ADSORPTION STUDY OF PROTEINS ON SURFACES OF POLY-LACTIC ACID BY USING ELECTROCHEMICAL AND MICROGRAVIMETRIC TECHNIQUES

HUGO ARMANDO ESTUPIÑAN DURAN
D.r, Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, haestupinand@unal.edu.co

DARIO YESID PEÑA BALLESTEROS
Ph,.D, Universidad Industrial de Santander, dypena@uis.edu.co

DIONISIO ANTONIO LAVERDE CATAÑO
Dr., Universidad Industrial de Santander, dlaverde@uis.edu.co

CUSTODIO VÁSQUEZ QUINTERO
MSc, Universidad Industrial de Santander, custodio@uis.edu.co

YURLEY KARINA ANAYA
Ing. Química, Universidad Industrial de Santander, karina.anaya.jaimes@gmail.com

LEIDY MARCELA GELVES JEREZ
Ingeniera Química, Universidad Industrial de Santander, marcegelvez@hotmail.com

Recibido para revisar Enero 18 de 2011, aceptado Agosto 19 de 2011, versión final Agosto 24 de 2011

RESUMEN: Métodos electroquímicos fueron utilizados para promover y evaluar la adsorción orientada de albúmina y colágeno sobre superficies poliméricas de ácido poliláctico (PLA) mediante la aplicación de un sobrepotencial anódico en un rango de 0 V a 0,45 V. La adsorción fue estudiada usando mediciones simultáneas de espectroscopía de impedancia electroquímica (EIE) y microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), en un rango de temperaturas de 25°C a 45°C, con variaciones en proteína entre 5 y 20 µg/ml en solución buffer de fosfato de pH 7,4. Con el aumento de la concentración de proteínas en el electrolito, disminuye la resistencia a la transferencia de carga, exhibiendo así una mayor adsorción sobre la superficie, además de aumentar la magnitud de los cambios de masa. Se mejoró la hidrofilicidad del recubrimiento, mostrando una mayor afinidad con las soluciones de colágeno y por lo tanto un aumento en la biocompatibilidad debido a la activación superficial.

PALABRAS CLAVE: Adsorción, albúmina sérica bovina, colágeno, polímeros biodegradables, gravimétrica, electroquímica.

ABSTRACT: Electrochemical methods were used to promote and evaluate the oriented adsorption of albumin and collagen on polymer surfaces of polylactic acid by applying an anodic overpotential in the range of 0 V to 0.45 V. The adsorption was studied using simultaneous measurements of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and quartz crystal microbalance (QCM) in a temperature range of 25°C to 45°C, and protein variations between 5 and 20 mg/ml phosphate buffer solution of pH 7,4. Increasing protein concentration in the electrolyte reduces resistance to charge transfer associated with the interaction between protein and electrode, thus showing a greater adsorption on the surface, confirmed by the increased mass measured by QCM. With the electrochemical polarization, the hydrophilicity of PLA coating was improved, showing a higher affinity and adsorption capacity with collagen-rich solutions.

KEYWORDS: Adsorption, bovine serum albumin, collagen, polymers biodegradables, gravimetric, electrochemical.

1. INTRODUCCIÓN

La adsorción de proteínas juega un papel fundamental en la producción de implantes biocompatibles. La biocompatibilidad de los materiales depende en gran medida de las interacciones que ocurren entre la superficie y el ambiente biológico. Se sabe que el contacto de un cuerpo vivo con un material induce la adsorción de proteínas en su superficie, creando una interfase, en la que otras proteínas y células se adsorben [1]. Las propiedades de la monocapa adsorbida de proteína son de vital importancia en la integración del implante en el cuerpo. Dependiendo de la complejidad del tejido al que se va a implantar, se requieren ciertas características, un ejemplo claro son los huesos y los dientes, los cuales necesitan de una excelente adhesión orientada, de proteínas que permita el crecimiento, formación y estabilización del conjunto implante-hueso.

