Introducción
La leche es una emulsión compuesta de 87,7% de agua, 3,3 - 3,5% de proteína, 4,9% de lactosa, 3,4% de grasa, 0,70% de minerales y 3,36% de componentes menores 1,2,3. Según lo anterior, la leche bovina es una fuente importante de nutrientes que incluye proteínas de alta calidad, carbohidratos y micronutrientes en particular, esenciales para el crecimiento de los terneros lactantes y uno de los alimentos básicos más completos de la nutrición humana. La leche de origen animal y sus derivados, cubren aproximadamente el 20% de las necesidades energéticas, 25% de las necesidades proteicas y el 50% de los requerimientos de calcio de la población humana 4,5, de ahí la importancia del consumo de este alimento tanto en niños como en adultos.
Por otra parte, la calidad composicional de la leche incluye un conjunto de parámetros importantes en la industria láctea, ya que de esto depende su destino, sea para producir leche entera o para producir derivados lácteos como queso, yogur, mantequilla y muchos otros productos. Por esta razón, muchas razas de ganado ovino, caprino y principalmente bovino, han sido mejoradas genéticamente para aumentar la producción lechera y para mejorar su calidad composicional 6,7. La proteína láctea, específicamente la caseína, ha sido mejorada, a partir, de la selección de animales genéticamente superiores, lo que ha aumentado los rendimientos en la producción de quesos y leches ácidas 8,9. Estos avances en mejoramiento genético, han beneficiado a la industria alimentaria, obteniendo el máximo beneficio, cuando se emplea como materia prima, leche de buena calidad, con valores de proteína y grasa elevados.
Un gran número de investigaciones han sido realizadas sobre la variabilidad genética de las proteínas de la leche. Estos estudios comenzaron hace más de seis décadas, mediante la identificación de las principales variantes de la β-lactoglobulina bovina (β-LG) 10. Posteriormente se intensificaron los estudios, descubriendo varios polimorfismos importantes en caseínas de la leche de especies y razas bovinas 11,12. Las variantes genéticas pueden resultar en cambios de nucleótidos, inserciones y deleciones. En la actualidad existen 40 variantes: 9 αs1-CN, 4 αs2-CN, 13 β-CN, 14 κ-CN en el género Bos: Bos taurus (taurino), Bos indicus (cebú), Bos grunniens (yak) y Bos javanicus (banteng de Bali) 12,13,14,15. El objetivo de esta revisión es presentar un panorama general de la estructura, propiedades y genética de las caseínas lácteas y su relación con la salud humana.
Proteínas de la leche
Las proteínas de la leche se dividen en tres grupos principales, clasificándose en función de su solubilidad a pH 4,6 (punto isoeléctrico de la caseína) en: 1) Caseínas, 2) Proteínas del suero y 3) Proteínas que forman parte de la membrana del glóbulo graso. Estas últimas representan solamente el 1% del total de las proteínas de la leche, mientras que las proteínas del suero constituyen aproximadamente el 14% y están compuestas por β-lactoglobulina (β-LG), α-lactoalbúmina (α-LA), inmunoglobulinas (IgG), glicomacropéptidos (GMP), albúmina sérica bovina (BSA) y proteínas menores, como: lactoperoxidasa, lisozima y lactoferrina 16,17,18, siendo estas proteínas un problema ambiental en la industria quesera, ya que pueden ser vertidas en cursos de agua alterando su calidad y afectando negativamente el equilibrio de los ecosistemas acuáticos. El restante de las proteínas (80% aproximadamente), corresponde a las caseínas, siendo su composición variable de acuerdo al tipo de raza lechera (Tabla 1) 19,20) y son estas últimas proteínas las que definen la calidad de la leche.
Las caseínas son un tipo de fosfoproteínas que constituyen uno de los principales componentes proteicos de la leche 24; un litro de leche bovina contiene de 25 - 32 gramos de proteína 20,25. Las caseínas se sintetizan exclusivamente en la glándula mamaria y se encuentran en su mayor parte, formando agregados multimoleculares conocidos como “micelas de caseína” en leche líquida 26. Las micelas de caseína, son fuente nutricional de calcio, fósforo y aminoácidos, que ayudan a satisfacer los requisitos de crecimiento y energía en las crías de los mamíferos. En humanos, tanto niños como adultos consumen leche y derivados lácteos, por lo cual, los productos lácteos son ampliamente comercializados, y quizá por esta razón, las caseínas son probablemente el sistema de proteínas alimentarias mejor caracterizado, lo que ha permitido una amplia producción de productos lácteos de consumo masivo en la alimentación humana.
Caseínas de la leche bovina
Las caseínas son las proteínas más abundantes de la leche y representan entre el 78 - 80% 27,28,29 de las proteínas lácteas con un contenido en leche de 24 - 28 g/L 28,30 y para la leche de origen bovino, se clasifican en cuatro tipos: alfa s1, alfa s2, beta y kappa en una proporción molar media de 3:0, 8:3:1, respectivamente (Tabla 2) 31.
