Introducción

La infección persistente por el virus del papiloma humano de alto riesgo (HPV-H) se considera un factor necesario para el desarrollo de cáncer de cuello uterino y de sus lesiones precursoras (¹,²,³). Al menos 13 genotipos se han encontrado asociados al alto riesgo de desarrollar cáncer cervical y se han definido como carcinogénicos (⁴). Alrededor del mundo, el HPV16 se ha identificado como el virus más frecuente asociado tanto para el carcinoma escamocelular como para el adenocarcinoma, seguido del HPV18 (⁵). El mecanismo carcinogénico conlleva la integración del DNA viral al genoma celular. Posteriormente, hay replicación del DNA viral con particular importancia de la expresión de los genes E6 y E7, que altera las vías celulares de la célula hospedadora (⁶).

La interacción del genoma viral con zonas frágiles de la célula infectada parece ser crucial para la progresión maligna. La inactivación funcional de genes oncosupresoras como p53 y pRb (gen del retinoblastoma) determina la alteración de las vías conducentes a la transformación a cáncer (⁷,⁸,⁹), mediante un estado proliferativo, inestabilidad genética y formación de un clon celular maligno (⁹,¹⁰). La expresión de E7 determina la inactivación de pRb, lo que aumenta la forma libre de E2F en la célula, que a su vez incrementa el inhibidor de cinasa dependiente de la ciclina p16 (p16INK4a) y una proliferación aberrante, la cual se puede observar por el incremento del marcador de proliferación celular Ki-67 (¹¹). Las alteraciones moleculares inducidas por HPV-H se pueden estudiar mediante biomarcadores utilizados sobre muestras de citología, pues representan una herramienta complementaria de valor diagnóstico y pronóstico en pacientes con infección (⁷,¹⁰). Estos permiten diferenciar las infecciones que están alterando el ciclo celular, las cuales son el objetivo en los programas de detección de precoz de cáncer.

La tinción dual p16INK4ay Ki-67 de inmunocitoquímica permite el reconocimiento de células neoplásicas con ciclo celular alterado y la proliferación descontrolada en muestras de citología del cuello uterino (¹²,¹³,¹⁴). La doble tinción de biomarcadores con inmunocitoquímica se usa en muestras reportadas como atipia indeterminada de células escamosas (ASC-US, por sus siglas en inglés) y lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (LSIL, por su sigla en inglés) por citología convencional o citología en medio líquido (CBL) y positivas para DNA-HPV-H (¹⁵,¹⁶,¹⁷,¹⁸). Así mismo, la doble tinción identifica lesiones intraepiteliales de alto grado, con una buena sensibilidad y especificidad (96 % y 83 %, respectivamente). Sin embargo, estos diagnósticos pueden estar sujetos a variabilidad entre observadores y la prueba para HPV de alto riesgo puede llegar a invalidarse por hipocelularidad; en tales circunstancias, la tinción de inmunocitoquímica ayuda en la definición diagnóstica (¹⁹,²⁰,²¹,²²,²³).

La tinción es particularmente útil en el diagnóstico diferencial entre lesiones no neoplásicas (como procesos inflamatorios o cambios celulares asociados a atrofia) y las lesiones verdaderamente premalignas (¹³,²⁴,²⁵,²⁶,²⁷). Los casos de atrofia, metaplasia tubárica, epitelios endometrial y endocervical o metaplasia escamosa (²⁸,²⁹,³⁰) evidencian una positividad inespecífica a p16 (²⁵,³¹,³²); mientras que p16INK4a ha sido altamente específico, con significancia estadística en el tamizaje de mujeres con ASC-US, por una sensibilidad relativa de 0,95 (95 %; IC: 0,89-1,01) y una especificidad relativa de 1,82 (95 %; IC: 1,57-2,12) (⁴).

En el presente trabajo se observó la doble tinción p16 y Ki-67 en extendidos de citología con reporte de atipia escamosa: ASC-US, LSIL y lesión escamosa intraepitelial de alto grado (HSIL, por sus siglas en inglés), lo que permitió estandarizar la metodología e interpretar la inmunocitoquímica. Estos resultados se complementaron con colposcopia y biopsia en los casos pertinentes. En nuestro medio colombiano, el uso de la doble tinción en CBL no se había realizado, por lo que este estudio es pionero en el país.

