueron obtenidos mediante biplot a partir de los resultados de la caracterización de los huevos liofilizados de los distintitos habitáculos de gallinas alimentadas con diferentes dietas.

Figura 2 Caracterización de los huevos de los distintitos habitáculos de gallinas alimentadas con diferentes dietas. 

Finalmente, en cuanto a actividad antioxidante, los resultados obtenidos se pueden evidenciar en la tabla 2, en donde se pudo corroborar que existen diferencias significativas en la media de actividad antioxidante respecto a las dietas suministradas (p-valor =0,00; Fratio=335,2), con valores que van desde 0,56 hasta 2,13 para la dieta 5 y 1, respectivamente.

Tabla 2 Resultados de capacidad antioxidante en dietas experimentales, control y grano. 

Al comparar las diferentes dietas, de la 3-8 resultaron ser estadísticamente mayores en comparación con el control a diferencia de la dieta 1 que mostró resultados menores, mientras que no hubo diferencias significativas entre la dieta 2 y el control. En cuanto a la comparación con la dieta de grano, se observó que suministrando prácticamente todas las dietas (de la 2 a la 8) los huevos incrementaron su nivel de actividad antioxidante significativamente, excepto la dieta 1 que los resultados fueron menores.

Cabe resaltar que los resultados del test de normalidad Kolmogorov-Smirnov mostraron que los datos de actividad antioxidante determinados en los huevos provienen de una distribución normal, con valores de p-valor de 0,18. Producto que los p-valor son mayor a 0,05, no se puede rechazar la hipótesis que los datos provienen de una distribución normal con un 95% de confianza.

Discusión

Lo resultados obtenidos evidencian que existe una diferencia significativa entre las medias de las muestras experimentales al compararlas con la muestra control y grano en cuanto al contenido de ácidos grasos saturados. Se observa claramente que en la muestra grano se obtuvo un contenido superior de ácidos grasos saturados (34,84 g/100 g) siendo la dieta 3 la que obtuvo el contenido más bajo (31,2 g/100 g), lo que significa una disminución de ácidos grasos saturados en un 7,55%, esta reducción se debe principalmente a los porcentajes de inclusión de materias primas como harinas a base de bayas.

En los resultados obtenidos, se observa una clara tendencia en el aumento del contenido de omega 3 en las dietas 7 y 8, en las cuales se les adicionó harina de algas y harina de pepa de uva, la harina de algas en alimentación de aves, aumenta los niveles de pigmentación de la yema del huevo, este aumento de pigmentación se observó en casi en la totalidad de los huevos analizados, las fotografías no se muestran en este estudio y los niveles de ácidos grasos insaturados, especialmente el docohexaenoico ²⁷. Estudios realizados por Carrillo ⁹ y Rizzi ³²⁾ reportan que el uso de algas y microalgas marinas han logrado un doble beneficio, el aumento de los PUFA n-3 y la acumulación de carotenoides en la yema de los huevos, lo cual hace al producto atractivo para el consumo y le brinda mayor estabilidad oxidativa. Otro estudio ⁽³⁹, demostró que la harina de algas puede incorporarse hasta 10 % en la ración de las gallinas, sin afectar las variables de producción, la calidad y el sabor del huevo.

Otros estudios corroboran el aumento del contenido de omega 3 en huevos, gracias a la suplementación de las dietas de las gallinas con semilla de linaza ^1,27, semilla de girasol ¹⁾ y con fuente lipídica de omega 3 ^3,8,16) y omega 6, directamente ^3,16 y ácido linoleico ¹⁶, todos con resultados positivos.

Las dietas 7 y 8 presentaron el mayor contenido de DHA (3,43 y 3,46/100 g, respectivamente), a las cuales en la formulación se les adiciono harina de alga, para ambas dietas un 2% de la mezcla total. Bruneel,⁷ informo un mayor contenido de DHA en las yemas de huevo delas gallinas alimentadas con una dieta que contenía algas (Nannochloropsis gaditana) y sugirieron que esta alga puede ser utilizada como una alternativa a las fuentes actuales de PUFA n-3 para la producción de DHA en Huevos enriquecidos. Un similar efecto fue visto en yemas de huevo, cuya dieta fue enriquecida con DHA a través de la suplementación dietética con microalgas marinas Schizochytrium limacinum³²⁾ Los ácidos grasos poliinsaturados eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA) son ampliamente conocidos por sus efectos beneficiosos para la salud humana. EPA y DHA son aportados al organismo principalmente por la dieta, DHA se le asocia con el desarrollo y función del sistema nervioso y visual y con efectos prometedores sobre la función cognitiva en pacientes con enfermedades neurodegenerativas ³⁶.

Por otro lado, los resultados obtenidos en relación a la capacidad antioxidante demuestran que, en 6 de las 8 dietas experimentales evaluadas, la capacidad antioxidante fue superior a la muestra control, destacando la dieta 5 se observó un incremento de un 43,92% al compararla con la dieta control.

La capacidad antioxidante de las muestras de huevos es un reflejo de las dietas consumidas por las gallinas. La mayor capacidad antioxidante se apreció en los huevos provenientes de las gallinas alimentadas con la dieta 5 y la menor en los huevos provenientes de la dieta 1, en la tabla 2 se aprecia que las dietas experimentales presentaron mayor capacidad antioxidante que dieta grano y control, excepto dieta 1 y 2. En la literatura se encuentra el uso de otro tipo de antioxidantes como la Vitamina E ^(18,21 , extracto de romero ²¹⁾ y luteína ⁽³³, entre otros, todos con capacidad antioxidante comprobada; no se encontraron trabajos que demuestren el usos de bayas o berries en la alimentación animal como fuente antioxidante, sin embargo es conocido el uso de carotenoides provenientes de la industria agroalimentaria para elaborar premezclas que reemplacen el uso de colorantes artificiales principalmente en los concentrados para alimentar gallina ponedoras, ² valor que también es conferido por la mora por ejemplo, aunque la misma no se considere un residuo vegetal.

Conclusiones

Se demostró que la modificación de la dieta mediante la inclusión de compuestos bioactivos como la harina de alga y harina de bayas, promueve un cambio estadísticamente significativo en la composición de ácidos grasos y capacidad antioxidante de los huevos azules de gallinas criollas Huilliche, determinándose concretamente que las dosis utilizadas son suficientes para producir cambios importantes a corto plazo, sirviendo de referencia para futuros trabajos.

Esta dieta confiere cambios favorables en cuanto a la capacidad de modificar positivamente la calidad nutricional de huevo, conservando un equilibrio en los ácidos grasos saturados e insaturados y ayudando a la disminución de la peroxidación lipídica en la yema del huevo azul, gracias a las propiedades antioxidantes que posee, para de esta manera conservarse por mucho más tiempo lo cual es beneficioso para el consumidor.