En la leche humana, las caseínas están compuestas principalmente por β-caseína y κ-caseína, también hay γ-caseína, que es un producto de la degradación de la β-caseína 32 y λ-caseína derivada de la αs1-caseína. Las características estructurales de estas proteínas conjugadas con calcio y fósforo, permiten formar estructuras micelares estables, dándole excelentes propiedades fisicoquímicas a la leche, las cuales permiten su fácil transformación en diversos productos lácteos. Una de esas propiedades es su fácil desnaturalización a pH ácido, durante la producción de leches ácidas.
Historia y nomenclatura de las caseínas
Debido a su fácil disponibilidad y relativa facilidad de separación y aislamiento, las proteínas de la leche se han estudiado desde el inicio de la química de las proteínas. El primer artículo de investigación sobre proteínas de la leche (cuajada), fue publicado por Berzelius en 1814. El término caseína (del latín caseus, “queso”), se utilizó por primera vez en 1830 por Broconnet, es decir, antes de que el término "proteína" fuera introducido en 1838 por Mulder, quien realizó investigaciones sobre proteínas de la leche 33.
La preparación de la caseína de la leche por precipitación isoeléctrica fue mejorada y estandarizada por Hammarsten (1883) 34. La caseína isoeléctrica se consideró inicialmente como homogénea, pero la primera evidencia de que es heterogénea fue publicada por Osborne & Wakeman (1918) 35, seguida de evidencia adicional de heterogeneidad, que sugería que la caseína isoeléctrica en realidad consiste de tres proteínas, α-, β- y γ-caseínas. La fracción de α-caseína resuelta por electroforesis de flujo libre se separó posteriormente en fracciones sensibles al calcio (αs-) e insensibles al calcio (κ-), y la fracción de α-caseína se resolvió aún más en dos proteínas distintas, ahora conocidas como αs1 y αs2-caseínas.
Posteriormente, las caseínas lácteas del género Bos fueron definidas originalmente por el Comité de la Asociación Estadounidense de Ciencia Lechera sobre Nomenclatura, Clasificación y Metodología de las Proteínas de la Leche 36, como aquellas fosfoproteínas que precipitan de la leche desnatada cruda por acidificación a pH 4,637 a 20 °C. La propuesta de este Comité fue sugerir un sistema de nomenclatura flexible, que permita la incorporación de nuevos descubrimientos en lugar de sugerir prematuramente un sistema rígido de nomenclatura. En un informe posterior 38, el Comité distinguió las caseínas según su movilidad electroforética relativa en poliacrilamida o en geles de almidón, en presencia de urea y con o sin mercaptoetanol. Sin embargo, en un previo reporte, se recomendó que se descartara el uso de la electroforesis como base para la clasificación de las caseínas y se identificaran de acuerdo con la homología de sus estructuras primarias en las siguientes familias: αs1-, αs2-, β- y κ-caseína. A partir de esto, se recomendó a los investigadores, no asignar letras de variantes genéticas específicas a nuevas variantes de caseínas, hasta que se pueda establecer su homología en la secuencia de aminoácidos 39. En la actualidad, no se han realizado cambios en cuanto a la nomenclatura, sin embargo, se han desarrollado investigaciones encaminadas a identificar nuevas variantes genéticas de las caseínas, usando marcadores de ADN principalmente en razas lecheras bovinas.
En la leche bovina y en la leche de otras especies domesticadas, existen cuatro tipos de caseínas, conocidas como: alfa s1 (αs1), alfa s2 (αs2), (el sufijo indica que son sensibles al calcio, es decir, que pueden precipitar al asociarse con éste), beta (β) y kappa (κ), respectivamente 18,40,41, mientras que las llamadas γ-caseínas (gamma caseínas), son fragmentos de la β-caseína producidos por proteólisis escindida por la plasmina. Es importante resaltar que todos los tipos de caseínas tienen variantes genéticas, producidas por sustitución de nucleótidos y en algunos casos por deleción en el ADN 26,32. Además, todos los tipos de caseínas se agrupan formando estructuras micelares, estableciendo así un sistema coloidal altamente estable en la leche.
Propiedades moleculares de las caseínas
Las caseínas son proteínas bastante pequeñas, con una masa molecular de 20 - 25 kDa (Tabla 3), lo que probablemente contribuye significativamente a su alta estabilidad 42. En general, las caseínas tienen una alta hidrofobicidad superficial debido a sus estructuras abiertas, lo que les confiere gran flexibilidad y una estructura fácilmente desnaturalizable y, por lo tanto, se han descrito como “reomórficas”, es decir, que las moléculas de caseína en solución, son suficientemente flexibles para adoptar estructuras según el ambiente al que estén sometidas, tales como el calor o la urea y son susceptibles a la acción de las enzimas 43.