Materiales y métodos

Tipo de estudio. Estudio observacional analítico de corte transversal con CBL complementada con inmunocitoquímica (p16/Ki-67) en casos diagnosticados como ASC-US, atipia que no permite descartar lesión de alto grado (ASC-H), LSIL y HSIL. Se exploró la utilidad de la prueba de inmunocitoquímica (p16/Ki-67) para captar pacientes con riesgo de progresión a cáncer. A las citologías positivas se les hizo estudios complementarios de inmunocistoquímica, una segunda revisión por ginecólogo, colposcopia y toma de muestra para estudio histológico. El estudio contó con aprobación del Comité de Ética de la institución donde laboran los investigadores.

Población. Se tomaron muestras al universo constituido por 51 mujeres que acudieron voluntariamente a una campaña de toma de citología en la decimotercera Jornada de Salud Ocupacional del Hospital de San José y la Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud (Colombia) en 2013. Se incluyeron las mujeres mayores de 18 años de edad. Se excluyeron mujeres embarazadas (³³) y mujeres sometidas a histerectomía previamente. A las participantes se les explicó la finalidad del estudio, posterior a lo cual firmaron consentimiento informado aceptando ser parte de la investigación.

Variables clínicas. Edad, paridad, tabaquismo, enfermedades de transmisión sexual, edad de inicio de relaciones sexuales, número de compañeros sexuales y métodos de planificación. Estas variables corresponden a la anamnesis estandarizada en el formato de toma de muestra de citología uterina, avalado por el Ministerio de Salud y la Secretaría de Salud de Bogotá. Estas variables se relacionan con el riesgo de la población para desarrollar cáncer de cuello uterino.

Muestras para citología en medio líquido. Inicialmente, se valoró bajo colposcopio del cuello uterino y posteriormente se tomó la CBL (directo al vial), utilizando un citocepillo (Rovers®). Se realizó un extendido por caso, usando el equipo manual (BD PrepMate™ System) para el procesamiento de la CBL, siguiendo las recomendaciones del proveedor. Los extendidos se procesaron y analizaron en la Facultad de Citohistología de la Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud. Se utilizó la coloración de Papanicolaou y su interpretación se basó en los criterios de Bethesda de 2014 (³⁴). La primera lectura la realizó un tecnólogo en citohistología, y los 16 casos reportados con atipia (ASC-US, LSIL y HSIL) los confirmaron dos patólogos. Hubo concordancia en todos los casos. Uno de los patólogos también hizo la revisión del 10 % de los casos negativos, como es la rutina.

Muestra para tinción de inmunocitoquímica. A las muestras residuales interpretadas como positivas (ASC-US, LSIL y HSIL) se les realizó la prueba de inmunocitoquímica del vial (BD SurePath™) guardado a 4 ºC. La inmunocitoquímica se realizó de manera convencional. Se utilizó el CINtec Plus Kit^R siguiendo las indicaciones del proveedor. El kit está diseñado para llevar a cabo un procedimiento de tinción inmunocitoquímica de dos pasos sobre las preparaciones de citología cervical. Se usaron controles positivos y negativos, según la indicación de la casa comercial. El análisis de estas muestras lo realizaron dos patólogos cegados para los resultados morfológicos de cada uno de los casos. El criterio para determinar una muestra positiva fue el hallazgo de una o más células epiteliales que mostraron doble reactividad: tanto citoplasma pardo como núcleo rojo (¹⁰,¹⁹,²³).

A los casos positivos para la prueba p16 y Ki-67 se les realizó una segunda colposcopia por parte de un ginecólogo con experiencia en colposcopia. Se tomaron el cepillado endocervical y la biopsia cervical como patrones de referencia del estudio, un mes después de la primera toma. Estas muestras histológicas fueron leídas por los dos patólogos.

En cuanto a las mujeres con resultado negativo en la citología, se les indicó seguimiento a tres años, mediante el esquema 1-3-3, recomendado por el Ministerio de Salud y Protección Social.