Cuando la proteína está en contacto con una superficie sólida, ésta esta última sufre ciertas modificaciones causadas por la adsorción que se lleva a cabo en dicha superficie [2]. Por otro lado, las propiedades de la superficie influyen en la adsorción de proteínas, siguiendo ciertas tendencias generales: i. La afinidad de la superficie es determinada por la hidrofilicidad [3,4]; ii. La disminución de la estabilidad de la proteína, aumenta la afinidad de la adsorción en la mayoría de las superficies [4,5]; iii. Las proteínas con cargas eléctricas opuestas a las de la superficie, se adsorben con mayor afinidad [6,7]; iv. Además la afinidad en la adsorción, depende de la ubicación de la carga superficial [8]; v. El tamaño y la forma de la proteína pueden desempeñar un papel importante en la adsorción, ya que el número de sitios de unión por proteína adsorbida se incrementan.

El colágeno es una proteína de la matriz extracelular, cuya estructura es la más grande del reino animal. La molécula de colágeno tipo l (largo ~ 30nm, diámetro ~ 1.5nm) es una hélice formada por tres polipéptidos. Las partes no helicoidales son llamadas telopéptidos, y se encuentran al final de cada molécula. El colágeno puede agregarse en forma de fibrillas, in situ e in vitro. Además contiene secuencias de aminoácidos, los cuales pueden ser reconocidos por células receptoras [9]. De esta manera debido a su forma, tamaño y su propiedad de autoadherencia, el colágeno ofrece perspectivas promisorias para crear una capa de adsorbato, con un direccionamiento deseado.

Como respuesta a los requerimientos direccionales de las proteínas para la formación de tejidos, se han implementado numerosas técnicas. Usando flujo, como la extrusión mecánica, canales microfluidilizados y por anisotropía química. Sin embargo, éstas han presentado inconvenientes en la densidad de formación, la elasticidad, y el tamaño final [14-19]. Por otro lado también se han orientado las fibras de proteína, utilizando campos magnéticos, los cuales requieren imanes superconductores, ya que el colágeno posee un valor bajo en la constante diamagnética [20]. La orientación por inmersión en soluciones concentradas y por electrospinning [21], son técnicas que pueden tardar de semanas a meses y además tienen una limitación muy importante, la utilización de solventes tóxicos y corrosivos [22]. Debido a estos problemas se ha presentado un enfoque alternativo, la manipulación electroquímica la cual puede disminuir el tiempo de proceso a minutos u horas, utilizando como variables claves, el voltaje y la corriente, con electrodos ubicados de manera paralela dentro de una solución de colágeno en una celda electroquímica, en donde al aplicarse un voltaje determinado se producirá el direccionamiento de la proteína [23].

En los últimos años se han desarrollado una serie de técnicas de activación superficial, para el desarrollo de dispositivos biomédicos que permiten la obtención de biomateriales sofisticados. Estas técnicas van desde la fotolitografía, ablación por láser, manchado, litografía por haz de electrones, nanolitografía de inmersión, hasta la activación por fuerzas magnéticas [24]. La fotolitografía implica la irradiación de una superficie con un haz de alta energía, por lo general de luz ultravioleta. La alteración superficial puede causar fotodisociación, rotura de enlaces químicos, el inicio de polimerización [25-27], produciéndose de esta forma superficies activas superficialmente en dos o tres dimensiones [28].

Utilizando dos técnicas como la técnica electroquímica denominada EIE (Espectroscopía de Impedancia Electroquímica) y la microbalanza de cuarzo QCM (Quartz Crystal Microbalance) se puede evaluar la adsorción direccionada de proteínas en la superficie. La EIE es una herramienta eficaz para estudiar los procesos de electrodos, utilizando una perturbación de carácter eléctrico, que superpone una señal de potencial sinusoidal de amplitud pequeña. Este método permite la medición de la capacitancia de la doble capa, de la interfase electrodo/solución, para generar modelos en forma de circuitos equivalentes que permiten obtener información de la película modificada en la superficie del electrodo [29-30]. La microbalanza de cuarzo QCM es una potente técnica para seguir la cinética de adsorción de diferentes sistemas, como los átomos, moléculas, proteínas o incluso de células vivas [37-38]. El fenómeno físico del sensor se basa en el efecto piezoeléctrico. En el cristal de cuarzo se produce una onda acústica que interacciona con el medio en contacto con el cristal. El tipo de interacción es generalmente caracterizada a través de desplazamientos de fase y amplitud (dependiente de la frecuencia). Siendo dichos desplazamientos función de la composición y propiedades del medio en contacto. La onda acústica se propaga en una pequeña distancia en el medio en contacto, de esta forma la respuesta está determinada predominantemente por las propiedades interfaciales.