Los residuos de aminoácidos hidrofóbicos, polares y polares con carga, no se distribuyen uniformemente en la molécula, sino que se concentran en zonas hidrofóbicas o hidrofílicas, lo que les confiere a sus estructuras, un fuerte carácter anfipático y una gran hidrofobicidad superficial, responsable de sus propiedades espumantes y emulsificantes, y hace que las caseínas sean fácilmente susceptibles a la proteólisis, siendo esto importante para la digestibilidad, en la maduración del queso y en la producción de hidrolizados de proteínas para aplicaciones dietéticas. Además, la hidrofobicidad de las caseínas, explica por qué sus hidrolizados tienen una alta propensión al sabor amargo, que causa defectos sensoriales en muchos tipos de queso 44. El punto isoeléctrico de todas las caseínas está alrededor de 4,4 y 5,8, lo que favorece su precipitación bajo condiciones de acidez. Así, las propiedades moleculares de las caseínas facilitan procesos industriales para obtener productos con valor agregado, de ahí su importancia en la selección de leches con características deseables y de la optimización de los procesos industriales para la elaboración de productos lácteos de buena calidad.
Estructuras micelares de caseína
Las caseínas, junto con el fosfato de calcio, forman agregados de miles de moléculas de proteínas individuales, conocidas como estructuras micelares de caseína en la leche líquida 46. Estas estructuras son termoestables y altamente hidratadas, lo que significa que, de cada 4,5 g de micelas de caseínas, 3,5 g son de agua y 1 g de proteína 47. Por lo tanto, aunque las caseínas constituyen aproximadamente el 2,5% del peso total de la leche, las micelas ocupan alrededor del 10% de su volumen 48, exhibiendo una estructura porosa muy voluminosa. Las micelas de caseína pueden calentarse o enfriarse moderadamente sin una agregación o alteración significativa de sus estructuras básicas. Sin embargo, las caseínas se desestabilizan fácilmente por tratamiento con enzimas proteolíticas o por acidificación; conllevando a la coagulación de la leche, que es la base en la elaboración de una gran variedad de quesos y leches ácidas. Durante este proceso, las caseínas se desnaturalizan por el rompimiento de interacciones débiles entre los residuos de aminoácidos de la estructura proteica o por el rompimiento de enlaces covalentes, que conducen a una subsecuente exposición de sus estructuras hidrofóbicas al medio acuoso, lo que obliga a que moléculas de caseínas se agreguen unas con otras formando el coagulo.
Tamaño y composición micelar de las caseínas
Cada micela de caseína está formada por un 92% de caseína y un 8% de sales inorgánicas, principalmente fosfato cálcico coloidal, que le confiere importantes propiedades fisicoquímicas de interés funcional a la leche. La composición nativa de las micelas de caseína, depende de su tamaño. Varios estudios han demostrado que las micelas más pequeñas son relativamente ricas en κ-caseína y bajas en β-caseína, mientras que los contenidos de αs-caseínas parecen ser independientes del tamaño 49. La κ-caseína es predominante en la superficie de la micela, la β-caseína está presente principalmente en el interior y las αs-caseínas se encuentran en toda la estructura micelar. En cualquier tipo de leche, hay un rango de diámetros de micelas de caseínas de 50 a 500 nm (promedio 150 nm) 46 (Tabla 4).
Los tamaños de las micelas nativas están determinados por la cantidad de superficie que se puede estabilizar por la κ-caseína disponible, por lo tanto, cuanto mayor es la proporción de κ-caseína presente en la proteína total, más pequeñas son las micelas 50, y esto es una ventaja, ya que las micelas pequeñas retienen mayor cantidad de sólidos al momento de la coagulación mejorando así la firmeza del coágulo y, por ende, la calidad del queso.
Modelos estructurales de las micelas de caseína
La estructura de las micelas de caseína, ha sido estudiada ampliamente durante muchos años, y esto ha sido importante para comprender sus reacciones, que han sido fundamentales para muchos procesos lácteos como la producción de quesos, estabilidad de leches esterilizadas, condensadas y reconstituidas.
Varios modelos sobre la estructura micelar de las caseínas han sido planteados. El primer modelo fue propuesto por Waugh (1971) 51, quién describe a la micela como una estructura tipo roseta, muy similar a la de una micela clásica de jabón; en este modelo, se propone que las regiones polares de αs1-caseína, β-caseína y κ-caseína están orientadas hacia el exterior de la submicela para reducir la repulsión electrostática entre los grupos vecinos cargados y cada micela está rodeada por una monocapa de moléculas de κ-caseína, proporcionando una envoltura a la estructura micelar (Figura 1a).
Otro modelo fue propuesto por Schmidt (1982) 52, quien sugirió que las caseínas se agregan primero, a través de interacciones hidrofóbicas en subunidades de 15 a 20 moléculas cada una, formando submicelas. El patrón de interacción es tal que produce una variación en el contenido de κ-caseína de estas estructuras. Aquellas submicelas ricas en κ-caseína se agregan en la superficie de la estructura micelar formada, mientras que las submicelas pobres o totalmente deficientes en κ-caseína, se ubican en el interior de dicha estructura. En este modelo se establece que la unión entre las submicelas interiores se da con la interacción de fosfato de calcio coloidal (PCC), generando así una micela total con una capa superficial rica en κ-caseína (Figura 1b).
Walstra & Jenness (1984) 53, propusieron que la región hidrofílica del C-terminal de la κ-caseína sobresale de la superficie, formando una capa de 5 a 10 nm de espesor, dando a las micelas una apariencia “peluda”. Esta capa vellosa es responsable de la estabilidad de las micelas, a través de importantes contribuciones a la estabilización estérica y al potencial zeta (20 mV), dada su naturaleza electrostática. Además, se propuso que las submicelas están unidas mediante moléculas de PCC (Figura 2a).