Resultados

Se incluyó el universo de 51 mujeres. Las edades oscilaron entre 18 y 60 años con un promedio de 39,8 y una desviación estándar de 10,3. Las características demográficas de las pacientes con resultado positivo se muestran en la tabla 1.

Tabla 1 Distribución de casos positivos por citología según variables 

MP: método de planificación; ETS: enfermedades de transmisión sexual; NCS: número de compañeros sexuales; IRS: inicio de relaciones sexuales.

De las 51 citologías estudiadas, 35 fueron catalogadas como negativas, y 16, con atipia, que se clasificaron como: ASCU-US (n = 8), LSIL (n = 7) y HSIL (n = 1) (figura 1). La prueba de inmunocitoquímica fue positiva para 3 de los 7 casos reportados como LSIL y para el caso clasificado como HSIL. Los 8 casos reportados por citología como ASC-US fueron negativos para biomarcadores. Las figuras 2 y 3 muestran pruebas positiva y negativa.

Figura 1 Clasificación de los casos 

Figura 2 Muestra positiva 

Figura 3 Muestra negativa 

A quienes tuvieron resultados citológicos positivos, se les hizo una segunda valoración colposcópica. Cuando esta fue anormal, se tomó biopsia o cepillado endocervical (tabla 2). El cepillado fue anormal en 3 de ellas (dos LSIL y una HSIL), y la biopsia, en 2 de las 4 pacientes (dos neoplasias intraepiteliales cervicales I [NIC-I] asociados a HPV). El tratamiento y seguimiento posterior requerido por el grupo de pacientes en riesgo identificado se siguió según el conducto establecido por el sistema de salud.

Tabla 2 Resultados con prueba complementaria 

EAC: epitelio acetoblanco (se tomó biopsia); VDM: material insuficiente para diagnóstico.

Discusión

En el mundo, el tamizaje para la detección temprana de cáncer de cuello uterino se ha centrado recientemente en la necesidad de conocer si la infección está dada por algún virus de alto riesgo. Más recientemente se ha estudiado si el genoma de la célula hospedadora tiene alterados sus mecanismos de control. Dado que la infección viral es frecuente, se desea saber en cuáles casos el virus es de alto riesgo y cuándo ha alterado los mecanismos de regulación celular, convirtiéndose en amenaza de desarrollo de cáncer.

En Colombia, la determinación de HPV de alto riesgo se introdujo como prueba primaria de tamizaje; sin embargo, aún no se realiza de manera homogénea. Esta debería estar acompañada de CBL, la cual tiene la ventaja de permitir pruebas moleculares; no obstante, en nuestro medio esta prueba cuesta más del doble de la citología convencional. También persisten problemas en la calidad de la toma de la muestra, ya que pueden carecer de zona de transformación.

Dentro de los problemas postanalíticos está la falta de empoderamiento de algunas pacientes en la búsqueda del resultado del examen, la falta de coordinación de algunas instituciones prestadoras de servicios de salud en la búsqueda activa de pacientes con resultados positivos y de los laboratorios respecto a tener mecanismos para informar a los médicos tratantes y las pacientes de los resultados positivos para lesiones cervicales.

Al tender a un tamizaje más efectivo, en este trabajo se hizo una primera aproximación a la CBL con la aplicación de la doble tinción con biomarcador (inmunocitoquímica) para lesiones de alto grado. La ventaja de la prueba es que muestra lesiones de alto grado que no se han identificado como tales morfológicamente, lo que permite el diagnóstico temprano de la progresión a lesiones de alto riesgo.