En este trabajo se estudió la adsorción orientada electroquímicamente de colágeno y BSA, en superficies de PLA, activadas por irradiación con luz UV, haciendo un monitoreo en tiempo real de la adsorción mediante técnicas electroquímicas y microgravimétricas.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales
El PLA fue sintetizado por policondensación del Ácido L-láctico con Zn como catalizador. Este polímero fue disuelto en acetona a 15% p/v para realizar las electrodeposiciones. La solución salina amortiguada por fosfatos (PBS, pH 7,4) utilizada para la dilución de la proteína se preparó a partir de NaCl, Na2HPO4•2H2O), KCl, K2HPO4 y tamponado a un pH de 7,4. La albúmina bovina (BSA) 98% para electroforesis (Sigma A7906). El colágeno fue utilizado como polvo liofilizado (RSAD08I25201).

2.2 Obtención de PLA sobre cristal de cuarzo Au/Cr ]]> Para realizar el recubrimiento de los cristales de cuarzo con la solución de PLA en acetona al 15% p/v, se utilizó una fuente de poder para aplicar un voltaje de 3 Voltios, donde el cátodo fue conectado con el cristal de cuarzo de Au-Cr y el ánodo fue conectado a una lámina de acero, durante un tiempo de 5 minutos a condiciones estándar de presión y temperatura. Posteriormente se irradió, un área preferencial con espesor de 1mm y longitud 1in con luz UV ubicada en el centro del cristal durante 20 minutos.

2.3 QCM y mediciones electroquímicas de adsorción.
Se prepararon soluciones de proteínas en PBS a 5, 12.5 y 20 µg/ml. Para las mediciones electroquímicas y de la QCM simultáneas se utilizó una celda plana horizontal, en donde el electrodo de trabajo era el cristal recubierto, contra-electrodo de grafito, un electrodo de referencia Ag-AgCl. Las mediciones electroquímicas se realizaron usando un potenciostato GAMRY y las mediciones de la QCM se realizaron con una microbalanza QCM200. Las mediciones de espectroscopía de impedancia fueron desarrolladas en un rango de frecuencia de 0.01 a 100000 Hz a un voltaje natural de 0V y 0.15, 0.30 y 0.45 V de polarización y 10mV de potencial respecto al electrodo de referencia. La calibración de la QCM se realizó previa la adición de la solución de trabajo.

2.4 Análisis de resultados
De las pruebas electroquímicas se obtuvieron los parámetros eléctricos del modelo de circuito equivalente usando el software Zview, con la resistencia a la transferencia de carga se calculó la masa adsorbida en la superficie. Estos datos se contrastaron con los proporcionados por microbalanza de masa adsorbida. Se realizaron gráficas de concentración de proteína contra masa adsorbida para obtener los parámetros de adsorción en el equilibrio y gráficas de cambio de energía libre de Gibbs contra temperatura para obtener parámetros termodinámicos de adsorción. Se analizó la morfología de los recubrimientos antes y después del proceso de adsorción de las proteínas, mostrando la adsorción sobre el recubrimiento de PLA más direccionada, con el colágeno, respecto a la adsorción de la proteína BSA en las áreas superficialmente activadas.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Absorción de BSA y colágeno sobre PLA por la técnica electroquímica de EIE
La figura 1, muestra el espectro para la adsorción, obtenida de solución para BSA de 20 µg/ml a 45°C, similares espectros fueron obtenidos con las soluciones restantes. La presentación de los datos en forma de diagrama de Bode, revela claramente la presencia de dos constantes de tiempo (cambios de pendiente), una a alta y otra a baja frecuencias, la última evidencia la formación de una doble capa electroquímica. Por lo tanto, se puede representar el fenómeno con un circuito eléctrico equivalente similar al de un material con recubrimiento poroso, como se muestra en la figura 1 b.