Sin embargo, este modelo fue modificado por Walstra et al. (1999) 54,55, quienes propusieron que, en lugar de vincular las submicelas como lo proponen Walstra & Jenness (1984) 53, el PCC está ubicado dentro de las submicelas, que se mantienen unidas mediante interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno y PCC (Figura 2b). Walstra (1999) 54, además sugirió que cuando se forman submicelas en la glándula mamaria, al principio contienen poco o ningún PCC. Posteriormente, el PCC se deposita en las submicelas, lo que reduce su carga negativa, su tamaño y conduce al autoensamblaje de las estructuras micelares.
El modelo de unión dual, definido por Horne (2002) 56, propone que αs1-caseína tiene dos regiones hidrofóbicas y una hidrofílica, que incluye el grupo de fosfoserina, y que puede vincular dos moléculas vecinas de αs1-caseína, αs2-caseína o β-caseína, a través de las secuencias hidrofóbicas y a una tercera molécula que puede ser αs1-caseína, αs2-caseína o β-caseína, integrada a través de nanocristales de PCC unidos a residuos de serina. La αs2-caseína tiene dos grupos hidrofóbicos y dos grupos fosfoserina y puede unirse a αs1-caseína, a través de cualquier tipo de grupo y así extender la red. La β-caseína, con un solo grupo hidrofóbico y un grupo fosfoserina, puede unirse a αs1-caseína o αs2-caseína, ya sea hidrofóbicamente o mediante PCC. La κ-caseína tiene una región N-terminal hidrofóbica, pero no posee fosfoserina, por lo que interactúa hidrofóbicamente con las otras caseínas, pero al hacerlo, no puede extender la red, conllevando a un cese en el crecimiento de las micelas (Figura 3a).
El modelo más reciente de micelas de caseína es el nanocluster, propuesto por De Kruif & Holt (2003) 57. En este modelo, el PCC se dispersa como pequeños puntos en una matriz proteica homogénea (un nanogel) y desde cuya superficie se extiende la región C-terminal de la κ-caseína, formando así una capa “peluda” (Figura 3b). La base del modelo de nanocluster se fundamenta en la idea de que las caseínas fosforiladas se unen a los nanoclusters en crecimiento a fin de evitar la formación de estructuras calcificadas en la glándula mamaria. Las colas de proteínas que sobresalen de los nanoclusters se asocian con otras proteínas, a través de una colección de interacciones débiles para formar una matriz proteica homogénea.
Si bien, se ha realizado un sinnúmero de estudios para explicar la verdadera estructura de la micela de caseína, ésta aún no es comprendida con suficiente minucia, por lo que se debe aunar esfuerzos para ampliar el conocimiento sobre la estructura micelar de las caseínas y su aprovechamiento en la industria láctea.
El estudio de la estructura de las caseínas y de las micelas que estas forman, es fundamental para un mejor entendimiento de las propiedades fisicoquímicas de la leche y de sus derivados. La composición de aminoácidos, sus niveles jerárquicos estructurales (estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria), les confieren una alta solubilidad por su carácter aniónico a pH neutro, principalmente por las cadenas laterales de los aminoácidos de fosfoserina, ácido glutámico y otros, pero su solubilidad se reduce progresivamente a medida que se disminuye el pH hasta valores iguales o cercanos al punto isoeléctrico, como consecuencia de la elevada proporción de aminoácidos apolares en las estructuras globulares de las proteínas, que promueven la agregación proteica. Todo inicia cuando las proteínas pierden cargas negativas, al reaccionar con el ion hidronio [H3O+], presente en el medio ácido, perdiéndose interacciones electrostáticas entre las cadenas polipeptídicas, conllevando a una desnaturalización de las caseínas y a su vez a una desestabilización de las micelas, que conduce a una agregación de las mismas, lo cual se ve reflejado en la formación de partículas sólidas en la leche.
Clasificación y genética de las caseínas
Las caseínas son codificadas por una familia de genes que cubren una región genómica de 250 kb, situada en el cromosoma 6 (6q31) en el ganado bovino 31. Los genes que codifican las caseínas lácteas, están organizados en el siguiente orden: CSN1S1, CSN2, CSN1S2 y CSN3, los tres primeros, se encuentran dentro de un locus que cubre una región de 140 kb, mientras que el gen que codifica para κ-caseína, se encuentra en una región de 95 - 120 kb. En un estudio realizado por Zhou et al. (2019) 58, fueron identificadas 16 regiones genómicas en BTA6 (87,19 - 87,21 Mbp) que se asociaron con αs1-CN, αs2-CN, β-CN, κ-CN, β-LG, índice de caseína y rendimiento de proteína. Este segmento incluyó el grupo de genes de caseína que contiene los genes CSN1S1, CSN1S2, CSN2 y CSN3, que codifican la caseína αs1, αs2, β y κ, respectivamente (Figura 4).
Los genes de caseínas contienen muchos exones pequeños y una baja proporción entre exones e intrones (Figura 5). Además, poseen múltiples copias de repetición denominadas transposones 59.
