INTRODUCCIÓN
El bagre de canal (Ictalurus punctatus) es la especie acuícola más importante de los Estados Unidos de América; según el United States Department of Agriculture -USDA- (2017) la producción total en el año 2016 fue de más de 199 millones de libras. Esta producción se centró en los Estados de Mississippi, Alabama, Arkansas y Texas, de donde se origina el 96 % del bagre de canal (Ictalurus punctatus), siendo Mississippi el Estado que más lo produce, con más de 109 millones de libras (phosphate or cetylpyridinium chloride before grinding. United - USDA, 2017). Esta industria tiene un impacto económico en cientos de millones de dólares por año (Mississippi Agricultural and Forestry Experiment Station - MAFES, 2010). En Estados Unidos el bagre de canal (Ictalurus punctatus) es comercializado en fresco (en hielo) o congelado como filetes, tiras y nuggets; algunos de los productos son apanados o marinados. También es importado congelado de varios países de Asia, especialmente de China (Burtle, 2010).
La salmonelosis, causada por la bacteria Salmonella, es una de las enfermedades de transmisión alimentaria más comunes y ampliamente extendidas. Se estima que afecta anualmente a decenas de millones de personas de todo el mundo y provoca más de cien mil defunciones. La Salmonella es una bacteria omnipresente y resistente que puede sobrevivir varias semanas en un entorno seco, y varios meses en agua (Organización Mundial de la Salud - OMS, 2013).
Estudios realizados a plantas procesadoras de bagre de canal (Ictalurus punctatus) y a productos pesqueros muestran que estos poseen peligros tanto microbiológicos, como químicos y físicos para los consumidores; el 27 % de estos peligros fueron por patógenos microbianos; 14 %, por desmembramiento; 3 %, por químicos, y 53 %, por otros (mayormente por microorganismos alterantes) (General Accounting Office - GAO, 2001). De acuerdo con lo reportado por Center for Chemical Regulation and Food Safety (2010) los microorganismos patógenos más frecuentes fueron Salmonella spp (67,6 %) y Listeria monocytogenes (21,6 %). Salmonella spp resiste bien las condiciones habituales de humedad y de temperatura ambiente, y es capaz, bajo determinadas situaciones, de crecer y desarrollarse en los alimentos y los entornos de procesamiento (Wyatt, Nickelson y Vanderzant, 1979).
A pesar de que algunos estudios confirman que Salmonella spp es el segundo patógeno mayormente encontrado en filetes de bagre de canal (Ictalurus punctatus), después de Listeria monocytogenes (Chen, Pyla, Kim, Silva y Jung, 2010) y es el microorganismo que más comúnmente causa enfermedades transmitidas por alimentos (Center for Chemical Regulation and Food Safety, 2010), son muy pocos los brotes asociados a Salmonella spp por el consumo de bagre de canal (Ictalurus punctatus). En los últimos 20 años en Estados Unidos solo se ha reportado un brote (10 personas enfermas en mayo de 1991) (Food Safety Inspection Service - FSIS, 2010). Sin embargo, es posible que exista un nivel bajo de casos esporádicos de salmonelosis asociada con bagre de canal (Ictalurus punctatus), que ocurran en los Estados Unidos y que no se detectan con los niveles actuales de vigilancia.
Debido a que no se conoce con exactitud la incidencia de Salmonella spp en productos derivados de bagre de canal (Ictalurus punctatus) y en los equipos utilizados para el procesamiento de esta especie acuícola, el objetivo principal de esta investigación fue evaluar los focos y fuentes de Salmonella spp y ver la incidencia de este microorganismo durante la línea de procesamiento, tanto en productos como en equipos. Los resultados obtenidos de este trabajo resultarán de gran importancia para el sector agroindustrial enfocado en el procesamiento de bagre de canal (Ictalurus punctatus) y para otras industrias acuícolas. Además, apoyada en estos resultados, la empresa podría tomar las medidas necesarias para controlar de mejor manera los puntos críticos de contaminación del microorganismo en cuestión, evitando así enfermedades causadas por el consumo de bagre de canal (Ictalurus punctatus) contaminado con Salmonella spp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Universo y población
La población objeto de estudio que se utilizó para la investigación fue una planta procesadora de bagre de canal (Ictalurus punctatus) del Estado de Mississippi, Estados Unidos. Esta planta se escogió de acuerdo con las necesidades y criterios de la Universidad Estatal de Mississippi. De acuerdo con el flujograma de procesamiento de bagre de canal (figura 1) de la planta, se seleccionaron 4 diferentes tipos de filetes (antes de enfriamiento, después de enfriamiento, inyectado y congelado), pescado entero, vísceras, agua de enfriamiento, agua proveniente del camión que transporta los peces vivos, 7 equipos y 1 recipiente de almacenamiento provisional, todos estos tienen contacto directo con el alimento. Los criterios para la escogencia de estos puntos fueron: superficies utilizadas en otros estudios similares, superficies consideradas como puntos críticos debido a que están en contacto directo con el pescado, superficies en las que se dificulte la limpieza y desinfección y superficies en las cuales no se esperaría incidencia de los microorganismos a estudiar.