]]> Figura 1. Espectro para la adsorción de solución para BSA de 20 µg/ml a 45°C, a) Diagrama de Bode y b) Diagrama de Nyquist.

En este circuito los elementos eléctricos corresponden a: Rs es la resistencia del electrolito (PBS + proteína) entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, R1 es la resistencia de los procesos Faradaicos y al igual que la capacitancia representada como un elemento de fase constante a altas frecuencias CPE1, R2 = Rct es la resistencia a la transferencia de carga y CPE2 es la capacitancia de la doble capa eléctrica en la interface polímero-solución de proteínas, que se evidencia a bajas frecuencias.

Se empleó un elemento de fase constante CPE dependiente de la frecuencia por una capacitancia pura (C). El uso de CPE es necesario debido a una distribución de los tiempos de relajación como consecuencia de las heterogeneidades presentes en el nivel microscópico de la interfaz. Rct se define como una intersección de una curva extrapolada EIE en un diagrama de Nyquist con el eje real. La resistencia a la transferencia de carga, puede ser utilizada como una medida de la velocidad de reacción y de la cantidad de proteína adsorbida en la superficie. El inverso de la resistencia a la transferencia de carga R-1ct, es directamente proporcional a la cantidad de proteína adsorbida, Γ (molcm−2) y a la densidad de carga superficial, QADS(Ccm−2), como se muestra en la ecuación 1.

F es la constante de Faraday y n es el número de electrones transferidos. Se asume n=1 para los cálculos con las dos proteínas.

La ecuación de Langmuir (ecuación 2) expresa la relación entre la concentración de la proteína, y la cantidad de material adsorbido en la superficie, con esta ecuación se puede encontrar el parámetro de adsorción llamado B_ADS coeficiente de adsorción y G_máx que representa la máxima cantidad de material que se puede adsorber en la superficie. El B_ADS se relaciona con la afinidad de la proteína a ser adsorbida en la superficie del electrodo a una temperatura, por lo tanto, se puede obtener la energía libre de adsorción, utilizando la ecuación 3 [32-34].

Los resultados obtenidos mostraron que la adsorción de proteínas (BSA y Colágeno) es espontánea a las diferentes temperaturas, es decir, la energía libre de Gibbs disminuye como tal, los eventos naturales y espontáneos tienden a llevar los cuerpos a su menor estado energético, los datos calculados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Cálculos termodinámicos a partir de datos electroquímicos ]]>

Resultado que concuerda con otros estudios termodinámicos de adsorción de proteínas [31-32]. En la tabla 1 también se observa la influencia de la irradiación con luz UV, como una activación superficial, donde la energía de Gibbs presentó un valor superior a una misma temperatura.

3.2 Resultados de microbalanza de cristal de cuarzo (QCM)
La figura 2 muestra la adsorción a partir de una solución de 20ug/ml BSA a 37°C en el cambio de frecuencia vs tiempo, obtenida por QCM. Similares curvas fueron obtenidas para todas las concentraciones y con el colágeno, mostrando una disminución de la frecuencia a concentraciones más bajas. A partir de estas curvas, se calculó la cantidad de proteína adsorbida en la superficie del PLA usando la ecuación de Sauerbrey (ecuación 4).

Figura 2. Espectro de cambio de frecuencia con respecto al tiempo para BSA a 37°C y 20µg/ml.