Descubrimiento de las variantes genéticas de las caseínas en bovinos
Las investigaciones sobre la variabilidad genética de las proteínas de la leche comenzaron hace más de 60 años mediante la detección de las principales variantes de β-LG bovina 10. Los primeros estudios se basaron en el polimorfismo proteico. Con los adelantos técnicos en biología y molecular, se intensificaron los estudios sobre la genética de las caseínas, descubriendo varios polimorfismos importantes en especies y razas bovinas 11,12. Las variantes genéticas pueden resultar en cambios de nucleótidos, deleciones e inserciones de nucleótidos. En la actualidad existen 40 variantes: 9 del gen CSN1S1 (A, B, C, D, E, F, G, H, I), 4 del gen CSN1S2 (A, B, C, D), 13 del gen CSN2 (A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F, G, H1, H2, I) y 14 para el gen CSN3 (A, A1, B, B2, C, D, E, F1, F2, G1, G2, H, I, J) en el género Bos, es decir, Bos taurus (bovino taurino), Bos indicus (cebú), Bos grunniens (yak) y Bos javanicus (banteng de Bali) 15,40,62 (Tabla 5). Es importante considerar que la genética es un factor que interviene en la variabilidad en cuanto a la cantidad y composición de las proteínas de la leche, como cualquier carácter cuantitativo genético, con heredabilidades moderadas. Las diferentes variantes genéticas de las caseínas son controladas por genes autosómicos, los cuales se transmiten desde los padres a la descendencia en forma mendeliana.
αS1-caseína (gen CSN1S1)
La αS1-caseína es la proteína mayoritaria de las micelas de caseína (39 - 46%), codificada por el gen CSN1S1. Está compuesta por 199 aminoácidos, de los cuales ocho son residuos de serina fosforilados en las cadenas laterales, y posee una masa molecular de 23,62 kDa 42. El gen CSN1S1 tiene una extensión de aproximadamente 17,5 kb, se encuentra ubicado en el cromosoma 6 y está conformado por 19 exones y 18 intrones (Figura 5a). Estudios recientes, identificaron nueve variantes genéticas del gen CSN1S1 (A, B, C, D, E, F, G, H, I) 12.
Para el gen CSN1S1, el alelo más común es B, seguido de C. Estas formas de alelos se pueden encontrar en todas las razas de ganado. Estudios de asociación realizados en animales caracterizados genéticamente para esta proteína, evidenciaron que los individuos CSN1S1 BB tenían un rendimiento en volumen de leche significativamente mayor que los animales CSN1S1 BC 86. Estas observaciones indican la existencia de una fuerte asociación entre el alelo B y una mayor producción lechera. Sin embargo, otros estudios realizados no encontraron asociaciones significativas entre los genotipos de CSN1S1 con producción lechera en vacas de raza Holstein, ya que el alelo B se encuentra próximo a la fijación; este hecho podría haber sido consecuencia de la fuerte presión de selección ejercida sobre dichas razas durante el último siglo. Por esta razón se ha hecho difícil llevar a cabo estudios de asociación entre los genotipos de CSN1S1 y los caracteres de producción lechera 86,87).
En cuanto a su estructura espacial, la αs1-caseína está formada por un dominio hidrofóbico en el extremo C-terminal (100 - 199), compuesto mayoritariamente por hojas plegadas beta y por un dominio hidrofílico en el extremo N-terminal (1 - 99). Además, la αs1-caseína precipita por la unión del calcio (sensible al calcio) a sus residuos de fosfoserina en las concentraciones de proteína y calcio que se encuentran en la mayoría de las leches 42,88.
αS2-caseína (gen CSN1S2)
La αS2-caseína es codificada por el gen CSN1S2, contiene 207 aminoácidos, representa entre el 8 y 11% del total de la caseína de la leche, posee una masa molecular de 25,23 kDa. El gen CSN1S2 se encuentra ubicado en el cromosoma 6 y está conformado por 18 exones y 17 intrones (Figura 5b). Según Caroli et al. (2009) 12, el gen CSN1S2 posee cuatro variantes genéticas (A, B, C, D). Además, tiene 2 moléculas de cisteína en las posiciones 36 y 40 27,89. La αS2-CN es más hidrofílica que la αS1-CN, ya que tiene tres zonas polares y sólo una región no polar con aminoácidos hidrofóbicos y carga neta positiva, y al igual que la αS1-caseína precipita en presencia de iones calcio 88.
κ-caseína (gen CSN3)
La κ-caseína es una proteína codificada por el gen CSN3, está conformada por 169 aminoácidos 13, representa entre el 8 y 15% del total de la caseína de la leche, se encuentra en la superficie de la estructura micelar 52, y posee un peso molecular de 19 kDa. La κ-caseína no es sensible a la presencia de calcio, pero puede interactuar con las caseínas insolubles a este ion y las estabiliza para iniciar la formación del estado coloidal estable 88.