Variables
Variables independientes: tipo de muestra: equipos, aguas, filetes, pescado entero y vísceras de bagre de canal (Ictalurus punctatus); estaciones del año (invierno y primavera).
Variables dependientes: Salmonella spp
Lugares de muestreo
Todas las muestras utilizadas fueron obtenidas de una planta local procesadora de bagre de canal (Ictalurus punctatus), transportadas en neveras y procesadas inmediatamente en el laboratorio de Microbiología e Inocuidad de los Alimentos, Nutrición y Promoción de la Salud de la Universidad Estatal de Mississippi.
Este estudio se realizó durante invierno y primavera. Se determinó Salmonella spp en los productos y equipos que muestran las tablas 1 y 2; en las mismas se aprecian sus respectivos códigos y la cantidad de muestras que se tomaron en cada uno, para un total de 450 muestras (225 tomadas en invierno y 225 en primavera).
Toma de muestras
En la planta procesadora de bagre de canal (Ictalurus punctatus) las muestras de equipos y las muestras de piel del pescado fresco fueron obtenidas con hisopos estériles sobre un área específica de 10 cm2; estos aplicadores fueron situados en tubos de ensayo que contenían 1mL de agua peptonada al 0.1 % (Johansson, Rantala, Palmu y Honkanen-Buzalski, 1999) y tapados. Las otras muestras obtenidas de la planta fueron coleccionadas en bolsas estériles y todas fueron transportadas refrigeradas.
Aislamiento de Salmonella spp
Salmonella spp fue aislada utilizando el método del manual Especificaciones microbiológicas del laboratório en el capítulo titulado "Aislamiento e identificación de Salmonella para carne, aves de corral, huevos pasteurizados y productos del bagre" del FSIS-USDA (2010). Los resultados obtenidos fueron comparados con los límites microbiológicamente aceptados para pescado fresco (n = 5; c = 0; m = 0 y M = -) (ICMSF, 1986).
Identificación y confirmación de Salmonella spp. Simple PCR (Polymerase chain reaction)
La confirmación de Salmonella spp fue realizada usando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la amplificación in vitro del ADN (Gussow y Clackson, 1989).
Para este procedimiento se tomaron colonias presuntivas de Salmonella spp de cada caja de petri, luego fueron sembradas e incubadas en 5mL de agua peptonada 0,1 % por 24 horas a 37 °C. Un mL de esta solución previamente incubada fue transferido a tubos de centrífuga y centrifugado a 10.000 g / m por 2 minutos. El pellet se rehidrató con 50 μL de agua destilada, fue agitado y luego se calentó por 5 minutos en un recipiente con agua hirviendo (I00°C). Después del calentamiento los tubos fueron centrifugados a 10.000 g / m por 2 minutos. Luego se tomaron 2μL del sobrenadante, de forward primer (Itsf-5'TATAGCCCCATCGTGTAGTCA 3'), de reverse primer (Itsr - 5'TGCGGCTGGATCACCTCCTT 3') (Sigma®), 7.5 μL de agua destilada y 12.5 μL de GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI) y se adicionaron a tubos de PCR. La ampliación del ADN se realizó de la siguiente manera: ciclo térmico inicial de 94 °C por 3 minutos, seguido de 30 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, anillamiento a 61 °C por 35 segundos y extensión del ADN a 72 °C por 35 segundos (Yánez, Mattar y Durango, 2008).
Los productos obtenidos en la reacción (PCR) se separaron por electroforesis. Para esto se utilizó un gel de agarosa de 1,4 % (Chen, Pyla, Kim, Silva y Jung, 2010) al cual se le adicionaron 5 μL de bromuro de etidio. Este gel fue sometido a 135 voltios de 15 a 20 minutos. Finalmente, se obtuvieron fotografías del Gel bajo luz ultravioleta usando BioDoc-itTM Imaging System (UVP, Upland, CA, USA).
Diseno experimental y análisis de datos
El diseno experimental que se utilizó fue completamente al azar con un arreglo factorial de F = 2*2*8. Se realizó un análisis de varianza y un test de medias, con un nivel de significancia del 5 %. El análisis estadístico de los datos se realizó usando SAS 9.2.