En solución acuosa, la ecuación de Sauerbrey no es usada por los efectos de viscosidad, densidad y conductividad [34-36]. Sin embargo, describe muy bien el comportamiento cuando los cambios viscoelásticos del material son despreciables, lo cual es válido en este caso de estudio, debido a los bajos tiempos de exposición con el medio acuoso, asumidos, porque el polímero presenta una degradación que incide en el cambio de sus propiedades.

Se observó una relación lineal entre el cambio de masa y frecuencia de la QCM en aire y en solución acuosa. Con base en los cambios de frecuencia en el estado de equilibrio de adsorción, se calculó la cantidad de proteína adsorbida en el recubrimiento de PLA Dm [µg/cm2]. Los datos de la QCM obtenidos simultáneamente con los electroquímicos, pueden ser relacionados usando la isoterma de adsorción de Langmuir (ecuación 5). En donde el cambio específico de masa Dm [ug/cm²] se sustituye por Γ, que representa la cantidad de proteína adsorbida por unidad de área.

Tabla 2. Datos calculados a partir de la curva de cambio de energía libre de Gibbs contra la temperatura.

GDH: diferencia del cambio de entalpía (J/mol): energía final menos energía inicial.
DS: diferencia del cambio de entropía (J/moloK): entropía final menos entropía inicial.

3.1 Discusión final
Las propiedades termodinámicas de adsorción a partir de las mediciones de EIE y de QCM fueron comparadas. Un aumento en el DG corrobora la hipótesis planteada de la activación en el PLA al ser irradiado con luz ultravioleta a una misma temperatura.

Los valores obtenidos de entalpía y entropía concuerdan con la literatura, mostrando un proceso endotérmico, resultado de las siguientes contribuciones: cambios en el estado de hidratación de la superficie, asociación/disociación de protones de grupos cargados en la superficie, a la superposición de campos eléctricos, debidos a los voltajes aplicados, a la incorporación de otros iones diferentes a protones en la superficie adsorbida y finalmente a la reacomodación de la moléculas de las proteína, dando como resultado un proceso de adsorción espontáneo. Sharon G. Roscoe y colaboradores encontraron que la entalpía de adsorción es debida a algunos aspectos del proceso, como desplazamiento del solvente en la superficie del electrodo y a los cambios en la tensión superficial por el estado de hidratación de las proteínas en adición a sus cambios estructurales. Los grandes valores de la entropía se deben a la gran dispersión de proteína en la superficie, favoreciendo la adsorción [32,39-42].

Tal como se observa en la figura 3, la adsorción de proteína sobre la superficie polimérica de PLA se llevó a cabo mostrando una zona de mayor adsorción de proteína (parte superior figura 3.b), como resultado de la activación superficial.

]]> Figura 3. Micrografías de la superficie a 10X a) cristal recubierto con PLA, b) cristal con BSA adsorbida de una solución de 20µg/ml en recubrimiento polimérico y c) cristal con Colágeno adsorbido de una solución de 5µg/ml en recubrimiento polimérico.

4. CONCLUSIONES

Las mediciones simultaneas de espectroscopía de impedancia electroquímica y en microbalanza de cristal de cuarzo, permitió establecer que el proceso de adsorción fue descrito por la isoterma de Langmuir. A partir de las micrografías, se evidencia que el colágeno adsorbido tuvo un mayor direccionamiento sobre la superficie polimérica activada, debido probablemente a su forma helicoidal la cual permite una mejor acomodación e interacción que la BSA, que posee una forma esférica.

La tendencia observada de los valores de energía de Gibbs de adsorción, muestran que las moléculas de proteína con menor peso molecular (BSA) tienen mayor afinidad con la superficie.

La hidrofilicidad del PLA, en contacto con las soluciones que contienen colágeno, aumenta al activar la superficie de material con un sobrepotencial, o por irradiación con luz ultra violeta, debido al aumento en la energía libre de Gibbs, que es directamente proporcional a la tensión superficial, evidenciando una mejora en la hidrofilicidad y en la biocompatibilidad.

5. AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a Colciencias, proyecto 1102-403-20771 y a la VIE-UIS, proyecto 5433, por el financiamiento de esta investigación.

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