Múltiples estudios resaltan las bondades de esta técnica. En el estudio de Wentzensen et al. (²⁰), basado en un proyecto piloto (2007-2008) con 425 mujeres que tenían prueba de Papanicolaou negativa, pero HPV positivo, se incluyó la tinción dual p16/Ki-67 con el objetivo de identificar casos de NIC-2 que fueron corroborados por biopsia. El estudio arrojó una sensibilidad del 91,9 % para detectar NIC-2 y del 96,4 % para NIC-3. La especificidad fue del 82,1 % para NIC-2 y del 76,9 % para NIC-3. El estudio concluyó que la citología con tinción dual doble puede identificar mujeres con una alta posibilidad de NIC-2 y puede complementar los programas de tamizaje para carcinoma de cuello uterino. En el estudio de Petry et al. (¹⁹), la sensibilidad y la especificidad en el grupo de ASC-US fue del 95 % y del 84 %, y para los casos de LSIL, del 100 % y del 81 %, respectivamente. Basados en los hallazgos, los autores del estudio concluyeron que el uso de un biomarcador permite la identificación de HSIL (¹⁸,¹⁹,²³,²⁶,³⁵,³⁶,³⁷). La precisión del test p16INK4a ha sido probada en citología con diagnóstico de ASC-US y LSIL (³⁸,³⁹).

La ventaja de esta técnica es que observó que la coexpresión de p16INK4a y Ki-67 solo ocurría en presencia de displasia (⁴⁰). Además, mejora la variabilidad intra- e interobservador, que se presenta en la evaluación de citologías cervicouterinas (¹⁶) y en la interpretación histopatológica (¹⁵,³⁶,⁴¹,⁴²,⁴³). La prueba es recomendada para diferenciar entre lesiones verdaderamente displásicas.

En el presente estudio, a pesar de ser una muestra pequeña, que está controlada por tamizaje con citología convencional, se hallaron casos positivos con la doble tinción (p16/Ki-67), lo que llevó a estudios posteriores con una segunda colposcopia y estudios histológicos. Pacientes con lesión de bajo grado, que no hubiesen sido dirigidas a estudios subsecuentes (colposcopia: biopsia o cepillado endocervical), gracias al resultado del biomarcador positivo que identificó la desregulación del ciclo celular y, por ende, el riesgo potencial de progresión de la infección a cáncer, fueron sometidas a exámenes adicionales. La inmunocitoquímica va dirigida a lesiones de alto grado no detectadas en la morfología de la citología de tamizaje, la cual se hubiese informado como ASC-US o LSIL.

Una de las limitaciones es tener una población cerrada con probablemente escasa exposición a factores de riesgo. Tampoco se contó, para todas las mujeres, con otra herramienta diagnóstica valiosa como es la prueba para DNA del HPV de alto riesgo. En un futuro, se requieren estudios con una población más representativa con respecto a factores de riesgo y en cuanto a número de participantes.

Los análisis específicos para HPV son muy importantes para el tamizaje, y son un complemento excepcional ante citologías vaginales anormales, así como lo serán en la monitorización de las generaciones venideras para el seguimiento de la eficacia vacunal. En casos como los expuestos, se detectaron lesiones premalignas, no por la presencia de un virus de alto riesgo, sino por la evidencia de la alteración en la regulación del ciclo celular, lo cual pone en la mira la vigilancia estrecha sobre estas pacientes.

Esta herramienta permite eliminar una vigilancia innecesaria ante infecciones ocasionadas por virus de alto riesgo que las pacientes iban a eliminar sin tratamiento, y también de lesiones citológicas de alto riesgo que iban a regresar espontáneamente. Con este tipo de pruebas, se puede optimizar la vigilancia epidemiológica, enfatizando donde esté el verdadero riesgo de progresión a cáncer.

Conclusión

El cáncer de cuello uterino continúa siendo un enemigo mundial para la salud de las mujeres. Las pruebas moleculares han ido complementando los programas de tamizaje y ayudando a comprender la infección y sus mecanismos de progresión a cáncer, tanto desde el punto de vista viral como desde el hospedador. Tenemos en nuestro medio esta primera experiencia en la implementación de p16/Ki-67 en CBL, que detectó mujeres cuyo manejo temprano cambió ante el resultado molecular, modificando lo que en otro momento hubiese sido la “historia natural de la enfermedad”. Con esta experiencia, se espera en un futuro poder realizar nuevas investigaciones que amplíen la experiencia de citólogos y patólogos con estas técnicas, acercando estas pruebas a la población en riesgo en nuestro país.