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I. INTRODUCCIÓN
El aguacate (Persea americana) es una fruta correspondiente a la familia de las lauráceas, cuyo origen tuvo lugar en el centro y este de México, y partes altas de Guatemala [1,2]. La evidencia más antigua del consumo de aguacate, fueron encontrados en una cueva en Coxcotlan región de Tehuacán, puebla [3]. En Colombia se han estudiado las variedades nativas desde hace más de 40 años permitiendo evaluar su comportamiento y producción [4], encontrándose 10 especies de gran importancia económica. El aguacate es una fruta de gran contenido nutricional [5,6], utilizada hoy en día como un alimento saludable en todo el mundo. Además, tiene actividad antimicrobiana contra Mycobacterium tuberculosis [7], se cultiva principalmente para el consumo local, con gran potencial exportador, como frutas frescas y procesadas. La problemática en la industrialización del aguacate es el deterioro que se manifiesta en un rápido obscurecimiento. Por sus características fisicoquímicas, es una materia prima difícil de procesar y almacenar [8], esto se debe a la presencia de diversas enzimas que influyen en el proceso de conservación y vida útil del producto, una de ellas es la enzima polifenol oxidasa (PFO) causante del pardeamiento enzimático, la polifenol oxidasa (PFO) es una metaloenzima que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y hongos, en su estructura contiene dos átomos de cobre en el sitio activo que catalizan dos tipos de reacciones usando O2 como agente oxidante: (a) la o-hidroxilación de monofenoles para producir o-difenoles (actividad monofenol monoxigenasa E.C. 1.14.18.1); y (b) la posterior oxidación de o-difenoles a o-quinonas. [9,10], Confinadas generalmente en los plastidios de células vegetales siendo liberadas posteriormente en el citoplasma ocasionando daño a nivel celular y tisular [11], Lo que con lleva a cambios en las propiedades organolépticas y pérdidas en los valores nutricionales [12], haciéndola susceptible a diversas variables como el oxígeno, el pH y la temperatura, que intervienen en su velocidad de reacción y a su vez, se ve influenciada por el efecto de otras enzimas presentes en la pulpa, lo que dificulta su conservación, y así mismo ocasiona una afectación en su vida útil. Algunos trabajos de PPO planteados por [13-16], han descrito la presencia de actividad PPO en fracciones particuladas y solubles del mismo tejido [17]. Es por ello que en la industria de alimentos, la evidencian de las diferencias en las propiedades cinéticas que afectan la actividad de la PFO que puede ser evitada usando tratamientos térmicos [18], lo que conllevaría afectar algunas de sus características. La PFO a medida que aumenta la temperatura incrementa su actividad enzimática [19], limitando la aplicación de diversos métodos de conservación y creando la necesidad de investigar métodos que permitan la inhibición de la enzima sin afectar sus propiedades. Esta investigación pretende estimar la inhibición de la enzima polifenol oxidasa en una pasta de aguacate (Persea Americana) variedad Hass por medio de la cáscara de cebolla (Allium cepa) de dos especies bulbo blanco y de bulbo rojo, que gracias a su composición rica en flavonoides como la quercetina, actúa con un alto poder antioxidante natural [20], [21-23] que interrumpe la interacción que existe en el sustrato enzimático, evitando la reacción oxidativa de la enzima [24], Para ello será sometida a tratamientos térmicos de 100 y 115 °C para evaluar la actividad enzimática, teniendo en cuenta la concentración ideal y el control durante su almacenamiento en factores como el color, pH y temperatura, con la finalidad de emprender en términos de investigación nuevas alternativas en métodos de conservación natural.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó la evaluación de un agente inhibidor a base de cáscara de cebolla (Allium cepa) de bulbo rojo (3.64 Kg) y de bulbo blanco (2.75 Kg) a temperaturas de 115°C y 100°C en una salsa de aguacate (Persea americana) de la variedad Hass como materia prima. Para ello se utilizaron seis tratamientos del agente inhibidor como se expresan en la Tabla I.