El gen CSN3 tiene una extensión de aproximadamente 13 kb, se encuentra ubicado en el cromosoma 6 y está conformado por 5 exones y 4 intrones 90) (Figura 5c). Se han reportado 14 variantes genéticas (A, A1, B, B2, C, D, E, F1, F2, G1, G2, H, I, J) para el gen CSN3 bovino 12. Los alelos A y B son los más frecuentes, corresponden a regiones variables en los codones 136 y 148 del tercer exón; la variante A contiene treonina en el codón 136 (ACC) y ácido aspártico en el 148 (GAT), mientras que la variante B contiene isoleucina (ATC) y alanina (GCT) en los mismos sitios antes señalados 91.
Algunos estudios sugieren que el gen CSN3 explica hasta el 25% de la varianza fenotípica total de la concentración de las proteínas lácteas en la raza Holstein-Friesian 32,92. La variante A del gen CSN3 es la más común en la mayoría de las razas lecheras con excepción de la Jersey 93, en la que el alelo de mayor frecuencia es el B. Cada alelo confiere características específicas en los animales que los poseen; el alelo A se asocia a una mayor producción de leche 94 y a un mayor tiempo de coagulación y el alelo B ha sido asociado a una menor edad al primer parto en las vacas jóvenes que los poseen y con una disminución en el porcentaje de grasa 59. Además, la variante alélica B se ha asociado con un aumento en el rendimiento y calidad de los quesos, en comparación con la variante alélica A, de tal manera que los productos elaborados con leche proveniente de animales BB, poseen un mayor contenido proteico, que resulta en una cuajada más firme, en un menor tiempo de coagulación y cerca del 5 a 10% más en el rendimiento quesero, lo que hace que estas características sean de gran importancia para la industria láctea 95,96,97) y para el mejoramiento genético de las razas de ganado bovino.
La leche derivada de animales homocigóticos AA, tiene menor porcentaje de κ-caseína, y como consecuencia de esto, una mayor proporción de micelas grandes. Por el contrario, la leche de animales homocigóticos BB, presenta mayor proporción de κ-caseína y micelas más pequeñas, provocando la formación de un cuajo más firme y una mayor retención de sólidos 59.
El gen CSN3 tiene una secuencia nucleotídica que determina sus interacciones y su funcionalidad en la proteína codificada, tales como la interacción con las caseínas sensibles al ion calcio para formar las micelas; su capacidad para interactuar con el medio acuoso gracias a su estructura anfipática y la secuencia de aminoácidos específica donde actúa la quimosina para la reacción de proteólisis, que permite la eliminación selectiva del dominio polar, dando inicio a la coagulación de las micelas. Al no ser sensible al ion calcio, cuando se agrega quimosina, esta actúa sobre la κ-caseína, fraccionándola en dos partes, la hidrofílica y la hidrofóbica. Al separarse la fracción hidrofílica, esta, ya no cumple la función de estabilización de las micelas, lo que provoca la precipitación de las demás caseínas. Este proceso es más eficiente en leches con κ-caseína tipo B, considerando que es una proteína más hidrofóbica, por la presencia de dos residuos de aminoácidos apolares adicionales, que en leches con κ-caseína tipo A que posee dos residuos de aminoácidos polares en las mismas posiciones de la cadena polipeptídica.
β-caseína (gen CSN2)
La β-caseína es una proteína codificada por el gen CSN2, está compuesta por 209 aminoácidos 13,98, y constituye aproximadamente el 37% del total de la caseína de la leche 29. Es la más hidrofóbica de todas las caseínas 99, posee un peso molecular de 26,6 kDa y forma junto con las α-caseínas, el núcleo en la micela que interactúa con los iones de calcio 52,88. El gen CSN2 se encuentra ubicado en el cromosoma 6 y está conformado por 9 exones y 8 intrones (Figura 5d) y es el más polimórfico dentro de los genes que codifican para las caseínas, con 13 variantes genéticas (A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F, G, H1, H2, I) (Tabla 6) 13,40,62, siendo los más frecuentes: A1, A2, A3, B y C 100,101,102.
Al final de la década de 1990, algunas investigaciones sugirieron que el consumo de leche de vaca que contenga la variante A1 de la β-caseína es un factor de riesgo de diabetes mellitus tipo 1 103, cardiopatía isquémica, aterosclerosis, autismo, esquizofrenia, síndrome de muerte súbita del lactante (SIDS) y alteraciones neurológicas 104,105,106. Se ha determinado que la variante A1 de la β-caseína produce el péptido bioactivo beta-casomorfina-7 (BCM-7) 107 mediante el proceso de digestión con enzimas pancreáticas, este heptapéptido atraviesa las microvellosidades intestinales y sistémicamente conduce al desarrollo de estas enfermedades 105. Por esta razón, existe un creciente interés mundial en el consumo de leche tipo A2. Por lo cual, es importante realizar investigaciones encaminadas a conocer la genética de las vacas y toros y su relación directa con la calidad sanitaria de la leche, que conduzca al consumo de productos lácteos inocuos para la salud humana. Sin embargo, también es importante desarrollar investigaciones que indaguen con mayor profundidad el desarrollo de enfermedades a causa del consumo de leche que contenga β-caseína A1, ya que las investigaciones en este tema son escasas y no hay suficiente claridad sobre la patogenia causada por el consumo de esta proteína.