RESULTADOS
Determinación de Salmonella spp en pescado fresco y filetes
Los productos estudiados de la planta procesadora de bagre de canal (Ictalurus punctatus) (pescado entero, filetes antes y después de enfriamiento, inyectados y congelados) durante las estaciones de invierno y primavera mostraron porcentajes de Salmonella spp que sobrepasan los límites permitidos (n = 5; c = 0; m = 0 y M = 0) según la ICMSF (1986) (figura 2), lo que sugiere que se debe prestar mayor atención al proceso que se les da a los productos en cuestión y a los manipuladores de alimentos en estado portador.
Se pudo analizar que sí hubo diferencias significativas en la presencia de Salmonella spp (Pr>F= 0.0001) entre las estaciones de invierno y primavera, pues los productos muestreados presentaron una incidencia del 1,33 % para invierno, y 6 % para primavera. La diferencia en la presencia de Salmonella spp en las estaciones de invierno y primavera puede deberse a que el microorganismo se ve afectado por los cambio de temperaturas que ocurren durante la transición invierno-primavera (Fossler 2005; Liljebjelke, Hofacre, Liu, White, Ayers, Young y Maurer, 2005), donde las temperaturas promedio son 8 °C y 25 °C, respectivamente. Estos resultados son concordantes con los reportados por Narapati (2007), quien encontró niveles más altos de Salmonella spp en primavera (40 %) que en invierno (0 %), y también con estudios realizados en Nepal, donde la prevalencia de Salmonella spp fue más alta en los meses de abril y mayo donde la temperatura promedio es de 26 °C (Maharjan, Joshi, Joshi y Manandhar, 2006).
En la figura 3 se muestra la presencia de Salmonella spp en cada uno de los productos muestreados (diferentes tipos de filetes y pescado entero); existen diferencias significativas entre los filetes congelados y los filetes inyectados con el pescado entero, filetes antes de enfriamiento y después de enfriamiento; en efecto, se aprecian mayores porcentajes del microorganismo en los filetes congelados e inyectados; se aprecia que la presencia de Salmonella spp aumenta luego de que los filetes son inyectados con la solución de tripolifosfato, contrario a lo reportado por otros autores. Luck y Jager (2004) afirman que esta solución en concentraciones entre 10-12 % (p / v) sirve para disminuir los niveles de Salmonella spp, debido a que forma complejos con metales bivalentes esenciales para la célula de los microorganismos, e interfiere con la estabilidad de la pared celular; esto concuerda con estudios realizados por Pohlman, Stivariusb, McElyeaa y Waldroupc (2002) quienes muestran que el tripolifosfato a una concentración de 10 % (p / v) ayuda a inhibir y reduce los niveles de Salmonella spp de 5,87 log UFC/g a 5,19 log UFC/g.
En este estudio el efecto por parte del tripolifosfato es contrario; este fenómeno pudo ocurrir porque la concentración utilizada (5,9 % p / v) está por debajo de la concentración recomendada; por lo tanto, no cumple con su función de antimicrobiano, sino que, por el contrario, tiene un efecto fomentador del crecimiento para este microorganismo. Además, dicha solución es reciclada, proceso que la hace más susceptible a contaminación. También sería conveniente analizar el agua de disolución que se utiliza para la preparación de la solución de tripolifosfato; esta agua puede estar contaminada, provocando la proliferación del patógeno en el producto final.
Determinación de Salmonella spp en vísceras, agua de enfriamiento y agua de camión
El porcentaje de Salmonella spp fue 0 %, tanto para las vísceras como para las aguas, lo que indica que no son las vísceras ni las aguas los elementos que dan origen a la contaminación de los filetes.
Determinación de Salmonella spp en equipos y recipientes
Los equipos estudiados de la planta procesadora de bagre de canal (Ictalurus punctatus) durante invierno muestran un porcentaje de Salmonella spp que sobrepasa los límites permitido según la ICMSF (1986), los cuales son n = 5; c = 0; m = 0 y M = 0, lo que sugiere mayor atención al manejo que se le da a la sanitización de los equipos, ya que estos podrían contaminar el producto final. El análisis estadístico mostró que no hubo diferencias significativas en la presencia de Salmonella spp (Pr>F= 0.4679) entre las estaciones de invierno y primavera, ya que se presentó una incidencia del 2,08 % (1 / 48) para invierno y 0 % para primavera; aunque el resultado de Salmonella spp en invierno es un poco mayor que en primavera, este porcentaje no es significativo para afirmar que la presencia de Salmonella spp siempre será mayor en invierno que primavera, es decir, que para afirmar esto se debe realizar un estudio con un mayor número de muestras y analizar los resultados.
CONCLUSIONES
Se encontró Salmonella spp: en pescado fresco (7 %); filetes inyectados (17 %); filetes congelados (13 %), y en la banda transportadora después de recorte (1,06 %). Esto indica que las prácticas y los programas de higiene y desinfección utilizados para el procesamiento son insuficientes para eliminar este patógeno.