A. Elaboración del agente inhibidor
El agente inhibidor se elaboró a partir de los residuos de cascaras de cebolla seleccionando las de menor contenido de humedad, sometiéndose a un proceso de lavado en solución de hipoclorito de sodio al 99% y posterior secado de las mismas, para ser llevadas a un proceso de molienda y obtener una pasta fina, la cual se sometió finalmente a calentamiento a una temperatura de 100°C a un tiempo determinado.
B. Interacción agente inhibidor polifenol oxidasa
La extracción de la enzima Polifenol oxidasa presente en la salsa de aguacate, se trabajó siguiendo la metodología descrito por [25] con modificaciones [26], Para ello se utilizó la solución Tris HCl 100 mM (pH 7.1), con 1 % de polivinil pirrolidona (PVP). Para la evaluación de la actividad enzimática se empleó el Catecol 20 mM como sustrato, disuelto en una solución de Tris HCl, midiendo el cambio de absorbancia a 400 nM en 0,2 ml de sobrenadante del extracto enzimático al adicionarse 3 ml de Catecol a temperaturas entre 22° y 29°C.
C. Evaluación de la actividad enzimática
Se evaluó la actividad enzimática de la Polifenol en respuesta de la adición del sobrenadante del agente inhibidor a concentraciones de (1:1), (1:2) y (2:1) en relación enzima: sustrato. Los tiempos de la lectura que se tuvieron en cuenta fueron de 0, 1, 3, 5, 7 y 10 minutos respectivamente tiempo en el cual se analizó la reacción de la enzima PFO en cada tratamiento.
III. RESULTADOS Y DISCUSIONES
El agente inhibidor se realizó con residuos de cascara de cebolla (Allium cepa) de bulbo rojo y de bulbo blanco, para ello se realizaron pruebas de medición de absorbancia a muestras con diferentes concentraciones, realizadas por triplicado, lo que permitieron medir la existencia o no del efecto inhibidor. Las concentraciones tomadas para su análisis fueron de 1:0, 1.1, 1.2 y 2.1 respectivamente correspondiente a la enzima y a agente inhibidor, tomándose lectura en seis momentos a (t0: tiempo 0, t1: al minuto, t3: tres minutos, t5: cinco minutos, t7: siete minutos y t10: diez minutos), calculándose el promedio de absorbancias de las tres replicas. Para el primer tratamiento se consideró la muestra sin agente inhibidor (concentración 1:0), la lectura inicial o momento cero como patrón o blanco de referente para observar el cambio de absorbancia. El dato registrado con la concentración 1:0 y con cada uno de los cuatro tratamientos estuvo entre 2.875 a 2.876, indicando una variación mínima en los valores, de igual forma, los datos obtenidos al minuto t1, t3, t5, t7 y t10, se percibieron constantes, reiterándose la uniformidad de estos y variación mínima entre la lectura inicial (t0) y la final (t10) de 0.846 a 0.848 (Fig. 1).
Fig. 1, Lectura en seis momentos (minutos) de la absorbancia registrada para los cuatro tratamientos Evaluados en ausencia de agente inhibidor. *
Fig. 2, Lectura de la absorbancia para los cuatro tratamientos evaluados a una concentración con el agente inhibidor de 1:1.
La lectura negativa indica que el dato al minuto diez (t10) fue menor al dato registrado al momento cero (t0). Al evaluar las muestras a una concentración 1:1 se evidencio mayor uniformidad en las lecturas graficadas a partir del uso de cáscara de cebolla bulbo blanco a 115°C (T1) y cáscara de cebolla bulbo rojo a 100°C (T4) (Fig. 2).
TO: tratamiento (T). Las muestras evaluadas a una concentración de (1:2), la mayor uniformidad en los datos se registró a partir del uso de cáscara de cebolla bulbo blanco a 115°C (T1), seguido de cáscara de cebolla bulbo rojo a 115°C (T3) y 100°C (T4). (Fig. 3).