De acuerdo con la variabilidad genética del gen CSN2, se ha identificado que las vacas portadoras de los alelos A1 y A2 en su genotipo, producen mayor porcentaje de proteína y mayor producción de leche 8,94. Además, el alelo A1 ha sido asociado con un alto porcentaje de lactoalbúmina en leche, mientras que los alelos A2 y A3 han sido relacionados con un aumento en el porcentaje de proteína y en el caso particular del alelo A2, confiere propiedades reductoras de colesterol y triglicéridos en la leche 8. Así mismo, el alelo B se asocia a un mayor porcentaje de proteína en la fracción de caseínas, mayor producción de leche y grasa 108 y el alelo C se relaciona con una mejor firmeza del coágulo de la leche y mayor producción de proteína 109.
La β-caseína A2 se ha originado desde hace más de 10.000 años y no se han identificado efectos negativos sobre la salud humana. Sin embargo, hace aproximadamente unos 8.000 años, se produjo una mutación natural de un solo gen, en ganado Holstein, lo que resultó en la producción de la proteína β-caseína A1 en esta raza 110. Lentamente, esta variante genética se ha ido convirtiendo en una de las variantes alélicas más frecuentes en razas bovinas lecheras, debido a la fuerte selección genética de estos animales. En la posición 67 de la cadena peptídica, de la β-caseína, la prolina en la variante A2, se sustituye por histidina en la variante A1 111,112. La variante A1 es más común en las razas lecheras populares en todo el mundo, como son la Holstein-Friesian, Red Danish, Ayrshire, Shorthorn y otras, mientras que la variante A2 es más frecuente en las razas Bos taurus: Jersey, Guernsey, Charolais, Limusina, razas Bos indicus, leche humana y otros (ovejas, cabras, burros, yaks, camellos, búfalos, etc). Las leches de vacas Holstein-Friesian, contiene principalmente β-caseína A1. La raza Holstein (la raza de vaca lechera más común en Australia, el norte de Europa y los Estados Unidos) comprende las formas A1 y A2 de β-caseínas en cantidades aproximadamente iguales. Más del 50% de la raza Jersey lleva la variante de β-caseína A2, y más del 90% de la raza Guernsey tiene la misma variante genética 111.
Algunas empresas de productos lácteos, han clasificado la leche como tipo A1 o tipo A2, a partir de pruebas de genotipificación del gen CSN2 en vacas y sementales, garantizando una eficiente selección. A partir de esto, las compañías The A2 Milk Company, Dairy Farmers, Norco y otras, tienen su marca registrada como leche A2, la cual es vendida principalmente en Australia, Nueva Zelanda, Reino Unido y otros países desarrollados 113. Según lo descrito anteriormente, es importante desarrollar estrategias que busquen disminuir la frecuencia del alelo A1 de la β-caseína como, por ejemplo, inseminación de vacas con semen de toros sementales con genotipo A2A2, el cual ya viene registrado en algunos catálogos comerciales, la genotipificación de los animales en los hatos lecheros para la identificación de los alelos A1 y A2 y posterior descarte en procesos de selección de animales con genotipo A1A1, crianza de animales de razas cuyo genotipo reportado sea el A2A2, tales como Jersey, Guernsey o razas Bos indicus y por último, realizar la clasificación de la leche como tipo A1 y A2, para su respectiva clasificación y comercialización.
Genómica de las caseínas de la leche
Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS, Genomic wide association studies) se han utilizado ampliamente, para determinar la arquitectura genética de rasgos cuantitativos en ganado lechero 58. La composición de la proteína de la leche es un rasgo complejo que está influenciado por factores genéticos, no genéticos y su interacción, que incluyen la raza, el hato, la etapa de lactancia, entre otros factores. Algunos estudios han demostrado que la composición de las proteínas de la leche bovina es hereditaria, con estimaciones de heredabilidad que van desde 0,26 a 0,80. Así la heredabilidad para αs1-CN, αs2-CN, β-CN, κ-CN son 0,47; 0,73; 0,26 y 0,63 respectivamente en ganado Holstein-Friesian 114. En los últimos años, se han detectado varios loci de características cuantitativas (QTL, quantitative trait loci) para composición de proteínas de la leche, utilizando mapeo de QTL y análisis de genes candidatos 115,116. Schopen et al. (2011) 114, realizaron una investigación sobre GWAS, identificando regiones del genoma bovino asociadas con la composición de proteína de la leche en los cromosomas 5, 6, 11 y 14. En el cromosoma 6 (BTA6), identificaron regiones genómicas asociadas a un aumento en leche, de las proteínas αs1-caseína, αs2-caseína, β-caseína y κ-caseína, en BTA5 a la α-lactoalbúmina y en BTA11 a la β-lactoglobulina. Además, identificaron regiones genómicas con efecto significativo sobre las fracciones de las proteínas de la leche: regiones genómicas en BTA13 y BTA22 con efectos sobre αs1-caseína; regiones genómicas en los BTA: 1, 9, 10, 17, 19 y 28 con efectos sobre αs2-caseína; en BTA6 con efecto sobre β-caseína y en BTA13 y BTA21 con efectos sobre κ-caseína 114.