El tratamiento 1 de concentración 1:2, evidenció durante los seis momentos una lectura de 3.00±0.00 de absorbancia, indicando una inhibición total o cercana al 100% de la PFO presente en la salsa de aguacate (Persea americana) variedad Hass. En relación con las muestras evaluadas a una concentración de (2:1), la mayor uniformidad en los datos se registró a partir del uso de cáscara de cebolla bulbo blanco a 115°C (T1) y cáscara de cebolla bulbo rojo a 115°C (T3). (Fig. 4).
De acuerdo con las lecturas de tiempos t10 menos el registro t0, la cáscara de cebolla de bulbo blanco a 115°C (T1) indicó un mayor efecto de inhibición en cualquiera de las tres concentraciones; seguido se puede plantear el uso de cáscara de cebolla bulbo rojo a 100°C (T4) en una concentración de 1:2 o cáscara de cebolla bulbo rojo a 115°C (T3) en una concentración de 1:1 y 2:1.
Fig. 3, Lectura de la absorbancia para los cuatro tratamientos evaluados a una concentración con el agente inhibidor de 1:2.
Fig. 4, Lectura de la absorbancia para los cuatro tratamientos evaluados a una concentración con el agente inhibidor de 2:1.
La PPO mostró mayor sensibilidad a los cambios de temperatura, resultado similar reportaron [27] en su estudio de la estabilidad térmica de la PPO en la batata colorada. Por otra parte, estudios realizados por [28], encontraron que la PPO presente en manzana disminuye un 40% con un tratamiento a 50ºC durante 20 min y en la pera a 70ºC por 30 min. Lo que difiere con la presente investigación. A temperaturas superiores a 50 °C se muestra la poca estabilidad de la enzima (Polifenol Oxidasa), al igual que por largos periodos de almacenamiento y la manipulación en condiciones en las cuales la enzima pierde su actividad [29,30]. La variación en la lectura de absorbancia a partir del uso de cáscara de cebolla bulbo blanca a 100°C (T2), fue mayor en todos los casos, estimándose el menor efecto inhibitorio (Tabla II).
La evaluación de los tratamientos realizados a diferentes concentraciones identificó que el tratamiento T1 obtuvo mayor efecto de inhibición en todas las concentraciones y una inhibición total a concentración 1:2, por lo que se evidencia que el tratamiento de cebolla blanca sometida a temperatura de 115°C es el tratamiento con mayor efecto de inhibición. La variación de la temperatura es un factor que afecta según la especie ya que, la naturaleza proteica de las enzimas su estructura terciaria se ve comprometida cuando se alcanzan elevadas temperaturas, lo que conduce a la pérdida de actividad catalítica [31], para la cebolla blanca su mayor efecto inhibitorio se da al someterse a una temperatura alta. Sin embargo, en la especie de cebolla roja se observa un efecto contrario, a pesar de ello la cebolla roja a 100°C a concentración 1:2 obtuvo una mejor inhibición con respecto a la cebolla blanca a la misma temperatura la cual la hace competitivo para estos tratamientos es decir que los tratamientos según el comportamiento enzimático que obtendrán mejor inhibición serán los compuestos por cebolla blanca a 115°C y cebolla roja a 100°C.
IV. CONCLUSIONES
Se analizó la acción del agente inhibidor sobre la enzima Polifenol oxidasa extraída de aguacate (Persea americana) variedad Hass con lo cual se pudo inferir que la cáscara de la cebolla (Allium cepa) de bulbo rojo y de bulbo blanco posee capacidad inhibidora sobre la enzima Polifenol oxidasa, donde la especie de cebolla blanca a temperatura 115°C obtuvo mayor inhibición con respecto a los demás tratamientos. De acuerdo con las lecturas de las absorbancias se logró determinar que la inhibición total de la enzima se logró a una concentración 1:2, con el tratamiento de cebolla roja sometida a temperatura de 100°C, se obtuvo una inhibición casi total de la enzima. Sin embargo, por las características de lectura no fueron constantes para obtener porcentajes exactos de inhibición de cada tratamiento, afirmándose que la cebolla es un agente inhibidor y se evidencia que el aumento de la temperatura aplicado a la cáscara de cebolla influye de forma positiva para la inhibición de la enzima polifenol oxidasa.