En otro estudio realizado por Zhou et al. (2019) 58, se identificaron un total de 21 regiones genómicas en el cromosoma BTA1, asociadas con αs1-CN, αs2-CN, β-CN, κ-CN, β-LG, índice de caseína y rendimiento de proteína, usando el Illumina BovineSNP50 Bead Chip en ganado Holstein chino. Además, fueron identificadas un total de 13 regiones genómicas en BTA13, las cuales están asociadas con αs1-CN, αs2-CN, β-CN y rendimiento de proteína. En BTA18, un total de 14 regiones genómicas que igualmente fueron asociadas con αs1-CN, αs2-CN, κ-CN, rendimiento de proteína y porcentaje de proteína. Así mismo, Scarcia et al. (2017) 117, ubicaron 11 regiones genómicas que fueron asociadas con β-CN y que comprenden una longitud de 47,72 a 47,85 Mbp en BTA21, que contiene el gen SLC25A21, el cual codifica una proteína que participa en el metabolismo de los aminoácidos.
Pegolo et al. (2018) 118, realizaron un GWAS, con una población de 1011 vacas de raza Pardo Suizo, las cuales fueron genotipificadas con el Illumina BovineSNP50 v.2 Bead Chip. En el estudio analizaron 37568 SNP, de los cuales identificaron 170 SNP en los BTA6 y BTA11, involucrados en varias funciones fisiológicas, tales como transporte de iones, señalización neuronal y hormonal asociadas a la formación, estructura y función de las micelas, dando una visión novedosa de los mecanismos reguladores que controlan la síntesis y secreción de proteínas de la leche en la glándula mamaria bovina. Este tipo de estudios son importantes, ya que muestran que la selección para fracciones de proteína individuales de la leche, podría ser más efectiva que la selección basada en proteína total, especialmente en programas de mejoramiento genético destinados a mejorar las propiedades nutricionales y tecnológicas de la leche.
Como se evidencia en las anteriores investigaciones, la selección genómica es una herramienta de gran utilidad en la actualidad, ya que permite realizar procesos de selección de bovinos en menor tiempo usando valores estimados de cría genómicos (GEBV, del inglés Genomic Estimated Breeding Value), además los microchips genómicos de alta densidad, permiten genotipificar animales para múltiples marcadores genéticos, desde 10.000 hasta 800.000 SNP, incluyendo las variantes de los genes de las caseínas y asociar dichas variantes a diferentes rasgos fenotípicos 119. El notable progreso de la genómica ha permitido la selección de animales superiores con una alta confiabilidad, ha logrado controlar los efectos negativos de la depresión endogámica y ha conllevado a avances económicos efectivos en la eficiencia de la producción de alimentos. Así mismo, el intercambio de millones de datos genómicos de referencia entre países ha permitido un aumento de la confiabilidad en las evaluaciones genómicas, logrando grandes avances en el progreso genético. Sin embargo, se debe ampliar la información genómica de características que involucren el contenido de caseínas en la leche, estabilidad micelar, mecanismos de ensamblaje, formación y crecimiento micelar, genes de regulación de las caseínas, entre otros, que permitan un mejor aprovechamiento tecnológico de la industria lechera.
Conclusiones
El estudio de la estructura micelar de las caseínas, sus propiedades y la genética de estas proteínas, es fundamental para un mejor entendimiento, aprovechamiento y control de su funcionalidad en los procesos complejos de la industria láctea, que permite cada vez mejorar y crear nuevos productos para el consumo humano. El contenido y la composición de las proteínas lácteas, influyen directamente sobre las propiedades tecnológicas de la leche y, por lo tanto, son importantes para la industria del queso y de otros productos de la industria lechera. La coagulación de la leche, la estructura y firmeza de la cuajada y el rendimiento del queso están directamente relacionados con el contenido de caseína, principalmente de κ-CN.
El incremento en la producción y el consumo de leche y derivados lácteos, implica nuevos retos para la producción primaria, en la industria lechera y consecuentemente para la salud humana. Esto significa que se debe producir leche y productos lácteos inocuos, para evitar alergias alimentarias y desarrollo de patologías asociadas al consumo de estos alimentos, por lo cual se requieren más investigaciones que permitan generar nuevo conocimiento para esclarecer mecanismos aun no conocidos sobre la intolerancia al consumo de estos alimentos en un porcentaje significativo de la población.
Las tecnologías de secuenciación genómica y de genotipado, y las nuevas herramientas estadísticas han impulsado el desarrollo de la selección genómica y el uso de marcadores moleculares como herramientas de gran utilidad, ya que permite realizar procesos de selección de animales en menor tiempo, usando valores estimados de cría genómicos (GEBV) y puede además, facilitar la selección usando variables específicas, tales como el contenido de k-caseína, β-caseína o (-caseína, haciendo la selección más efectiva que la selección animal clásica, basada en variables generales, especialmente en programas de mejoramiento genético encaminados a mejorar y optimizar el valor nutricional de la proteína de la leche en relación con la salud humana y, al mismo tiempo, maximizar los beneficios económicos para la industria láctea.